基因工程菌株筑波链霉菌l20及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物工程领域，设及微生物制药领域中的基因工程菌株筑波链霉菌L20 及其应用。
【背景技术】
[0002] 他克莫司（Tacrolimus)又名FK506,是从链霉菌属（別化/7扣曲乃6>6〇中分离出的发 酵产物，其化学结构属23元大环内醋类抗生素。具有很强的免疫抑制剂活性和抗真菌活 性，在临床上主要是用于治疗器官移植后的免疫排斥反应和治疗皮肤炎症等。作为一种强 力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2a-2)的释放，全面抑制T淋己细胞的作用， 较环抱素（CsA)强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国 家上市。临床实验表明，其化。、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治 疗特应性皮炎（AD)、系统性红斑狼疮（SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥 着积极的作用。
[0003] 现在发现生产他克莫司的链霉菌有很多，有些遗传性状和发酵单位较稳定，培养 和发酵条件适合于工业化生产，但是菌株的发酵单位较低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基因工程菌株筑波链霉菌L20,所述菌株命名为筑波链 霉菌L20(沉化如〇曲乃65f沉/如Ase化Jis120)，与中国发明专利（CN200810019003. 4)中链霉 菌YN06-1593相比，他克莫司产量提高了 30%。该菌保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、(简称CGMCC)，保藏日：2015年8月19日，保藏号：CGMCCNo. 11252， 保藏地址：北京市朝阳市北辰西路1号院3号。
[0005] 所述的筑波链霉菌L20菌株具有较高拷贝数的SEQ ID NO 1的核巧酸序列，该核 巧酸序列编码一个憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶，是他克莫司生物合成途径中的限速酶。在 基因工程菌株筑波链霉菌L20中，将该限速酶编码基因进行高表达。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述筑波链霉菌L20在他克莫司生物合成中的 应用。该菌株连续多次在斜面培养基传代，经种子培养基和发酵培养基进行发酵实 验验证，通过高效液相色谱测定菌丝和发酵液中他克莫司的产量，并与中国发明专利 (CN200810019003. 4)中链霉菌YN06-1593进行比较，其他克莫司产量提高了 30%。结果显 示L20的遗传性状稳定，他克莫司发酵单位可达到716mg/L。
[0007] 本发明提供的一种基因工程菌株筑波链霉菌L20,通过W下培养步骤获得他克莫 司： (1) 固体培养：把筑波链霉菌L20接种于ISP4固体培养基中，于28°C培养箱中培养7 天； (2) 液体培养：固体培养后，将菌丝体接种于种子培养基中，在28°C摇床上培养2地， 250rpm，种子培养基24h后接种至发酵培养基中，接种量10%，在28°C摇床上发酵培养96h 后分析检测他克莫司。
[0008] 所述的ISP4固体培养基为：淀粉1%，憐酸氨二钟0. 1%，硫酸儀0. 1%，碳酸巧0. 2%， 硫酸锭0.1%，琼脂2%，所述百分含量均为质量百分含量。
[0009] 所述的种子培养基为：甘油1%，糊精1%，黄豆饼粉4. 0%，碳酸巧0. 2%，其余为水，pH 6.8,所述百分含量均为质量百分含量。
[0010] 所述的发酵培养基为：糊精5%，酵母粉1%，棉巧饼粉3%，K2HPO40. 2%，碳酸巧0. 2%， 其余为水，pH6.8,所述百分含量均为质量百分含量。
[0011] 本发明利用生物信息学和体外生化反应鉴定出所筛选获得筑波链霉菌中他克莫 司生物合成途径中的限速步骤和限速酶，通过基因工程技术提高某些限速酶基因的表达量 获得了一系列突变株，从突变株中筛选出他克莫司的发酵单位提高的基因工程菌株筑波链 霉菌L20。
[0012] 本发明提供的菌株遗传性状和发酵单位较稳定，培养和发酵条件适合于工业化生 产，发酵单位高。本发明菌株通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的限速酶的表达 量，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶W提高他克莫司的产量，W降低工业 化生产过程的成本，将他克莫司的发酵单位提高至716mg/L。本发明通过基因改造他克莫 司生物合成途径中的限速酶获得的，其他克莫司产量比中国发明专利（CN200810019003.4) 中链霉菌YN06-1593提高了 30〇/〇。
【附图说明】
[0013] 图1是筑波链霉菌L20菌丝及抱子扫描电镜图。
[0014] 图2是筑波链霉菌L20在发酵过程中他克莫司产量。
【具体实施方式】
[0015] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0016] 实施例中所使用的培养基： 1、ISP4固体培养基：淀粉1%，憐酸氨二钟0. 1%，硫酸儀0. 1%，碳酸巧0. 2%，硫酸锭0.1%，琼脂2%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。
[0017] 2、种子培养基：甘油1%，糊精1%，黄豆饼粉4%，碳酸巧0. 2%，其余为水，pH6.8,所 述百分含量均为质量百分含量。
[001引 3、发酵培养基：糊精5%，酵母粉1%，棉巧饼粉3%，K2HPO40. 2%，碳酸巧0. 2%，其余 为水，pH6.8,所述百分含量均为质量百分含量。
[0019] 4、LB培养基：蛋白腺1%，酵母提取物0. 5%，氯化钢1%，其余为水，所述百分含量均 为质量百分含量。
[0020] 5、2XYT培养基：蛋白腺1.6%，酵母提取物1%，氯化钢0. 5%，其余为水，所述百分含 量均为质量百分含量。
[0021] 实施例1筑波链霉菌L20的获得 把SEQIDNO1的DNA序列分别用聚合酶链式反应（PCR)扩增，扩增后的DNA片段通 过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒PIJ8660中，再将含有上述DNA序列的质粒转化 到大肠杆菌ET12567 (已含有质粒PUZ8002)之中。
[0022] 将含有上述质粒的大肠杆菌ET12567 (已含有质粒PUZ8002)分别接种到40mlLB 液体培养基(含相应抗生素）中，37 °C培养至ODe。。为0.6,离屯、收集菌体，用10mlLB液体 培养基洗涂一次，用0.5ml的2XYT液体培养基重悬；将20 所筛选得到的筑波链霉菌 抱子加入0. 5ml的2XYT液体培养基中重悬，45 °C热休克10min后冰浴冷却2min;分 别将上述的大肠杆菌和筑波链霉菌的抱子混合后均匀涂在ISP4固体培养基上，30 °C培养 16小时后，加入20yg/ml的糞晚酸和相应的抗生素，30 °C继续培养10天；分别将上述得 到的链霉菌转化子在含有相应抗生素的斜面培养基上培养10天后收取抱子，通过PCR方法 确证目标DNA序列已经融合在筛选所得筑波链霉菌的基因组之中得到筑波链霉菌L20。所 述菌命名为筑波链霉菌L20 (沉k心i/AaeasisL20)，该菌保藏单位：中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC)，保藏日：2015年8月19日，保藏号： CGMCCNo. 11252O
[0023] 实施例2 筑波链霉菌L20的菌体形态特征 筑波链霉菌L20在ISP4固体培养基培养7天，基内菌丝和气生菌丝发育良好，抱子丝 柔曲或弯曲，成熟的抱子链抱子个数在10个W上，抱子呈短棒状(详见图1)。在ISP4固体 培养基中的表观特征，结果见表1。
[0024]
实施例3 筑波链霉菌L20的发酵验证 将20y1筑波链霉菌L20抱子接种到种子培养基中，转速250rpm，28 °C培养24小 时；按10 %的接种量将种子培养基中的菌丝体接种至发酵培养基中，转速250rpm，28°C 培养120小时，在培养24、48、72、96、120小时后分别取样测定他克莫司产量。
[00巧]实施例4 筑波链霉菌L20他克莫司产量的验证 将他克莫司标准品用甲醇配成一定浓度的溶液，通过高效液相色谱检测他克莫司的产 量，建立他克莫司浓度一一峰面积两者之间的标准曲线；取1ml发酵培养基发酵液，加入 1ml甲醇，剧烈满旋震荡5min后，离屯、取上清，通过高效液相色谱检测他克莫司的含量， 根据标准曲线得到他克莫司的浓度。筑波链霉菌L20在发酵9化时他克莫司产量达到最大 (716mg/L)，结果见图2。
【主权项】
1. 一株基因工程菌株筑波链霉菌，其特征在于：所述筑波链霉菌命名为筑波链霉菌 L20，英文名称为L20，该菌保藏单位：中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏日：2015年8月19日，保藏号：CGMCC No. 11252。2. 根据权利要求1所述的一株基因工程菌株筑波链霉菌，其特征在于，该菌株具有高 拷贝数的SEQ ID NO 1的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移 酶，是他克莫司生物合成途径中的限速酶。3. 根据权利要求1所述的一株基因工程菌株筑波链霉菌L20在他克莫司生物合成中的 应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) 固体培养：把筑波链霉菌L20的菌株接种于ISP4固体培养基中，于28°C培养箱中 培养7天； (2) 液体培养：固体培养后，将菌丝体接种于种子培养基中，在28°C摇床上培养24h， 250rpm，种子培养基24h后接种至发酵培养基中，接种量10%，在28°C摇床上发酵培养96h 后分析检测他克莫司。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（1)所述的ISP4固体培养基为：淀 粉1%，磷酸氢二钾0. 1%，硫酸镁0. 1%，碳酸钙0. 2%，硫酸铵0. 1%，琼脂2%，其余为水，所述 百分含量均为质量百分含量；步骤（2)所述的种子培养基为：甘油1%，糊精1%，黄豆饼粉 4. 0%，碳酸钙0. 2%，其余为水，pH 6. 8,所述百分含量均为质量百分含量；所述的发酵培养 基为：糊精5%，酵母粉1%，棉籽饼粉3%，K2HPO 4 0. 2%，碳酸钙0. 2%，其余为水，pH 6. 8,所述 百分含量均为质量百分含量。
【专利摘要】本发明提供一种基因工程菌株筑波链霉菌L20（<i>Streptomyces</i><i>？tsukubaensis</i>？L20），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2015年8月19日，保藏号：CGMCC？No.11252。本发明提供的菌株遗传性状和发酵单位较稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产，发酵单位高。本发明菌株通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的限速酶的表达量，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，以降低工业化生产过程的成本，可提高30%他克莫司的发酵单位。CGMCC No.1125220150819
【IPC分类】C12R1/465, C12P17/18, C12N1/21
【公开号】CN105154382
【申请号】CN201510664086
【发明人】李永泉, 王月月, 江辉, 张小晟, 骆红豆
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月15日