专利名称：辣椒CaWRKY40基因在烟草耐高温基因工程中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辣椒CaWRKY40基因及其超表达载体的构建及在基因工程中的应用，更具体地涉及到了该辣椒超表达载体在茄科植物烟草耐高温基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
植物在其生长、发育过程中不可避免地遭受病虫、极端温度、干旱等生物和非生物逆境胁迫，在逆境胁迫下被诱导产生抗逆反应是植物在长期的进化过程中所形成的经济有效的抗逆机制，包括关闭其它抗逆途径、适当减少用于生长和发育的物质和能量、抗逆反应的负反馈调节使有限的物质和能量在逆境胁迫期间尽可能地应用到相关的抗逆反应，并使抗逆反应强度不至于太大以减少物质和能量的浪费和对自身的伤害，这种特定抗逆途径的启动、另一些抗逆途径及生长的关闭都是通过复杂的信号传递网络实现的。因此，信号网络的剖析是阐明植物抗逆分子机制的重要途径。研究表明，Ca2+信使、植物激素(SA、JA、ABA、 乙烯、油菜素内酯等)、蛋白磷酸化、激酶、转录因子等组成了应答逆境的各种信号通路，它们彼此相互作用，构成信号网络，最终使细胞核内的基因发生逆境、细胞、组织特异性的表达调整，调节植物生长并提高植物对逆境抗性。作为整合逆境信号从细胞质传递进入细胞核并调节相关基因表达转录因子，其在植物抗逆分子机制的阐释及抗逆基因工程中的作用近年来受到了人们的高度重视，研究表明，WRKY、ATAFU MYB, AP2/ERF、CAERFU AREB, DREB 等参与了植物对逆境胁迫诱导抗性的调控，这些转录因子在转基因植株中的超表达可显著改善植物对特定逆境的抗性。因此，植物应答逆境的转录因子的分离、功能鉴定及其在植物抗逆基因工程中的应用已经成了当前国际生物学界十分活跃的研究领域。辣椒是一种重要的蔬菜和工业原料作物，近年其播种面积居在蔬菜中仅次于大白菜居第二位，而其产值则居所有蔬菜之冠。辣椒生产是我国当前种植结构调整，农业增效和农民增收的重要选择然而，辣椒又十分忌连作，是土传病害较多、发病较为严重的茄科植物，且对高温、高湿敏感(高志奎.辣椒优质丰产栽培原理与技术[M].北京中国农业出版社，2002. 19 20.)，培育和推广应用抗病及抗逆的辣椒品种并采取相应的栽培管理技术是解决辣椒病害及逆境危害的根本技术措施，揭示辣椒等茄科植物抗病及抗逆分子机制是有效开展辣椒抗逆遗传改良的重要基础，转录因子结构和功能鉴定则不仅有利于揭示辣椒等茄科植物抗病获抗逆分子机制，还可为辣椒等作物抗逆遗传改良提供有应用价值的基因。WKRY是一类植物特有的转录因子家族，在拟南芥中已发现74个成员，水稻含有 100多个成员，这些WRKY蛋白均含有由1到2个保守的WRKY功能域，由WRKYGQK序列和调节WRKY蛋白与DNA结合特性的CX4-7 -CX23-28 -HX1_2-(H/C)类锌指域所构成。根据所含WRKY保守域的数目，WRKY蛋白可分为3种类型，它们均可识别和结合靶基因启动子上的 W盒(C/T)TGAC(T/C)并一定程度受到其侧翼序列的影响，调节靶基因的表达。WRKY参与衰老、发育、休眠以及植物对环境胁迫的应答等生物学过程，迄今大量关于WRKY功能的研究报道主要集中在植物对病原菌、昆虫等生物逆境以及干旱、盐胁迫、高温、重金属胁迫、机械损伤、UV-B等非生物逆境胁迫应答和抗性中的作用。例如，拟南芥WRKY70和WRKY72不仅参与了植物对病原菌的基础抗性(PTI)，还参与了 R基因介导的基因对基因专一性抗性(ETI) 水稻0sWRKY03、OsffRKYl3, WRKY45、0sffRKY71等基因超表达可提高对病原菌抗性。WRKY家族蛋白调控生物性状的机制十分复杂，部分成员表现出功能特异性和多样性，对同一种性状起正调节或负调节等不同的作用；部分成员中一个WRKY蛋白可调节另一个WRKY基因的表达，或若干个WRKY蛋白协同作用，构成复杂的WRKY调节网络而表现出一定的功能冗余； 部分成员在植物应答不同生物逆境、非生物逆境甚至不同的生物逆境和非生物逆境的信号 crosstalk中充当重要的节点，表现出对多种逆境胁迫的应答和抗性。由于生物进化环境和途径的多样性，不同植物的WRKY家族成员的功能和作用机制、WRKY信号网络以及在多种应答不同逆境的信号crosstalk中的作用机制可能都有其特异性。然而，迄今大量有关WRKY 结构、功能和作用机制的研究多数集中在水稻、拟南芥等少数模式植物中的部分成员，对于大多数植物中WRKY家族的复杂作用机制还有待深入研究。
发明内容
本发现提供了一种辣椒6 / ^ 基因在烟草耐高温基因工程中的应用，将大力促进烟草耐高温基因工程的发展与应用。本发明的辣CaWRKY40基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。构建方法如下
将辣椒CaWRKY40基因与CaMV35S启动子核心序列融合，构建成CaWRKY40的超表达载体。所述的CaMV35S启动子核心序列为CGACCGCAAG
ACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。所述辣椒 CaWRKY40 基因是从 UV-B 辐射辣椒叶片的cDNA文库中分离获得的CaWRKY40基因。构建的超表达载体在茄科植物烟草耐高温基因工程中的应用。将所述超表达载体 ^itAgrobacterium tumefaciens EHA105农杆菌，采用叶盘遗传转化法侵染烟草得到转基因烟草，结果证明提高了该转基因对烟草的耐高温性，尤其是在42°C高温下。本发明从辣椒UV-B处理下的cDNA文库中分离获得一个WRKY家族成员的全长
，其表达产物定位于细胞核，可与W盒结合，表现出WRKY蛋白的典型特征。 该基因在烟草中超表达可显著提高转基因烟草对高温的耐性，表明6 / ^ 在植物应答高温信号传递中起着重要的调节作用。本发明的显著优点
本发明的辣椒6 / ^ 基因在烟草中的超表达与野生型烟草相比显著提高转基因烟草的耐高温能力，该基因在植物耐高温基因工程中具有十分重要的应用价值。
图1为CaWRKY40蛋白保守域分析； 图2为CaWRKY40推定蛋白的疏水轮廓；
图3为CaWRKY40在洋葱表皮上的亚细胞定位； 图4为pBT 10-GUS质粒图谱；图5为CaWRKY40与W盒的瞬间表达分析； 图6为CaWRKY40在高温胁迫下的表达情况； 图7为CaWRKY40在转基因烟草中超表达对高温胁迫的耐性。
具体实施例方式1载体构建过程 1. 1材料
辣椒品种为江西省莲花县的地方辣椒品种120#，由福建农林大学生命科学学院实验室保存；烤烟品种品种由福建农林大学病毒所惠赠；UV-B处理的辣椒叶片的cDNA文库 (UV-B紫外线处理将植株置于离紫外灯(UV-B)下25cm处照射2h.6hU2h.24h和48h， 所有不同处理时间段处理的植物用液氮进行速冻处理后放入一 80°C冰箱保存)为福建农林大学生命科学学院实验室构建(根据^witrogen公司试剂盒上的说明操作)，滴度高达 IXlO7 ； CloneMiner cDNA Library Construction Kit 和 Gateway 载体构建试剂盒均购自美国^witrogen公司。B型质粒小量快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，PCR相关dNTP、Taq酶、PCR buffer购自大连TaKaRa公司产品，反转录及 Real-Time PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。庆大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素等为Sigma公司产品。其它化学试剂均为国产化学纯。1.2 方法
1. 2. 1辣椒CaWRKY40候选基因的分离
以拟南芥的WRKY蛋白的氨基酸序列为探针，搜索获得辣椒相关EST，通过对辣椒EST进行拼接，根据共有序列来设计、合成特异性引物，引物序列为Pl 5，-GCTCAAGTGATGAAGAGTC-3，；P2 :5，-AATGGTTGGTCCTGAAGG-3，。然后采用基于 PCR 技术的 96孔板法从cDNA文库中筛选cDNA阳性克隆，测序结果表明，该cDNA阳性克隆的长度为 1431bp，其开放阅读框长1086bp，推测编码一个含361氨基酸(aa)、分子量39. 6 kDa、等电点(pi) 8. 12的蛋白质，第168到234氨基酸序列之间是WRKY的保守区域(见图1)，C端有一个C^2锌指结构，将该cDNA阳性克隆命名为CaWRKY40基因。在NCBI网站对CaWRKY40基因的氨基酸进行Bla^p同源序列搜索，可以发现该基因与其它不同植物已经报道的WRKY基因的氨基酸序列有很大的同源性，与烟草、Nicotiana tabacum)WIZZ 的同源性最高 80%,与西芹 iPetroselinum crispum) transcription factor WRKY4 (gb | AAG35658. 11AF204925J 的同源性为 52%，与葡萄 iyitis aestivalis)\>\itatiYe WRKY4 transcription factor(AAR37421. 1)的同源性为 5396，与大豆〈Glycine WRKY27 (ABC26917. 1)的同源性为 48%，与矮橡树{Larrea tridentata) WRKY transcription factor 21 (AAW30662. 1)的同源性为 47%。与 CaWRKY40 失系級近的WRKY蛋白的比对分析结果，可以看出保守性主要体现在WRKY结构域。疏水性分析发现 CaWRKY40的C端的少部分区域和中间大部分区域的疏水性较强，小部分区域的亲水性较强 (图 2)。1.2.2辣椒CaWRKY40基因超表达载体构建
本发明应用gateway技术(Walhout et al.，2000)构建双子叶植物转基因用超表达载体。首先根据gateway载体构建技术设计并合成内侧特异引物WRKY40F 5-AAAAAGCAGGCTTATGGAATTTACCAGTTTGGTTGA-3 ；WRKY40R5-AGAAAGCTGGGTCT TACCATCTGCCCGTCTGA-3(第一轮)和外侧接头引物aiiBl 5，_G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T -3，；aiiB2 5，-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT -3，(第二轮)。然后根据添加aiiB接头的两轮PCR扩增程序，在6 / ^ 基因两侧添加attB接头， 两轮PCR扩增程序程序如下
第一轮为了充分得到添加^iB接头的PCR产物，在50μ1 PCR反应体系中内侧特异引物每种最多只能添加10 pmoles，扩增参数为 预变性 2min 95° C 1 cycle 变性 15 s 94° C 退火 30s 55° C 延伸 1 min 68° C 10 cycles 第二轮转移第一轮PCR产物10 μ 1至含有40pmoles aiiBl和aiiB2外侧接头引物的40ylPCR混合液中，连续使用先低温度退火再高温特异退火的两套扩增参数为 预变性 Imin95° C 1 cycle
变性 15 s94° C
退火 30 s45° C
延伸 1 min68° C 5 cycles
变性 15 s94° C
退火 30 s55° C
延伸 1 min68° C 15-20 cycles
琼脂糖凝胶电泳检测条带质量并胶回收纯化aiiB-PCR产物。然后通过BP反应体系将目的基因(纯化的WiB-PCR产物)克隆到入门载体 PD0NR207上形成入门克隆，pD0NR207-R0P,测序检测目的基因序列无误后，再通过LR反应体系将目的基因克隆转移到超表达载体PMDC32，这样也就将目的基因克隆于Ti质粒的 CaMV35S启动子下游，形成含目的基因的超表达载体，可实现其在转基因植株内的超表达， 最后参照分子克隆指南将含目的基因的超表达载体进一步转化EHA105农杆菌，以备用于烟草遗传转化。BP反应体系
PCR products100 ng
Vector (pD0NR207)30-50 ng
5X Buffer1 μ 1
BP enzyme mix0. 3 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C温浴过夜，反应结束后加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，将反应产物转化DH5 α感受态细胞。LR反应体系
Entry clone50-100 ng
Destination vector100 ngLR Enzyme mix0. 5 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C温浴过夜，反应结束后加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，将反应产物转化DH5a感受态细胞。 1.2.3辣椒CaWRKY40基因亚细胞定位
首选用EcoRI/ BamHI和Smal/BamHI这两对限制性内切酶酶切载体pEGAD，回收大片段连接。同时以连接在T载体上经过测序的质粒为模板，用引物扩增(WRKY40-GFPF:5-CGGAAT TCATGATGGAATTTACCAGTTTGGTTGA-3 EcoRI, WRKY40-GFPR:5-CGGGATCCTTACCATCTGCCCGTCTG A-3 ^>wm)CaWRKY40的完整编码序列，同样用EcoRI/ BamHI和Smal/BamHI双酶切后插入到酶切回收的PEGAD载体上，构建融合载体并通过PCR和酶切鉴定并测序验证。鉴定成功的重组质粒用基因枪轰击洋葱表皮细胞，导入洋葱表皮后，将平板放入组培室避光培养对-36 h，使质粒编码的GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内充分表达。然后将洋葱表皮置于双蒸水中浸泡，再用0.45 mol/L甘露醇(用双蒸水配制)处理1. 5 h，直至细胞发生质壁分离，随后在德国产Olimpus荧光显微镜上进行观察，观察条件为蓝色激发光， 并进行图象采集。从结果中可看出融合蛋白定位于细胞核中，从荧光显微镜下观察到绿光 (见图3)，说明这些基因与预测的结果相符，初步说明他们具有转录因子的特征。
1.2.4 CaWRKY40基因与W盒结合特性分析
植物中的WRKY蛋白被证实能与拥有核心序列TGAC或其互补序列GTCA的W盒元件结合 (Rushton et ah 1996) 0 WRKY蛋白与W盒元件结合己被许多体外和体内的实验所证实。瞬间表达分析是是一种较为简便的方法，外源遗传物质导入植物细胞内之后，作为一种基因组外的遗传物质在一定时间内(降解之前)产生瞬间表达，并在转化细胞内积累表达产物。 我们在应用Gateway载体构建技术构建报告载体和效应载体的基础上，应用瞬间表达分析技术对已分离的辣椒WRKY基因进行功能的初步鉴定，为后续研究奠定基础。委托上海博亚生物技术公司合成下列顺式作用元件(斜体部分为核心序列)单链， 两端带有BamHI和)(baI酶切位点粘性末端，使正反链退火合成的双链两侧分别带有BamHI 和)(bal两个限制性酶切位点粘性末端。正义链5-GATCCTTATTCAGCCATCAAAAGT7i^O:AATA ATTTATTCAGCCATCAAAAGT7^CCAATAATT-3 ；反义链3-GAATAAGTCGGTAGTTTTCMC7^GT
TATTAAATAAGTCGGTAGTTTTCM^GTTATTAAGATC-5,
将等量的单链寡核苷酸溶解在50mM的NaCl溶液中，置于70°C 5min后，自然冷却到室温(30min)即可将单链合成双链DNA。提取ρΒΤΙΟ-GUS质粒(图4)，并用BamHI和)(baI两个限制性酶进行酶切，将酶切回收的大片段与2W盒顺式作用元件的核苷酸双链DNA用T4 DNA连接酶连接，连接产物即PBT10-2W-GUS，转化大肠杆菌DH-5a，根据载体序列设计一对引物A1A2 正义链 5' AGCGAGGAAGCGGAAGAGC3 ‘，反义链5' GGACACCCGTAAGTCAGAC3 ‘，扩增片断长度约为 300bp，筛选阳性单克隆并经此引物PCR，测序鉴定(参照第二章操作)。1.2.5效应载体的构建(见1.2.2) 1. 2. 6 瞬间表达
质粒构建完成后用基因枪(Bio-Rad PDS-1000/He)轰击洋葱鳞片内表皮细胞，验证质粒的功能，设置PBT10-2W-GUS单质粒转化为阴性对照。过程包括(1)样品制备将Iug/ul 质粒 DNA 各 1 μ 1 与 25 μ 1 钨粉(1. 6 μ m，60mg/ml)、25 μ 1 2. 5mol/L CaCl2 禾口 10 μ 1 0. lmol/L亚精胺在振荡器上混勻，经70%和无水乙醇充分脱水洗涤以后，悬浮于50 μ 1无水乙醇，取10μ 1滴加在载物膜上。( 转化条件为样品室真空度27Pa，压力llOOpsi，样品距载物膜距离为25cm。轰击后于黑暗湿润的环境下，室温培养Mh。X-Gluc染色后在显微镜下观察并拍照。采用瞬间表达实验的方法证实了 6 / ^ 阳性克隆可与顺式元件结合(见图5)， 激活它所驱动的⑶S在洋葱上表皮中表达，说明该基因是一个辣椒WRKY蛋白的编码基因。2烟草转基因植株的获得与耐高温分析 2. 1烟草遗传转化及Tl代转基因种子的收获
采用叶盘遗传转化法(徐刚标等，2007 ；植物基因工程(第二版))，利用1.2.2中所构建的含目的基因的超表达载体的农杆菌，侵染2个月的无菌野生型烟草1(3 小苗的叶盘 (0. 5cmX0. 5cm)。在含卡那霉素(100 mg/L)的MS培养基上筛选抗性小苗，并对抗性小苗的基因组DNA进行PCR检测，以确定卡那霉素筛选的可靠性。获得15个转基因株系。所有的株系均用套袋自交收获Tl代转基因种子。利用T2代转基因种子进行转基因烟草表型分析与功能鉴定。参与植物高温耐受的调控
本发明分析了 CaWRKY40在植物对高温胁迫中的可能作用，将收获的T2代转基因种子及1(3 野生型成熟种子分别种子无菌水浸泡Mh，75%酒精30s，10%过氧化氢lOmin， 无菌水清洗5-6次，播种MS培养上，十五天后，移栽于育苗盘，一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周后，辣椒6 / ^ 超表达和1(3 植株暴露于42°C，光照 1500LX-2000LX, 16day/8night光周期，高温胁迫24h后，置于正常生长温度25°C，光照 1500LX-2000LX, 16day/8night光周期，15天后拍照(见图6)，辣椒CkTMT^ 超表达烟草植株相对于野生型对照表现出对42°C高温的明显耐性，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡。 相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果。结果发现，6 / ^ 转基因烟草突变体对42°C高温的耐性强于野生型对照(图7)，说明CaWRKY40参与了植物对高温的抗性调节。
3结果
本发明发现辣椒&/ ^ 可显著提高转基因烟草对42° C以上高温的耐性，该基因在植物耐高温基因工程上具有十分重要的应用价值。
权利要求
1. 一个辣椒基因，其特征在于所述辣椒基因命名为fer^r劝基因，从UV - B处理的辣椒叶片的cDNA文库分离获得，该基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利1要求所述基因的超表达载体的构建方法，其特征在于将辣椒 CaWRKY40基因与CaMV35S启动子核心序列融合，构建成CaWRKY40的超表达载体。
3.一种含有权利要求1所述的基因或由权利要求2所述的方法构建的超表达载体在烟草耐高温基因工程中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种辣椒CaWRKY40基因在烟草耐高温基因工程中的应用，所述辣椒基因命名为CaWRKY40基因，从UV–B处理的辣椒叶片的cDNA文库分离获得，该基因至少含有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述的基因或由其构建的超表达载体在烟草耐高温基因工程中的应用。本发明的辣椒CaWRKY40基因在烟草中的超表达与野生型烟草相比显著提高转基因烟草的耐高温能力，该基因在植物耐高温基因工程中具有十分重要的应用价值。
文档编号C12N15/82GK102260685SQ20111017705
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者何水林, 党峰峰, 刘志钦, 官德义, 王育娜 申请人:福建农林大学