专利名称：油菜类BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体是涉及油菜类BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程应用。
背景技术：
BnGLPP为发明人首次从油菜花粉中克隆到的花粉蛋白编码基因，有关该基因的克隆及其编码蛋白在油菜花粉形成及萌发过程中的作用还不清楚，查阅文献未见相关报道，推测该蛋白可能参与油菜花粉粒萌发过程中。BnGLPP蛋白及其编码基因的作用与应用现状还处于空白现状，仅有的确切作用与 功能研究为本专利要求中提到的实例，主要包括在正常生长条件下BnGLPP基因仅在花粉中表达，在干旱和低温胁迫下，该基因可在叶片中表达，属于逆境胁迫诱导表达类型基因。鉴于BnGLPP基因的表达特性，即受干旱和低温胁迫诱导表达，表明该基因可能参与植物逆境应答，与植物抗逆性能力有关，过量表达BnGLPP转基因水稻抗旱性鉴定为上述论点提供了确切的证据。植物抗旱、抗寒和耐盐性机理存在较大的交集，尤其是通过渗透调节方式提高植物抗旱性的同时都不同程度地提高相应植物的抗寒和耐盐能力，因此BnGLPP也可作为优异基因资源改良转基因植物的抗寒和耐盐性状。此外，蛋白主要在花粉中高水平表达表明该基因及其编码蛋白可能与植物的花粉育性有关，可作为创制不育系材料的靶基因加以应用。综上所述，油菜类BnGLPP蛋白及其编码基因的作用与应用前景主要包括通过遗传修饰以及转基因途径改良植物的抗旱、抗寒性和耐盐能力，以及创制雄性不育系材料。
发明内容
本发明公开了一种油菜BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程应用，该基因的cDNA及其编码氨基酸序列见SEQl和SEQ2。本发明的技术方案如下一种油菜类BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程应用。是下述核苷酸序列之一a)序列表中SEQl所示的cDNA序列序列；b)可与序列表中SEQl限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述的基因，其特征在于，与序列表中SEQl限定的DNA序列杂交的条件为
O.I X SSPE或O. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下洗膜。所述的基因，其特征在于，该基因编码一个类葡聚糖酶蛋白。所述的基因，其特征在于，该基因受干旱和低温胁迫下后上调表达。所述的基因，其特征在于，该基因过量表达明显提高受体植物对干旱的抗性。含有所述基因的表达载体。含有所述基因的宿主菌。所述基因在植物抗干旱改良中的应用。所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
所述的应用，其特征在于包括I)油菜总RNA的提取；2)油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的克隆以步骤I)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，设计两端引物对BnPfl和 BnPrl，BnPfl 5-ATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPrI 5-TGGTTTATACTCATAGTGGCA-3,进行PCR扩增获得油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列SEQl ；
3)植物表达载体构建根据油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列序列SEQl，设计扩增出包含完整编码阅读框的引物，并在上游引物BnPf2和下游引物BnPr2上分别引入限制性内切酶位点Bgl II和BstE II，BnPf2和BnPr2引物序列为 BnPf2 5-AGATCTATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPr2 5-GGTGACCTGGTTTATACTCATAGTGGCA-3 ；以步骤2)中获得的经测序证实含有BnGLPP cDNA质粒为模板，经PCR扩增后，将BnGLPP的cDNA再次克隆至中间载体pGEM-T，利用Bgl II和BstE II双酶切获得目的基因，将BnGLPP克隆至双元表达载体PCAMBIA3301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，获得含有 BnGLPP 基因的重组载体 pCAMBIA3301 =BnGLPP ；4)转基因植株获得将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA3301 =BnGLPP转入农杆菌，进一步转入水稻品种，经过PCR扩增验证得到转BnGLPP基因的水稻。一种含有油菜BnGLPP基因的抗旱植物表达载体。所述的表达载体，其特征在于是将BnGLPP基因克隆至克隆至双元表达载体PCAMBIA3301的Bgl II和BstE II双酶切位点所得。所述的表达载体在构建具有抗旱能力转基因作物中的应用。SEQl =BnGLPP基因的全长cDNA序列；核苷酸序列碱基组成155 a, 124 c，107 g,159 tATGTCAACTTTCTTGATGAGGATACTTCTTTCTTTGCTCGTCTTAGCATTGACAATTCCTCAACAGTCAGGTAATAATATCACTGAAATGTTCAAACTTGTGCACCTATATGCTGTCTTTTTCCTTATGAAAGATGTATCTATATACACAGAGGCAGAGTCGGAACAGTGGTGCATAGCAGATGAACAAACGCCAGACGATGAGTTGCAAGCAGCCTTAGACTGGGCTTGCTCGAAAGGCGGAGCAGACTGCAGCAAAATGCAGCAGGAAAACCAGCCTTGCTTCTTGCCCAACACAATCAGGGATCATGCCTCTGTTGCCTTTAACAGTTATTACCAAACATATAAGCACAAAGGTGGCTCTTGTTACTTCAAAGGCGCTGCCATGATCACTGAGCTTGACCCAAGTAAATTTTATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTAATTGAATCCTTTGAAACTTAGCTTATAGTGAACCAACAGTTGACTGATCCGGATATGATTGGAACAGGTCATGGTTCTTGCCACTATGAGTATAAACCASEQ2 =BnGLPP基因基因编码的蛋白氨基酸序列MRILLSLLVLALTIPQQSGNNITEMFKLVHLYAVFFLMKDVSIYTEAESEQffCIADEQTPDDELQAALDWACSKGGADCSKMQQENQPCFLPNTIRDHASVAFNSYYQTYKHKGGSCYFKGAAMITELDPSKFYLSLSLSLSL本发明的工作原理与效果本发明涉及基因BnGLPP为油菜中首次报道的类葡聚糖酶蛋白基因，mRNA表达分析结果显示该基因在油菜花粉中高丰度表达，在叶片和茎部受低温和干旱诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对干旱和低温的抗性。因此，BnGLPP可作为目的基因导入植物，提高植物的抗抗旱和耐低温能力。
图I转BnGLPP基因水稻抗旱性鉴定I :
5叶期I心转基因及其对照断水处理15天(A)及回水处理I天时的表现(B)图2转BnGLPP基因水稻抗旱性鉴定2:2叶期I心转基因及其对照断水处理15天图3组成型表达载体pCAMBIA3301 =BnGLPP酶切鉴定M :DNA 分子量标准(DL2000) ;1_2，分别为重组载体 pCAMBIA3301 : :BnGLPP 及其双酶切鉴定样品.图4转基因再生植株PCR检测(T0代)MM =DNA分子量标准(DL2000) ； I =BnGLPP阳性对照；2_3 :水样空白和非转基因DNA对照；4-17 :不同转基因再生水稻株系。图5部分转基因株系BnGLPP转录表达半定量PCR检测1-2分别为水样空白和非转基因DNA对照；3_8分比为不同转基因株系样品
具体实施例方式油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的基因工程应用，包括I))总RNA的提取选用双低油菜杂交种“杂双4号”，待花蕾期(花前2天)取健康完整的花蕾，用无菌处理后的镊子在超净工作台中剥取完整的花药，液氮冷冻，保存于_80°C冰箱；取部分花药，在液氮条件下用研钵充分研磨，转移入盛有Trizol裂解液的离心管中，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量，紫外分光光度计检测总RNA的浓度。(4)油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的克隆设计两端引物对BnPfl 和 BnPrl，BnPfl 5-ATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPrl 5-TGGTTTATACTCATAGTGGCA-3，将步骤I)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR扩增程序如下94°C预变性3分钟，94°C变性40 S，50°C复性40 3，721延伸1.5 min，32个循环后，72°C延伸8 min，最后用普通Taq酶72°C保温8 min以便末端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列SEQl。(5)植物表达载体的构建根据油菜类葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列序列SEQ1，设计扩增出包含完整编码阅读框的引物，并在上游引物BnPf2和下游引物BnPr2上分别引入限制性内切酶位点Bgl II和BstE II，BnPf2和BnPr2引物序列为 BnPf2 5-AGATCTATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPr2 5-GGTGACCTGGTTTATACTCATAGTGGCA-3 ；以步骤2)中获得的经测序证实含有BnGLPP cDNA质粒为模板，经PCR扩增后，将BnGLPP的cDNA再次克隆至中间载体pGEM-T，利用Bgl II和BstE II双酶切获得目的基因，将BnGLPP克隆至双元表达载体PCAMBIA3301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，获得含有 BnGLPP 基因的重组载体 pCAMBIA3301 =BnGLPP0
载体鉴定见图4。(6)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA3301 : =BnGLPP转入农杆菌宿主菌菌株EHA105，进一步转入旱敏感水稻品种“Kittake”，对获得的转基因植株进行PCR鉴定，并进行加代繁殖至纯合(T3代)，在繁殖加代过程中同时使用BASTA喷施去除分离株，以及PCR鉴定核实，确保转基因后代含有目的基因BnGLPP，将生长至5叶期I心的转基因T4代植株及非转基因对照进行断水干旱胁迫15天，而后恢复供水观察吸水复涨情况，结果显示在干旱15天之后转基因及对照均出现萎蔫现象，转基因植株的含水量略高于非转基因对照，在复水处理I天后转基因植株均能复涨坚挺，而非转基因对照因出现永久性萎蔫迅速倒伏(图I);与此同时，将将生长至2叶期I心的转基因T4代植株及非转基因对照进行断水干旱胁迫15天，调查转基因植株及非转基因对照植株的存活率，结果显示转基因植株存活率为100%，而对照 的存活率在15%左右(图2)。上述结果表明过量表达BnGLPP可显著调高转基因水稻的抗旱性，BnGLPP基因可作为抗旱优异基因进行植物抗逆性改良加以应用。I)转基因植株的检测结果提取分化成株水稻叶片总DNA，质量及浓度检测后作为DNA扩增模板，以表达载体PCAMBIA3301 =BnGLPP构建引物BnPf 2和BnPr2对上述模板进行PCR扩增检测，结果显示所获得的41个水稻再生单株均能扩增出目的片段，片段大小与预期相符，测序结果同样证实所扩产物为目的基因。(I)转基因植株的表达水平等数据和图片提取T4代纯合株系及非转基因对照4叶I心期叶片总RNA，检测质量浓度调整之后反转录合成cDNA第一链，采用半定量PCR对上述转基因株系中BnGLPP基因的转录表达水平进行检测，同时以水稻组成型表达基因actin作为内参，BnGLPP和actin扩增引物分别为BnPf3和BnPr3，以及Acfl and Acrl0 BnGLPP基因引物序列为:ACTTCTTTCTTTGCTCGTCTTAG, GAGGCATGATCCCTGATTG ；actin 基因引物序列为CGGGAAATTGTGAGGGACAT, AGGAAGGCTGGAAGAGGACC。扩增结果显示，在供试转基因株系中均能检测到外源目的基因的转录表达，而空白对照及非转基因对照未见相应条带，但是表达水平存在较大差异，这可能是外源基因整合的拷贝数差异，或则是外源基因插入位点所致。
权利要求
1.一种油菜类BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程应用，是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQl所不的cDNA序列序列； 2)可与序列表中SEQl限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的基因，其特征在于，与序列表中SEQl限定的DNA序列杂交的条件为O. IXSSPE或0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下洗膜。
3.根据权利要求I或2所述的基因，其特征在于，该基因编码一个类葡聚糖酶蛋白。
4.根据权利要求I或2所述的基因，其特征在于，该基因受干旱和低温胁迫下后上调表达。
5.根据权利要求I或2所述的基因，其特征在于，该基因过量表达明显提高受体植物对干旱的抗性。
6.含有权利要求I 5之一所述基因的表达载体。
7.含有权利要求I 5之一所述基因的宿主菌。
8.根据权利要求I 5之一所述基因在植物抗干旱改良中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，具体是涉及油菜类BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程应用。本发明涉及基因BnGLPP为油菜中首次报道的类葡聚糖酶蛋白基因，mRNA表达分析结果显示该基因在油菜花粉中高丰度表达，在叶片和茎部受低温和干旱诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对干旱和低温的抗性。因此，BnGLPP可作为目的基因导入植物，提高植物的抗抗旱和耐低温能力。
文档编号C12N15/84GK102911951SQ201210299279
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者张保刚, 张灿, 吴照华, 岳继承, 李洪生, 黄德伟, 翟从文, 江丽容 申请人:安徽绿亿种业有限公司