专利名称：罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法
技术领域：
本发明涉及罗非鱼肝脏抗菌肽h印cidin的基因工程制备方法。_
背景技术：
抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有强抗菌作用的小分子多肽，其抗菌谱广、无耐药诱导性、分子量小而耐热性好，且具免疫调节功能，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了重要作用，被认为是饲用抗生素替代品的最佳候选者，因此，极具开发应用前
旦
ο罗非鱼(英文名Tilapia，学名Oreochromis niloticus)抗菌肽h印cidin的特点是分子量小、富含半胱氨酸、带正电荷，属于防御素家族，其分子内由4对二硫键形成的环状结构与抗菌功能有关；由于它兼具广谱抗菌和对铁代谢的负调控作用而越来越受到关注。h印cidin最初是从人的血浆和尿液中分离获得，其成熟肽被确定由25个氨基酸残基组成。随后，有其他哺乳动物和一些鱼类如虹鳟、斑马鱼、鮰鱼和罗非鱼的关于 hepcidin的研究报道，但大多数仅局限于从生物中提取或对其编码基因的克隆方面。据报道，三种h印cidin的同工型基因(TH1-5，TH2-2, TH2-3)从罗非鱼肝脏中被分离，人工合成的TH1-5和TH2-3显示了明显的抗菌功能，但TH2-2无抗菌功能。迄今为止，还未见关于罗非鱼h印cidin重组DNA表达方面的报道。很显然，目前抗菌肽制备中存在的问题是生物机体中含量甚微，直接提取困难重重，化学合成成本又太高，无法大量获得。因此，通过基因工程技术制备抗菌肽无疑是目前研究开发的最佳方法。
发明内容
本发明提供了一种制备罗非鱼抗菌肽h印cidin的方法，包括(1)将该抗菌肽的编码基因THM与质粒ρΕΤ3^ι构建为融合表达载体ρΕΤ3^ι-ΤΗΜ ； (2)将ρΕΤ3^ι-ΤΗΜ融合表达载体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，构建表达工程菌；(3)发酵培养表达工程菌，并进行IPTG 诱导表达；(4)发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；及(5)抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼h印cidin成熟肽“THM”产品。在本发明的一实施方式中，其中步骤(1)包括以罗非鱼肝脏组织为材料提取总 RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA ；设计两条引物THM-F 5，CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’ JPTHM-R 5’CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3’，其中下划线为I 禾III 酶切位点， 以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码抗菌肽“THM”的DNA片段，测序确证后，通过双酶切与质粒PET3M连接，构建成融合表达载体pET3h-THM。在本发明的实施方式中，步骤(4 )包括从发酵液收集细胞，超声破碎及离心后所得上清液采用M-IDA亲和柱层析纯化得到抗菌肽融合蛋白。在本发明的实施方式中，步骤(3)在添加IPTG诱导表达之前还添加终浓度为 0. 5%-1% (v/w)葡萄糖(比如IOOOml的培养基，它如果含有0. 5%葡萄糖，里面就有0. 5% xl000=5克的葡萄糖)
本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽hepcidin，分离纯化方便、易操作，适合大规模扩大生产。产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抗菌效果，且热稳定性良好。本发明可作为绿色饲料添加剂替代饲用抗生素，在水产养殖安全中具有广阔的应用前景。
图1是罗非鱼抗菌肽h印cidin表达载体重组质粒pET3h_THM的构建示意图2是融合蛋白的Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析图，其中峰2是融合蛋白的洗脱峰；
图3是h印cidin的成熟肽“THM”的分子筛层析图，其中峰3是成熟肽“THM”的洗脱峰；
及
图4是融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳分析图。
具体实施例方式本发明使用pET3h为表达载体质粒，使用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主菌，以融合蛋白的形式表达罗非鱼抗菌肽h印cidin同工型TH1-5 (即THM)，并进行体外抗菌活性和热稳定性鉴定。下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例罗非鱼抗菌肽h印cidin的制备 (1)构建表达载体
首先以罗非鱼肝脏组织为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA ；根据抗菌肽h印cidin成熟肽“THM”的编码序列(见SEQ ID NO: l)、pET32a的多克隆位点，设计合成两条引物如下
THM-F 5’ CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’
THM-R 5，CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3，，其中，下划线为 &0R I 禾口历III 酶切位点。以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码“THM”的DNA片段，将此片段插入克隆载体PSURE，测序确证后，通过双酶切获得该片段，然后与表达载体pET3h连接(16°C、 过夜)，载体构建见图1。(2)构建基因工程菌
用上述表达载体转化宿主菌(45°C、30秒)，宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)； (3)诱导表达
采用LB培养基(含lOOg/mL氨苄)，还添加终浓度为0. 5%-l%(w/v)葡萄糖(比如IOOOml的培养基，它如果含有0. 5%葡萄糖，里面就有0. 5% xl000=5克的葡萄糖)，371、220转/ 分发酵培养表达工程菌约4小时至0D600达到0. 6 ；加入终浓度0. lmmol/L的IPTG、25°C、 110转/分诱导表达约12小时； (4)融合蛋白的纯化
发酵液离心(8000g，4°C，10min)，沉淀重悬于 PBS (140mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, ρΗ7· 3)中超声破碎 30 秒，离心(12000g，4°C，lOmin)，上清用作下一步上柱纯化。采用Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析，以4倍柱床体积的结合缓冲液 (20mmol/L Tris-HCL, 8mol/L 尿素，500mmol/L NaCl, 5mmol/L 咪唑，pH 8. 0)平衡柱， 上样；8倍柱床体积的洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCL, 8mol/L尿素，500mmol/L NaCl, 500mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。收集蛋白，洗脱峰如图2所示，其中峰2是融合蛋白的洗脱峰。根据对总蛋白浓度和融合蛋白浓度的测定结果，计算得到融合蛋白的表达量约占总蛋白表达量的20-30%。(5)融合蛋白的酶切和分子筛层析
肠激酶反应体系肠激酶(用量为每50 g融合蛋白一个酶活单位)，25mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L NaCl, 2mmol/L CaCl2 ;25°C，反应 16 小时。采用分子筛层析，分离介质为Superdex G75，用25mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)缓冲液平衡5个柱体积，上样，25 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱。收集蛋白峰，得到罗非鱼 hepcidin成熟肽“THM”。分子筛层析图如图3所示，其中峰3是成熟肽“THM”的洗脱峰。
融合蛋白的jTricine-SDS-PAGE检测
制备16. 5% T, 6% C浓度的分离胶、4% T, 3% C浓度的浓缩胶，最终纯化样品2. ^ig/ mL，与上样缓冲液(4x Tricine SDS 上样缓冲液0. 05mol/L Tris-HCl, 4% SDS, 12% 甘油，200mmol/L DTT, 0. 01% Commasie G250)混合，沸水浴5分钟后上样电泳(正极电泳缓冲液为 0. 2mol/L Tris-HCl, pH8. 9 ；负极电泳缓冲液为 0. 1 mol/L Tris-HCl,0. 1 mol/L Tricine,0. 1% SDS，pH8. 25)。考马斯亮蓝G-250染色，脱色液脱色。图4为融合蛋白的的 Tricine-SDS-PAGE电泳分析图，其中泳道M为分子量标准；泳道1是工程菌BL21 (DE3)的总蛋白；泳道2是含重组质粒pET3h-THM不加IPTG的工程菌BL21(DE3)的总蛋白；泳道3 是含重组质粒pET3h-THM加IPTG的工程菌BL21 (DE3)的总蛋白；泳道4是纯化的融合蛋白。分离纯化后的融合蛋白分子量为22.4kDa，与理论推算值相符。
纯化的成熟肽“THM”产品的抗菌活件测定
将500 L IXlO5 CFU/mL金黄色葡萄球菌(^Staphylococcus aureus )、铜绿假单胞菌 iPseudomonas aeruginosa )、大肠木干菌{Escherichia coli )、单土曾李斯特菌{Lis teria mwocj^O^^M)分别加入25mL灭菌的LB固体培养基中，混勻后制成含菌平板。100L枪头倒置在平板上压出直径为6_的孔6个。依次加入20(^g/mL、10(^g/mL、5(^g/mL、25Pg/mL、 12. 5Pg/mL的THM 20L以及酶切缓冲液20L(对照)。倒置于37°C恒温培养箱中培养12小时，观察抑菌圈，抑菌效果如表1所示。表 权利要求
1.一种制备罗非鱼抗菌肽hepcidin的方法，包括(1)将该抗菌肽的编码基因THM与质粒pET3h构建为融合表达载体pET3h-THM；(2)将pET3h-THM融合表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达工程菌；(3)发酵培养表达工程菌，并进行IPTG诱导表达；(4)发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；(5)该抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼h印cidin成熟肽 “THM”产品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)包括以罗非鱼肝脏组织为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA ；设计两条引物THM-F 5’ CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’THM-R 5’CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3，，其中下划线为&0R I 和历III 酶切位点，以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码抗菌肽“THM”的DNA片段，测序确证后，通过双酶切与质粒PET3M连接，构建成融合表达载体pET3h-THM。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中步骤(3)包括采用LB培养基，37°C发酵培养表达工程菌至0D600达到0. 6，加入终浓度0. lmmol/L的 IPTG、25°C诱导表达12小时。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中步骤(4)包括发酵液离心所得细胞沉淀重悬于由含140mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl和IOmmol/ L Na2HPO4的pH7. 3的PBS液中超声破碎30秒，再离心得到上清液待上样；采用Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析，以4倍柱床体积的含20mmol/L Tris_HCL、8mol/L尿素、 500mmol/L NaCl和5mmol/L咪唑的pH 8. O结合缓冲液平衡亲和柱，上样；8倍柱床体积的含 20mmol/L Tris_HCL、8mol/L 尿素、500mmol/L NaCl 和 500mmol/L 咪唑的 pH 8. O 洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中步骤(5)包括肠激酶处理肠激酶用量为每50g融合蛋白一个酶活单位，25mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L NaCl、2mmol/L CaCl2, 25°C，反应 16 小时；分子筛层析分离介质为Superdex G75，用pH8. O的25mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡 5个柱体积，上样，25 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集蛋白峰，得到罗非鱼h印cidin成熟肽“THM”。
6.如权利要求1-5的任一项所述制备方法，其中步骤(3)在添加IPTG诱导表达之前还添加终浓度为0. 5%-1% (v/w)葡萄糖。
全文摘要
本发明提供一种制备罗非鱼抗菌肽hepcidin的方法，包括构建融合表达载体pET32a-THM；将该融合表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达工程菌；发酵培养表达工程菌，并进行IPTG诱导表达；发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；及抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”产品。本发明在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽hepcidin，分离纯化方便、易操作，适合大规模扩大生产。产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抗菌效果，且热稳定性良好。本发明可作为绿色饲料添加剂替代饲用抗生素，在水产养殖安全中具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/19GK102337288SQ20111027757
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者文雅, 沈彦萍, 陶妍 申请人:上海沈李科工贸有限公司