专利名称：：鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物基因工程领域，具体涉及鱼类传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)基因工程疫苗及其制备方法。
背景技术：
：随着我国水产业的不断发展，各种水产养殖面积和养殖密度不断增加，同时养殖上管理技术的不当，使得养殖水环境日趋恶化，各种疾病频频暴发。在至今报道的多种疾病中，给鱼类养殖带来严重经济损失主要原因之一是病毒病。其中，传染性脾肾坏死病毒(ISKNV,InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus)就是其中一种主要的造成鱼类大量死亡的病毒。该病毒成熟病毒粒子直径150rau受感染细胞肿大，直径为正常细胞34倍，感染后IO天内死亡率为90%—100%。由于，这种病毒在多种的鱼类中都发现感染现象，并且主要感染鱼的脾和肾，导致脾肾坏死，因此，暂命名为传染性脾肾坏死病毒。同时，也根据当时的研究，初步确定这种病毒属于虹彩病毒科。ISKNV由此得名。近年来，在许多国家和地区陆续有报道由ISKNV引起的水产经济动物的大批死亡。在我国，也陆续在鳜鱼、美国红鱼、石斑鱼和大黄鱼等水产养殖中发现ISKNV病害，1994—1998年间和最进两年都有不同地区爆发该病，给水产养殖业带来大量损失。目前国内外尚无有效抑制传染性脾肾坏死病毒的药物。通常养殖者采用生石灰、硫酸铜、次氯酸盐、碘盐或投放抗生素等方法，通过改变水体环境抑制病毒的生长。但该病毒生命力非常顽强，暂时的环境变化只能短时间抑制其扩散，并不能将其杀死。长时间下去必将大规模扩散，尤其在水温27—30'C的时候更有可能大规模爆发。如果长期性、经常性的投放以上药物对鱼体本身的生长也相当不利。传统的抗生素对该病毒也不起作用。日本、韩国有相关报道利用DNA疫苗控制与ISKNV相似的其他虹彩病毒，并取得了一定成果。DNA疫苗是一种利用编码具有免疫活性的特定抗原的病毒DNA来直接诱导鱼体免疫反应的疫苗，但与重组蛋白疫苗相比，其具有潜在的危险性(l)被注射的、可由宿主吸收的DNA有可能被整合到宿主的染色体中，并引起插入突变。在理论上，外源DNA引人体内敏感细胞中可能通过插入活化致癌基因，插入激活宿主细胞原致癌基因或插入灭活抑制基因引起肿瘤细胞形成.尽管这种概率很低(2)外源抗原的长期表达可能导致不利的免疫病理反应；(3)使用编码细胞因子或协同剌激分子的基因可能具有额外的危害；(4)有可能形成针对注射DNA的抗体和出现不利的自身免疫紊乱；(5)所表达的抗原可能产生意外的生物活性。
发明内容本发明的目的是提出一种可以使水产鱼类产生抗ISKNV免疫力的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法，该疫苗是一种重组蛋白疫苗，可以抑制传染性脾肾坏死病毒对鱼体的感染，使水产鱼类可以健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，增加水产产量和效益，同时避免DNA疫苗所存在的弊端。从传染性脾肾坏死病毒ISKNV全基因序列中筛选两个与病毒感染细胞密切相关的开放读码框(OpenReadingFrame,0RF)0RF24和0RF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白，再以重组蛋白为抗原，制备基因工程疫苗，对鱼类进行免疫试验，证明该疫苗可以使水产鱼类产生抗ISKNV免疫力。本发明所提出的基因工程疫苗，含有两个基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50，所述的protein-24和protein-50的氨基酸序列分别为protein-24:MDKYVLRPSDPHLWAMYKKAVASFWTVEEVDLSTDVRHWTEKLTEAERRFMSHILAFFAMADGIVGDNLVCNFAKELDYIPEARAFYGFQVAMENIHAEMYTQLIITLVAKENQMLFSAAEDMPCVKAKAQWAAQWLNATHKSIATRLLAFAAVEGVMFSGSFAAIFWLKKRSLMPGLAFSNELISRDEGLHCDFACMLFRQMANKPCQDDAHQIISDAVDIETAFFQEALKTPLLGMNSDSMRLYIQFVADRLLDALGYAKMYNVANPFDFMDNISIEGKTNFFERRVSEYQRMGVFTPSSMEFTMTEDF.protein-50:MYPECPGMEECLIDLFAKHGYT冊FRRVMFAYNRDKIHTPVPVTPNLYAHVLREICDSDNPALTYATFIAMCAVTCGTATKDCAVQCANALANDQGFQAIGWARLYRYMTEELPDHFETVGALCIACVFFGSTVYMCARLMK.所述的基因工程疫苗中还包括有佐剂(MONTANIDEISA763A，s印pic，france)。所述的两个基因重组蛋白protein-24和protein-50,它们分别由筛选自ISKNV基因组中的2个开放读码框0RF24和0RF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白而成。本发明疫苗的具体制备方法如下以病鱼脾脏基因组DNA为模板，根据序列设计PCR引物如下ORF24扩增引物Primer24F:5，-CGGGATCCATGGATAAGTATG-3'Primer24R:5，-CGGGGTACCTTAGAAATCTTCAGTC-3，0RF50扩增引物Primer50F:5,-ATGGATCCATGTACCCTGAG-3，Primer50R:5，-GCGCGCTGCAGTTATTTCATAAGTC-3，0RF24扩增长度939bp,ORF50扩增长度429bp。得到PCR扩增片断后，再利用质粒载体pET-32a，通过酶切、连接、抗性筛选，制备并提纯重组质粒0RF24-pET-32a和ORF50-pET-32a，利用大肠杆菌DE3原核表达并纯化重组蛋白protein-24和protein-50。将两种蛋白作为抗原，以质量比1:1均匀悬浮于PBS缓冲液中。制备疫苗时，将蛋白溶液与佐剂(MONTANIDEISA763A,s印pic，france)以体积比1:l混匀，直至呈现水乳交融状态，则疫苗制备完成，于4'C保存。为了检验该疫苗抗原是否适合大规模工业化生产。我们利用发酵罐sartoriusBBIsystemsGMBH(5L)制备抗原蛋白，结果使用普通LB培养基也可制备8g左右，符合工业化生产标准。本基因工程疫苗的免疫试验效果如下免疫步驟'免疫方式一般采用背部肌肉注射或胸鳍腹腔注射。抗原注射量以O.5g/kg为标准。疫苗注射体积按鱼体重决定，平均体重500g以下的注射0.l—O.5ml/尾，500g以上的注射lml/尾。例如在广东南海利用传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗共免疫2000尾鳜鱼，平均体重约100g。则每尾注射疫苗0.1ml，总共需要疫苗体积200ml，包含抗原100mg，再按以上工艺流程制备。疫苗注射后大约l个月鱼体产生抗体，免疫力至少可持续半年。建议在鱼龄较小时注射疫苗，这样效果更佳。本疫苗适用于鳜鱼、石斑鱼、军曹鱼、大黄鱼等鱼类防治病害，无论淡水环境还是海水环境皆有效，还适用于池塘养殖和网箱养殖。免疫^I&^1W况和分析(1)糖鱼主动免疫试验实验原料为0.5公斤左右的镢鱼。抽查检测无感染ISKNV。利用鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗进行实验。实验分为三组，阳性对照，阴性对照，疫苗组。每组20尾鱼。疫苗组以0.5mg抗原/kg为标准(以下亦同)注射混合疫苗，一个月后攻毒。攻毒时阴性对照只注射lmlPBS/尾，阳性对照和疫苗组注射病毒液lml/尾。将水温升至28'C，饲养3个星期，观察鳜鱼状态，免疫结果如下(表l)。、、^___<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>从表1显示，阳性对照组两个星期后全部发病死亡。阴性对照一直状况良好。疫苗组共死亡5尾，剩余15尾于3星期后一直良好。可见ORF24+50的混合抗原有一定免疫作用，保护率75%左右。(2)广东南海池养H鱼中试试验2005年6月，在广东南海利用该疫苗共免疫了2000尾鳜鱼(约100g)。免疫1个月，随机获取20尾已经免疫的鳜鱼进行攻毒保护实验，同时取40尾同一个鳜鱼育苗场同一批次没有免疫的镢鱼，分成三组，即阳性对照组，阴性对照组和抗原组，每组20尾。先在实验室28'C水温暂养7天，然后注射感染ISKNV或PBS，免疫结果如下(表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>从表2显示，阳性对照组(没有免疫)感染ISKNV两个星期后全部发病死亡，死亡率100%。阴性对照(没有免疫也没有感染病毒)一直状况良好，没有死亡发生。抗原组(免疫且攻毒组)3个星期内共死亡6尾，存活14尾，保护率70%。0RF24+50的混合抗原有较好的免疫保护作用。由试验显示，本疫苗具有以下优点a.鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗对鳜鱼、斜带石斑鱼、大黄鱼、军曹鱼等水产鱼类具有较强的免疫保护作用，保护率超过70%。b.疫苗本身不含对人体有害的成分，对注射疫苗的鱼类可以安全食用。c.疫苗本身对鱼类生长没有影响，在保证水环境和饲料的情况下，被免疫的鱼类生长良好。d.免疫力持续时间长达半年以上。e.疫苗制备流程相对简便，在原材料充足的前提下，实验室条件下一个星期左右即可制备出上千尾鱼的注射量。f.疫苗本身不易失效，普通冰箱4'C放置一周仍有效。g.适合大规模工业化生产。利用发酵罐sartoriusBBIsystemsGMBH(5L)制备抗原蛋白，使用普通LB培养基也可制备8g左右。h.生产成本相对较低。图1是PCR扩增0RF24电泳鉴定结果。图2是PCR扩增0RF50电泳鉴定结果。图3是重组质粒0RF24-pET-32a酶切、电泳鉴定结果。图4是重组这里0RF50-pET-32a酶切、电泳鉴定结果。图5是0RF24基因诱导表达蛋白SDS-PAGE结果。图6是0RF50基因诱导表达蛋白SDS-PAGE结果。图7是表达质粒pET-32a构建图。具体实施方式疫苗组成本疫苗由含有两个基因重组蛋白protein-24和protein-50抗原的蛋白溶液和佐剂(MONTANIDEISA763A,s印pic,france)组成，所述的基因重组蛋白protein-24和protein-50的制备在ISKNV基因组中筛选了2个编码ISKNV囊膜蛋白开放读码框(OpenReadingFrame,ORF)0RF24和ORF50。ORF24编码蛋白长度为313AA，在148—170位置上有一跨膜区。0RF50编码蛋白长度为143AA。在116—138AA位置上有一跨膜区。所用ORF碱基序列为0RF24:TGAGGAGGTGGATCTTAGTACTGATGTACGCCATTGGACAGAAAAACTGACCGAGGCTGAGCGCAGGTTCATGTCTCACATACTGGCATTCTTTGCAATGGCAGATGGCATTGTAGGCGACAACCTTGTGTGCAATTTCGCAAAAGAACTTGACTATATTCCGTGACGAAGGTCTACACTGTGACTTTGCTTGTATGCTGTTTAGGCAAATGGCAMCAAACCGTGTCAGGACGATGCACATCAAATCATATCTGATGCCGTTGACATTGAGACGGCTTTCTTCCAAGAGGCACTAAAGACACCCCTACTTGGTATGAATAGTGACAGTATGAGACTGTACATACAGTTTGTTGCAGATCGCCTGCTCGATGCCCTGGGTTATGCAAAGATGTATAACGTAGCGAATGGGTGTTTTCACGCCAAGCAGCATGGAATTTACAATGACTGAAGATTTCTAAORF50:ATGTACCCTGAGTGTCCCGGAATGGAAGAGTGTCTCATCGACCTCTTTGCAAAGCACGGGTACACGTGGTGGTTCAGACGCGTCATGTTTGCCTACAACAGAGACAAAATCCACACCCCTGTGCCAGTGACTCCGAACTTGTATGCCCATGTCCTGACTGTGTATATGTGTGCMGACTTATGAAATAA以病鱼脾脏基因组DNA为模板，根据序列设计PCR引物如下:ORF24扩增引物Primer24F:5'-CGGGATCCATGGATAAGTATG-3，Primer24R:5，-CGGGGTACCTTAGAAATCTTCAGTC-3，ORF50扩增引物Primer50F:5，-ATGGATCCATGTACCCTGAG-3'Pri鹏r50R:5，-GCGCGCTGCAGTTATTTCATAAGTC-3，ORF24扩增长度939bp(如图1所示，图中，M为DNAMarkerDL2000,1为PCR扩增产物)，0,扩增长度429bp(如图2所示，图中，M为DNAMarkerDL2000,1、2、3为PCR扩增产物)。得到PCR扩增片断后，再利用质粒载体pET-32a(如图7所示)，通过酶切、连接、抗性筛选，制备并提纯重组质粒ORF24-pET-32a(如图3所示，图中，M为DNAMarkerDL2000,1为双酵切产物)和ORF50-pET-32a(如图4所示，M为DNAMarkerDL2000,1为双酶切产物)，利用大肠杆菌DE3原核表达并纯化重组蛋白protein-24(如图5所示，图中，M为蛋白Marker,1为0RF24表达产物withIPTG，2为0RF24表达产物withoutIPTG，3为空pET-32a表达产物withIPTG，4为空pET-32a表达产物withoutIPTG)和protein-50(如图6所示，图中，M为蛋白Marker,1、3为0RF50表达产物withIPTG，2、4、5、6、7为ORF50表达产物withIPTG,8为空pET-32a表达产物withIPTG，9为空pET-32a表达产物withIPTG)。将两种蛋白作为抗原，以质量比hl均匀悬浮于PBS缓冲液中。疫苗制各将蛋白溶液与佐剂(M0NTANIDEISA763A,s印pic,france)以体积比1:1混匀，直至呈现水乳交融状态，则疫苗制备完成，于4'C保存。权利要求1.一种鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗，其特征在于含有两个基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50，它们的氨基酸序列为protein-24MDKYVLRPSDPHLWAMYKKAVASFWTVEEVDLSTDVRHWTEKLTEAERRFMSHILAFFAMADGIVGDNLVCNFAKELDYIPEARAFYGFQVAMENIHAEMYTQLIITLVAKENQAALFSAAEDMPCVKAKAQWAAQWLNATHKSIATRLLAFAAVEGVMFSGSFAAIFWLKKRSLMPGLAFSNELISRDEGLHCDFACMLFRQMANKPCQDDAHQIISDAVDIETAFFQEALKTPLLGMNSDSMRLYIQFVADRLLDALGYAKMYNVANPFDFMDNISIEGKTNFFERRVSEYQRMGVFTPSSMEFTMTEDF.protein-50MYPECPGMEECLIDLFAKHGYTWWFRRVMFAYNRDKIHTPVPVTPNLYAHVLREICDSDNPALTYATFIAMCAVTCGTATKDCAVQCANALANDQGFQAIGWARLYRYMTEELPDHFETVGALCIACVFFGSTVYMCARLMK。2.根据权利要求l所述的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗，其特征在于还包括佐剂--MONTANIDEISA763A，s印pic，france。3.根据权利要求1所述的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗，其特征在于所述的分别基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50分别由筛选自ISKNV基因组中的2个开放读码框0RF24和ORF50克隆重组而成。4.权利要求1所述的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗的制备方法，其特征在于在ISKNV基因组中筛选2个编码ISKNV囊膜蛋白开放读码框0RF24和0RF50,将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白，再以重组蛋白为抗原，制备成基因工程疫苗，其具体方法如下以病鱼脾脏基因组DNA为模板，根据序列设计PCR引物如下0RF24扩增引物Primer24F:5,-CGGGATCCATGGATAAGTATG-3，Primer24R:5'-CGGGGTACCTTAGAAATCTTCAGTC-3，0RF50扩增引物Priraer50F:5，-ATGGATCCATGTACCCTGAG-3，Primer50R:5，-GCGCGCTGCAGTTATTTCATAAGTC-3，ORF24扩增长度939bp,ORF50扩增长度429bp，得到PCR扩增片断后，再利用质粒载体pET-32a,通过酶切、连接、抗性筛选，分别制备并提纯重组质粒0RF24_pET-32a和0RF50-pET-32a，利用大肠杆菌DE3原核表达并纯化重组蛋白protein-24和protein-50，将两种蛋白作为抗原，以质量比1:1均匀悬浮于PBS缓冲液中，将上述蛋白溶液与佐剂按体积比hl混匀，直至呈现水乳交融状态，即制得本疫苗。5.根据权利要求4所述的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗，其特征在于所述的佐剂为MONTANIDEISA763A，seppic，france。全文摘要本发明提出一种鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法，本发明所提出的基因工程疫苗，含有两个基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50，它们分别由筛选自ISKNV基因组中的2个开放读码框ORF24和ORF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白而成。该疫苗是一种重组蛋白疫苗，可以抑制传染性脾肾坏死病毒对鱼体的感染，使水产鱼类可以健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，增加水产产量和效益，同时避免DNA疫苗所存在的弊端。文档编号A61K39/12GK101168054SQ200610122919公开日2008年4月30日申请日期2006年10月23日优先权日2006年10月23日发明者何建国,旻张,翁少萍申请人:中山大学