专利名称：一种基因工程单链抗体检测t-2毒素的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的检测试剂盒，更具体地涉及了利用基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒，进一步涉及使用该试剂盒检测T-2毒素的方法。
背景技术：
目前，用于免疫检测T-2毒素的抗体都是单克隆抗体。单克隆抗体的生产采用抗原免疫动物，然后利用免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，最后筛选出具有高抗体活性而又能大量繁殖的杂交瘤细胞。整个生产过程复杂，消耗的时间长，费用高，尤其是操作过程需要熟练的专业技术人员才能胜任。
发明内容
为了克服现有单克隆抗体生产费时、费力、费钱的不足，本发明提供了一种基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒及方法，使得T-2毒素的检测过程简便易行，省时省力省钱，
本发明的技术方案如下
本发明的利用基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒，其试剂包括
(1)样品提取液含50%(体积比)二甲基亚砜的生理盐水；
(2)T-2毒素标准试剂含T-2毒素的样品提取液；
(3)酶标抗原试剂含效价5000的T-2-HRP偶联蛋白的PBS溶液，保存于50%(体积比)甘油内，_20°C保存；使用时用BSA试剂稀释；
(4)洗涤液TNT溶液；配方组份0. 05% (体积比)tween-20，20 mmol/L Tris 一 HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；
(6)显色底物配方组份250μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。使用上述的基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒的方法，依次包括以下步骤
(1)样品处理
在0.5 1.5 g样品中加入2 6 ml样品提取液，液氮或机械研磨粉碎后，超声萃取、 离心，上清液即为含样品的提取液；
含样品的提取液与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成A试剂；所述酶标抗原试剂使用时先用BSA试剂稀释，5ml BSA试剂中加入Ιμ T-2-HRP偶联蛋白的PBS溶液；
Τ-2毒素标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成系列浓度的B试剂；(2)试剂平衡将试剂盒平衡至室温；
(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2— 6号孔为T-2毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗T-2毒素单链抗体；
(4)洗涤每孔内加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中T-2毒素的浓度，根据计算公式T-2毒素含量(μ g/g) = C*V / m，其中C-T-2毒素的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；从而计算样品中T-2毒素的含量。所述抗T-2毒素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。所述T_2毒素单链抗体的制备方法如下从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成cDNA，经PCR扩增cDNA 的重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因，再通过一段连接肽将Vh和\连接，形成单链抗体，然后将其克隆到载体上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对T-2毒素具高亲和力的抗T-2毒素单链抗体。所述抗T-2毒素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明的抗T-2毒素单链抗体，其结构如图1所示。该单链抗体(scFv)是用基因工程方法将小鼠cDNA的的重链可变区(Vh)和轻链可变区通过一段连接肽(Linker， Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser)连接而成的重组蛋白。如图2所示，重链可变区(Vh)的大小为340 bp;如图3所示，轻链可变区(V)的大小为 325 bp ；如图4所示，抗T-2毒素单链抗体(scFv)的大小为750 bp ；该单链抗体(scFv)保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可在细菌中大规模经济生产，使得用于免疫检测的抗体生产简便和经济，大大减少了诊断试剂的费用。本发明的显著优点
本发明的试剂盒中采用的T-2毒素单链抗体可以在大肠杆菌中高效表达，并可大规模生产，制备过程简便易行，省时省力省钱。利用本发明的试剂盒检测T-2毒素，在1.5-2 h 内即可确定样品是否受T-2毒素污染，以及计算所含T-2毒素的量，使用方便快捷，成本低廉。
图1为本发明的抗T-2毒素单链抗体的结构示意图。图2为重链基因Vh扩增的电泳图。图3为轻链基因VL扩增的电泳图。
图4为本发明的抗T-2毒素单链抗体基因SCFv扩增的电泳图。图5为本发明的抗T-2毒素单链抗体竞争ELISA检测曲线图。
具体实施例方式以下为本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
按以下配方制作利用基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒
(1)样品提取液50%体积比DMSO的生理盐水；
(2)T-2毒素标准试剂分别为含浓度为0.04,0. 08,0. 16,0. 32,0. 64 μ g/mL T-2毒素的样品提取液；
(3)酶标抗原试剂含效价为5000T-2-HRP偶联蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于50% (体积比)的甘油内，-20°C保存；使用时用BSA试剂稀释，5ml BSA试剂中加入1μ 1 T-2-HRP 偶联蛋白的PBS溶液；
(4)洗涤液ΤΝΤ溶液；配方组份0.05% (体积比)吐温-20，20 mmol/L Tris 一 HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2 ；
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。利用上述试剂盒检测T-2毒素的方法，具体步骤如下
(1)样品处理在Ig样品中加入样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min,5000 rpm离心10 min，上清液即为含样品的提取液；
含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂；，酶标抗原试剂使用前先稀释，每5ml BSA试剂中加入Ιμ T-2-HRP偶联蛋白的PBS溶液；
系列浓度的Τ-2毒素标准试剂0. 04,0. 08,0. 16,0. 32,0. 64 μ g/mL各 100 μ L分别与100 μ L酶标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；
(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；
(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2- 6号孔为T-2毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗T-2毒素单链抗体；所述抗T-2毒素单链抗体制备步骤为从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成 cDNA，经PCR扩增抗体重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因，通过一段连接肽(Linker) 把Vh和\连接成单链抗体(scFv)，然后克隆到载体上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对T-2毒素具高亲和力的单链抗体。(4)洗涤每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置^iiin后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中T-2毒素的浓度，根据计算公式T-2毒素含量(μ g/g) =C*V / m，其中C-T-2毒素的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中 T-2毒素的含量。通过T-2毒素单链抗体上的E-tag将T_2毒素单链抗体与固定于酶标板上的抗 E-tag抗体结合，形成固相抗体；加入待测样品和抗Τ-2毒素酶标抗原试剂，样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测样品中抗原含量越高，则与固相抗体结合的越多，使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合，这样加入底物后就不显色或显色很浅，显色深者为阴性。如表1所示，随着所加入的标准浓度T-2毒素的浓度的逐步升高，相对应的吸光值OD值逐步减少。据此数据绘制的T-2毒素标准浓度曲线如图5所示，0D450 nm处吸光值与待测样品的浓度呈反比关系，因此根据待测样品的0D450 nm处吸光值就可判断其中含有的T-2毒素的浓度。如表1所示，进行分析。根据计算公式样品中T-2毒素含量(μ g/g) = C*V / m， 其中C-样品中T-2毒素的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m_样品质量，g ；计算样品中T-2毒素的含量。当样品提取液的体积为細1，样品质量为lg，吸光值为0.946时，T-2 毒素含量为0. 04*4 /1 = 0. 16 μ g/g。表1本发明的T-2毒素单链抗体的竞争ELISA检测
权利要求
1.一种基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒，其特征在于其试剂包括(1)样品提取液含50%(体积比)二甲基亚砜的生理盐水；(2)T-2毒素标准试剂含T-2毒素的样品提取液；(3)酶标抗原试剂含效价5000的T-2-HRP偶联蛋白的PBS溶液，保存于50%(体积比)甘油内，_20°C保存；使用时用BSA试剂稀释；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份0. 05% (体积比)tween-20，20 mmol/L Tris 一 HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；(6)显色底物配方组份250μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。
2.一种使用权利要求1所述的基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒的方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)样品处理在0.5 1.5 g样品中加入2 6 ml样品提取液，液氮或机械研磨粉碎后，超声萃取、 离心，上清液即为含样品的提取液；含样品的提取液与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成A试剂；所述酶标抗原试剂使用时先用BSA试剂稀释，5ml BSA试剂中加入1 μ 1 T-2-HRP偶联蛋白的PBS溶液；Τ-2毒素标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成系列浓度的B试剂；(2)试剂平衡将试剂盒平衡至室温；(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2— 6号孔为Τ-2毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗Τ-2毒素单链抗体；(4)洗涤每孔内加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50yL，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中T-2毒素的浓度，根据计算公式T-2毒素含量(μ g/g) = C*V / m，其中C-T-2毒素的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；从而计算样品中T-2毒素的含量。
3.根据权利要求2所述的基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒的使用方法，其特征在于所述抗T-2毒素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本发明提供了一种基因工程单链抗体检测T-2毒素的试剂盒及方法，本发明的试剂盒中，其试剂包括其试剂包括样品提取液、标准试剂、酶标抗原试剂、洗涤液、BSA试剂、显色底物、终止液。通过样品处理、试剂平衡、洗涤、加样、洗涤、显色、终止，计算样品中T-2毒素的含量。本发明的试剂盒中采用的T-2毒素单链抗体可以在大肠杆菌中高效表达，并可大规模生产，制备过程简便易行，省时省力省钱。利用本发明的试剂盒检测T-2毒素，在1.5-2h内即可确定样品是否受T-2毒素污染，以及计算所含T-2毒素的量，使用方便快捷，成本低廉。
文档编号C07K19/00GK102162813SQ20111002281
公开日2011年8月24日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者庄振宏, 张薇, 杨燕凌, 林玲, 汪世华, 袁军, 高媛媛 申请人:福建农林大学