专利名称：具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及一种能促血小板生成的具有 高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
血小板在机体生命活动中发挥着重要作用，血小板减少可引起出血、感染，甚至危 及生命。随着社会的发展，血小板减少症患者越来越多见，资料表明，绝大多数血小板减少 症的发生都是由于血小板生成障碍所致。血小板的前体是巨核细胞，其生成过程遵循造血 干细胞典型的阶段式分化模式骨髓造血干细胞_早期髓系共同祖细胞_巨核/红系祖细 胞_巨核祖细胞_巨核细胞_血小板。可见，巨核细胞增殖分化在血小板的生成过程中发 挥着重要角色。研究表明，血小板生成素(TP0)是巨核细胞增殖分化和血小板生成过程中最重要 的调控因子，它又称为巨核细胞生长与发育因子(MGDF)。体内外实验证实，TP0通过结合并 激活其受体-c-Mpl而发挥促进巨核细胞增殖分化和血小板生成的作用。c-Mpl是I型细 胞因子受体超家族的一员，主要表达于巨核系各分化阶段的细胞。然而，由于一种通过基因 工程制备并经聚乙二醇化的功能型TP0在临床试用过程中有诱导产生中和性TP0抗体的现 象，因此，至今美国FDA都未批准重组人TP0进入临床。在这种情况下，人们不得不寻找并 研发新一代的升血小板药物。TP0模拟肽(TMP)是一种与天然TP0完全不同源但生物活性却十分相似的短肽， 总共只有 14 个氨基酸残基组成(Cwirla SE et al，Science, 1997，276 :1696_1699)。体外 实验证实，该短肽与TP0受体-c-Mpl有着很高的亲和力，并能够刺激TP0细胞依赖株(Ba/ F3/c-Mpl)增殖与分化。研究表明，当两个c-Mpl形成同源二聚体时才能有效激活其下游 信号通路。因此，与单个TP0模拟肽相比，两个串联TP0模拟肽的促血小板生成活性更突出 (Cwirla SE et al，Science，1997，276 :1696_1699)。但由于 TPO 模拟肽分子量非常小，无 论是单个还是两个串联的TP0模拟肽在体内的代谢排除都很快，因而使其在体内的应用受 到限制。生长激素(GH)是一种具有广泛生理功能的生长调节因子，由于它可以有效动员 并刺激造血干和多系造血祖细胞(包括巨核系祖细胞)的增殖与分化，目前国内外的一 些单位已经尝试将重组人生长激素(rhGH)用于治疗肿瘤化/放疗所引起的全血细胞减少 (Sirohi B et al, Bone Marrow Transplant，2007，39 :115_120)。已知，生长激素生物学 功能的发挥主要是通过其受体-GHR介导完成，而且GHR也是I型细胞因子受体超家族的一 员。GHR与TP0受体c-Mpl所激活的信号通路一样，都需要有蛋白激酶JAK2的参与和反馈 调节。因此，GHR与c-Mpl信号通路之间可能会存在着一定的交叉对话和相互调节作用。已经授权的发明专利ZL200510057217.7，我们将单个TP0模拟肽与人生长激素分 子进行融合，通过基因工程方法制备出重组融合蛋白rTMP-GH。由于TPO模拟肽可以识别并 结合巨核细胞表面的TP0受体c-Mpl，因此，在该融合蛋白中单个TP0模拟肽主要是发挥靶
3向引导人生长激素分子至巨核细胞的作用。由于单个TP0模拟肽只能结合一个c-Mpl，所以 不能有效激活其受体信号通路，使得rTMP-GH融合蛋白主要通过人生长激素分子发挥升血 小板作用，其生物利用低，作为药剂时用量大、毒副作用较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种能促血小板生成的具有高效升血小板作用的融合蛋白 及其制备方法，该融合蛋白由两个串联的TP0模拟肽和一个人生长激素分子构成，能显著 提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作为药剂时用量小、毒副作用小。本发明可以大 大减少治疗周期和治疗时间，并且所述融合蛋白升血小板的效果更显著。本发明的技术方案是具有高效升血小板作用的融合蛋白，由两个串联的TP0模拟肽和一个人生长激素 分子组成。其中，两个TP0模拟肽的氨基酸序列相同，均由14个氨基酸组成(序列表SEQ ID NO 1)；人生长激素分子则是由191个氨基酸组成(序列表SEQ ID NO 2)。所述融合蛋白的两个TP0模拟肽可以通过C-C端(尾-尾)串联，也可以通过C-N 端(尾-头)串联，而且在两个TP0模拟肽之间设有3-15个氨基酸组成的桥接肽，其中以 Pro-Ser-Gly-Pro 4个氨基酸组成的桥接肽为优选。所述融合蛋白的两个TP0模拟肽的串联体与人生长激素分子之间设有3-15个氨 基酸组成的桥接肽，其中以Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 6个氨基酸组成的桥接肽为优选。所述由两个串联的TP0模拟肽和一个人生长激素分子组成的融合蛋白有四种组 成形式，第一种形式是两个TP0模拟肽尾-头相连形成的TP0模拟肽串联体位于融合蛋白 的N-末端，人生长激素位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID N0:3)；第二种形式是两 个TP0模拟肽尾-尾相连形成的TP0模拟肽串联体位于融合蛋白的N-末端，人生长激素 位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO 4)；第三种形式是人生长激素位于融合蛋白 的N-末端，两个TP0模拟肽尾-头相连形成的TP0模拟肽串联体位于融合蛋白的C-末端 (序列表SEQ ID N0:5)；第四种形式是人生长激素位于融合蛋白的N-末端，两个TP0模拟 肽尾-尾相连形成的TP0模拟肽串联体位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO 6)； 其中优选的是前两种形式。编码本发明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ ID NO :7_10)和携带该DNA序列的
重组表达载体。制备、表达本发明所述融合蛋白的方法，其中表达本发明融合蛋白的宿主可以是 细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是大肠杆菌；对于重组表达的本发明融合蛋白可 以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括离心、超滤及液相层 析等技术，其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。本发明所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用，这些药物载体包括 水、盐水、糖类等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水液体制剂和含水量低 于10%或不含水的冻干制剂，这些药物制剂可以通过静脉输注或注射(包括皮下和肌肉注 射)进行给药。本发明采用两个TP0模拟肽的串联体与人生长激素分子进行融合，TP0模拟肽串 联体不仅可以发挥靶向结合巨核细胞的作用，而且还能同时激活两个相临的c-Mpl，从而有
4效激活TP0受体信号通路，即两个c-Mpl形成的同源二聚体能有效激活其下游信号通路，刺 激巨核细胞增殖分化和生成血小板。此外，激活的TP0受体信号通路还可以通过交叉对话 与GHR信号通路进行相互调节，从而使两者在促进巨核细胞增殖分化和血小板生成方面的 作用得到协同加强。由于两个串联的TP0模拟肽可以更有效地激活其受体和下游信号通 路，因此，本发明所述由两个串联TP0模拟肽与人生长激素分子构成的融合蛋白(TMP2-hGH 融合蛋白)与单个TP0模拟肽和人生长激素分子构成的融合蛋白(TMP-GH融合蛋白)相比 较，在促巨核细胞增殖分化方面的作用会更加突出，升血小板的效果将更显著。动物实验表 明，本发明所述的TMP2-hGH融合蛋白与TMP-GH融合蛋白相比，TMP2_hGH融合蛋白可以提前 6天的时间使急性放射损伤小鼠外周血血小板水平恢复至正常值的70%。本发明可以大大 减少治疗周期和治疗时间，为抢救危重病人赢得宝贵的时间。本发明有益效果是1、两个串联的TP0模拟肽能够有效激活巨核系细胞表面的TP0受体c-Mpl，从而启 动TP0受体依赖的促巨核细胞增殖分化和血小板生成反应；而生长激素分子可以通过结合 并激活其自身受体GHR，从而启动非TP0受体依赖方式的促巨核细胞增殖分化和血小板生 成反应。此外，TP0受体与GHR信号通路之间还会通过交叉对话进行相互调节和协同加强 作用。因此，本发明的融合蛋白具有强效的促巨核细胞增殖分化和血小板生成作用。2、通过与人生长激素分子进行融合，可以使两个TP0模拟肽串联体的分子量显著 增加，从而延长其在体内的生物半排期，提高其在体内的作用效果。3、通过与TP0模拟肽进行融合，可以使人生长激素分子靶向作用于巨核细胞，从 而显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作为药剂时用量小、毒副作用小。本发明的融合蛋白用于制备治疗药物制剂可用于治疗多种原发性或继发性血小 板减少症等疾病，这些疾病包括再生障碍性贫血、白血病、淋巴瘤、原发性血小板减少性紫 癜、慢性肾病、急性放射病、肿瘤放化疗引起的血小板减少等。下面用实施例来进一步说明本方明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于 此。
图1为pBV220/TMP2_hGH重组质粒的构建；图2为纯化所得TMP2_hGH融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；图3为TMP2_hGH融合蛋白的升血小板活性分析结果。
具体实施例方式材料和试剂1. Pyrobest DNA Polymerase PCR 试剂盒(Takara 公司产品，中国大连)2. QIAprep Spin质粒提取试剂盒(QIAGEN公司，美国)3. DNA胶回收试剂盒(Omega公司，美国)4. T4DNA连接酶试剂盒(Takara公司产品，中国大连)5. EcoR I.Sal I限制性核酸内切酶(New England BioLabs公司产品，美国)6. pMD-hGH质粒(本室保存)
7.质粒载体pbv220(由中国预防医学科学院病毒研究所提供)
8.大肠杆菌DH5a(本室保存，其构建方法参见申请号为200510057217. 7发明专
9.氨苄青霉素(roche公司产品，德国)
10.尿素、mgs04(上海生工生物工程公司)
11.sp阳离子层析柱、q阴离子层析柱、supdex 75层析柱(ge公司产品，美国)
12.酵母提取物、胰蛋白胨(oxford公司产品，美国)
13.lb培养基 酵母提取物5g 胰蛋白胨 10g nacl10g
溶于1000ml去离子水中，并用lmol/l的naoh调节ph值至7.0，高压蒸气灭菌。
14.发酵培养基
酵母提取物20g胰蛋白胨10gkh2po42. 3gna2hp0413g甘油20g
利) 列以含有人生长激素的质粒pmd-hgh(本室保存，其构建方法参见申请号为 200510057217. 7发明专利)为模板，通过pcr扩增将编码tp0模拟肽和桥接肽的dna序列 加载到hgh的n-末端。所用pcr引物序列如下p1 5' -att gag gga cca aca tta cgt cag tgg ctg get gca cgt get ccaggt tct ggt tct ggt ttc cca act att cca ctg agt c~3'p2 -gca rrt cra cat tta gaa gcc aca cga ccc ttc~3'在pi中黑体部分为编码tp0模拟肽(序列表seq id n01)的核苷酸序列，斜体部 分为编码桥接肽pro-gly-ser-gly-ser-gly的核苷酸序列，3'-末端正规体部分为人生长 激素的上游特异性引物序列。在p2中下画线部分为内切酶sal i的识别位点，3'-末端 正规体部分为人生长激素的下游特异性引物序列。pcr引物由上海生工生物工程公司合成。如图1所示，以pmd-hgh质粒dna为模板，以p1和p2为上、下游引物进行pcr扩 增。pcr扩增条件如下第一阶段95°c预变性5分钟；第二阶段94°c变性1分钟，55°c退火
溶于1000ml去离子水中，并用lmol/l的naoh调节ph值至7.0，高压蒸气灭菌。
15.包涵体洗涤液 tris20mm edta 10mm triton x-100 0. 5%
16.重组tmp-hgh融合蛋白(构建过程见申请号为200510057217.7的发明专利) 实施例1 重组表达质粒pbv220/tmp2-hgh的构建及鉴定
(1)首先获得编码一个tp0模拟肽与人生长激素的融合蛋白(tmp-hgh)的基因序
61分钟，72°C延伸1分钟，循环32次；第三阶段72°C延伸5分钟，10°C放置10分钟。所获得 PCR产物经琼脂糖电泳检测为650bp左右，回收PCR产物。(2) pBV220/TMP2-hGH 重组质粒的获得如图1所示，以上一步所得PCR产物为模板，通过再次PCR扩增将编码第二个TP0 模拟肽和桥接肽的编码序列加载至TMP-hGH的N-末端。所用PCR引物序列如下P3 5' -gag gaa ttc atg ate gaa ggt cct act ctg aga cag tgg ctg getgea
cgt get cca tct ggt cca att gag gga cca aca tta cg-3'P2 -gca ggt cga cat tta gaa gcc aca cga ccc ttc~3'在P3中下画线部分为EcoR I酶切位点识别序列，黑体部分为编码TPO模拟肽(序 列表SEQ ID N01)的核苷酸序列，加框部分为翻译起始密码子序列，斜体部分为编码桥接肽 Pro-Ser-Gly-Pro的核苷酸序列，3'-末端正规体部分为编码第一个TP0模拟肽的N-端部 分氨基酸的DNA序列。在P2中下画线部分为内切酶Sal I的识别位点，3'-末端正规体 部分为人生长激素的下游特异性引物序列。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增反应条件同前，胶回收所得PCR产物并进行EcoR I和Sal I双酶切。 酶切后的PCR产物与经EcoR I和Sal I双酶切后的质粒载体pBV220进行连接，连接 产物通过电转化法转化DH5 a大肠杆菌感受态细胞。挑菌并培养过夜，提取质粒DNA， 经EcoR I和Sal I双酶切后可见700bp左右DNA片段出现。对此重组质粒进行序列测 定，测序结果表明在PBV220质粒的EcoR I和Sal I位点之间插入有与序列信息表SEQ ID N07碱基序列一致的DNA片段。该重组质粒命名为pBV220/TMP2-hGH，其表达的融合 蛋白N端为两个串联的TP0模拟肽，C端为人生长激素，在第一个TP0模拟肽与第二个 TP0模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第二个TP0模拟肽与人生长激素之间有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 进行连接。实施例2 :TMP2-hGH融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化(1)高表达TMP2_hGH融合蛋白的阳性菌株筛选挑取至少10个转化有pBV220/TMP2_hGH重组质粒的DH5 a大肠杆菌单克隆，接 种于含有2ml LB培养基的摇菌管中，32°C恒温摇床振荡培养过夜，次日取lOOul过夜菌按 1 10比例接种于新鲜LB培养基中，32°C恒温摇床振荡培养24小时，之后更换温度至42°C 进行诱导表达5小时。12000rpm离心2分钟收菌，700MPa进行高压勻浆破菌，12000rpm离 心20分钟提取包涵体蛋白，包涵体洗涤液洗涤包涵体蛋白，然后用含6N尿素的20mM TRIS 缓冲液(PH8. 0)溶解包涵体，样品进行12% SDS-PAGE电泳。选择蛋白表达水平表达最高的 菌株为后续发酵的种子菌。(2)工程菌发酵将筛选出的种子菌株划线接种于LB平板，挑取外观优良的单个 菌落接种于10ml LB培养基，37°C恒温摇床振荡培养8小时，之后将10ml培养液按1 10 比例放大至100ml LB培养基进行培养，37°C恒温摇床振荡培养8小时后再次放大至1L LB 培养基进行培养，37°C继续振荡培养8小时，然后按1 10比例接种至装有10L发酵培养 基的15L发酵罐中(B. Braun公司，德国)进行发酵。发酵罐中加入10g MgS04，酵温度控制 在32°C，发酵5小时后，调节温度至42°C进行诱导表达5小时。(3) TMP2_hGH融合蛋白的纯化按前述方法离心收取菌体，并提取发酵菌包涵体蛋 白，用含6N尿素的20mM TRIS缓冲液(pH8. 0)溶解包涵体，然后用含1N尿素的20mM TRIS
7缓冲液(PH8. 0)透析12小时以复性目的蛋白，复性后样品上SP阳离子柱以吸附杂蛋白， 使融合蛋白流穿，收集含有融合蛋白的流穿液并上Q阴离子柱，使目的蛋白吸附，用0. 1N Nacl洗脱融合蛋白，洗脱峰收集液随后上Supdex 75分子筛层析柱，收集并获得纯化后的 融合蛋白。上述纯化所得融合蛋白经12% SDS-PAGE电泳检测可见大小为26KD的单一蛋白 带(图2)。HPLC显示为单一蛋白峰，纯度大于98%。实施例3 :TMP2-hGH融合蛋白的升血小板活性测定(1)复制血小板减少症小鼠实验动物模型以BALB/c小鼠为实验对象，6°Co y射 线5Gy全身一次性照射实验小鼠，复制辐射损伤致血小板减少症动物模型(这种情况常见 于急性放射病和肿瘤放疗所致的血小板减少症)。(2)实验分组实验动物分三组第一组照射后给予重组TMP2_hGH融合蛋白治疗，100ug/kg/d,皮下注射，连续用7 天；第二组照射后给予重组TMP-hGH治疗，100ug/kg/d,皮下注射，连续用7天；第三组为生理盐水对照组。(3)方法与结果照射后7天开始小鼠尾静脉取血，每次取血10ul，于西南医院 血液科血球计数仪上进行血小板计数分析。结果发现，本发明融合蛋白TMP 2-hGH可以显 著抑制受照射小鼠外周血血小板的减少，其升高血小板的速度和幅度显著优于融合蛋白 TMP-hGH(图3)。各组小鼠外周血血小板计数恢复至70%正常水平的时间分别为本发明 融合蛋白TMP2-hGH治疗组为照后第16天，TMP-hGH治疗组为照射后第22天，生理盐水对照 组为照后第26天。可见，与TMP-GH相比，本发明TMP2-hGH融合蛋白可以提前6天时间使 急性放射损伤小鼠外周血血小板水平恢复至正常值的70%。结论本发明所述TMP2_hGH融合蛋白与TMP-hGH融合蛋白相比较，本发明所述融 合蛋白升血小板活性更强，能显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，减少用量、降 低毒副作用。所述TMP2-hGH融合蛋白可以大大减少治疗周期和治疗时间，并且升血小板的 效果更显著，更适用于治疗原发性和继发性血小板减少症疾病。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法<130><160>10<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>14<212>PRT<213>Artificial<220><223>TP0模拟肽的氨基酸序列<400>1lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala
80096]15100097]<210>20098]<211>1910099]<212>PRT0100]<213>人生长激素的氨基酸序列0101]<400>20102]Phe Pro ThrlieProLeuSerArgLeuPheAspAsnAlaMetLeu0103]1510150104]Arg Ala HisArgLeuHisGinLeuAlaPheAspThrTyrGinGlu0105]2025300106]Phe Glu GluAlaTyrlieProLysGluGinLysTyrSerPheLeu0107]3540450108]Gin Asn ProGinThrSerLeuCysPheSerGluSerlieProThr0109]5055600110]Pro Ser AsnArgGluGluThrGinGinLysSerAsnLeuGluLeu0111]6570750112]Leu Arg lieSerLeuLeuLeulieGinSerTrpLeuGluProVal0113]8085900114]Gin Phe LeuArgSerValPheAlaAsnSerLeuValTyrGlyAla0115]951001050116]Ser Asp SerAsnValTyrAspLeuLeuLysAspLeuGluGluGly0117]1101151200118]lie Gin ThrLeuMetGlyArgLeuGluAspGlySerProArgThr0119]1251301350120]Gly Gin liePheLysGinThrTyrSerLysPheAspThrAsnSer0121]1401451500122]His Asn AspAspAlaLeuLeuLysAsnTyrGlyLeuLeuTyrCys0123]1551601650124]Phe Arg LysAspMetAspLysValGluThrPheLeuArglieVal0125]1701751800126]Gin Cys ArgSerValGluGlySerCysGlyPhe0127]1851900128]<210>30129]<211>2290130]<212>PRT0131]<213>Artificial0132]<220>0133]<223>融合蛋白-1 K氨基酸序列，其中两个TP0模拟肽尾-头相连的串联体位于融合蛋白的N_末端，人生长激素位于融合蛋白的C_末端。在两个TP0模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第二个TP0模拟肽与人生长激素之间有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 进行连接
0134]<400>30135]lie GluGlyProThrLeuArgGinTrpLeuAlaAlaArgAlaPro0136]1510150137]Ser GlyProLieGluGlyProThrLeuArgGinTrpLeuAlaAla0138]2025300139]Arg AlaProGlySerGlySerGlyPheProThrlieProLeuSer0140]3540450141]Arg LeuPheAspAsnAlaMetLeuArgAlaHisArgLeuHisGin0142]5055600143]Leu AlaPheAspThrTyrGinGluPheGluGluAlaTyrliePro0144]6570750145]Lys GluGinLysTyrSerPheLeuGinAsnProGinThrSerLeu0146]8085900147]Cys PheSerGluSerlieProThrProSerAsnArgGluGluThr0148]951001050149]Gin GinLysSerAsnLeuGluLeuLeuArglieSerLeuLeuLeu0150]1101151200151]lie GinSerTrpLeuGluProValGinPheLeuArgSerValPhe0152]1251301350153]Ala AsnSerLeuValTyrGlyAlaSerAspSerAsnValTyrAsp0154]1401451500155]Leu LeuLysAspLeuGluGluGlylieGinThrLeuMetGlyArg0156]1551601650157]Leu GluAspGlySerProArgThrGlyGinliePheLysGinThr0158]1701751800159]Tyr SerLysPheAspThrAsnSerHisAsnAspAspAlaLeuLeu0160]1851901950161]Lys AsnTyrGlyLeuLeuTyrCysPheArgLysAspMetAspLys0162]2002052100163]Val GluThrPheLeuArglieValGinCysArgSerValGluGly0164]2152202250165]Ser CysGlyPhe0166]<210>40167]<211>2290168]<212>PRT0169]<213>Artificial0170]<220>
<223>序列特征融合蛋白-2的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-尾相 连的串联体位于融合蛋白的N-末端，人生长激素位于融合蛋白的C-末端。在两个TPO 模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第二个TPO模拟肽与人生长激素之间有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 进行连接。<400>4lie Glu Gly ProThr Leu ArgGln Trp Leu AlaAla Arg Ala Pro151015Ser Gly Pro Ala Arg Ala AlaLeu Trp Gln ArgLeu Thr Pro Gly202530Glu lie Pro Gly Ser Gly SerGly Phe Pro Thrlie Pro Leu Ser354045Arg Leu Phe AspAsn Ala MetLeu Arg Ala HisArg Leu His Gln505560Leu Ala Phe AspThr Tyr GlnGlu Phe Glu GluAla Tyr lie Pro657075Lys Glu Gln LysTyr Ser PheLeu Gln Asn ProGln Thr Ser Leu808590Cys Phe Ser Glu Ser lie ProThr Pro Ser AsnArg Glu Glu Thr95100105Gln Gln Lys Ser Asn Leu GluLeu Leu Arg lieSer Leu Leu Leu110115120lie Gln Ser TrpLeu Glu ProVal Gln Phe LeuArg Ser Val Phe125130135Ala Asn Ser Leu Val Tyr GlyAla Ser Asp SerAsn Val Tyr Asp140145150Leu Leu Lys AspLeu Glu GluGly lie Gln ThrLeu Met Gly Arg155160165Leu Glu Asp Gly Ser Pro ArgThr Gly Gln liePhe Lys Gln Thr170175180Tyr Ser Lys PheAsp Thr AsnSer His Asn AspAsp Ala Leu Leu185190195Lys Asn Tyr Gly Leu Leu TyrCys Phe Arg LysAsp Met Asp Lys200205210Val Glu Thr PheLeu Arg lieVal Gln Cys ArgSer Val Glu Gly215220225Ser Cys Gly Phe<210>5<211>229<212>PRT
<213>Artificial<220><223>序列特征融合蛋白-3的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-头相 连的串联体位于融合蛋白的C-末端，人生长激素位于融合蛋白的N-末端。在两个TPO 模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第一个TPO模拟肽与人生长激素之间有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 进行连接。<400>5
Phe Pro Thr lie Pro Leu SerArg Leu Phe AspAsn Ala Met Leu151015
Arg Ala His Arg Leu His GlnLeu Ala Phe AspThr Tyr Gln Glu202530Pne Glu Glu Ala Tyr lie ProLys Glu Gln LysTyr Ser Phe Leu354045Gln Asn Pro Gln Thr Ser LeuCys Phe Ser Glu Ser lie Pro Thr505560Pro Ser Asn Arg Glu Glu ThrGln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu657075Leu Arg lie Ser Leu Leu Leulie Gln Ser TrpLeu Glu Pro Val808590Gln Phe Leu Arg Ser Val PheAla Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala95100105Ser Asp Ser Asn Val Tyr AspLeu Leu Lys AspLeu Glu Glu Gly110115120lie Gln Thr Leu Met Gly ArgLeu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr125130135Gly Gln lie Phe Lys Gln ThrTyr Ser Lys PheAsp Thr Asn Ser140145150His Asn Asp Asp Ala Leu LeuLys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys155160165Phe Arg Lys Asp Met Asp LysVal Glu Thr PheLeu Arg lie Val170175180Gln Cys Arg Ser Val Glu GlySer Cys Gly PhePro Gly Ser Gly185190195Ser Gly lie Glu Gly Pro ThrLeu Arg Gln TrpLeu Ala Ala Arg200205210Ala Pro Ser Gly Pro Lie GluGly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu215220225Ala Ala Arg Ala<210>6
<211>229<212>PRT<213>Artificial<220><223>序列特征融合蛋白-4的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-尾相 连的串联体位于融合蛋白的C-末端，人生长激素位于融合蛋白的N-末端。在两个TPO 模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第一个TPO模拟肽与人生长激素之间有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 进行连接。<400>6Phe Pro Thr lie Pro Leu SerArg Leu PheAsp Asn Ala Met Leu151015Arg Ala His Arg Leu His GlnLeu Ala PheAsp Thr Tyr Gln Glu202530Phe Glu Glu Ala Tyr lie ProLys Glu GlnLys Tyr Ser Phe Leu354045Gln Asn Pro Gln Thr Ser LeuCys Phe SerGlu Ser lie Pro Thr505560Pro Ser Asn Arg Glu Glu ThrGln Gln LysSer Asn Leu Glu Leu657075Leu Arg lie Ser Leu Leu Leulie Gln SerTrp Leu Glu Pro Val808590Gln Phe Leu Arg Ser Val PheAla Asn SerLeu Val Tyr Gly Ala95100105Ser Asp Ser Asn Val Tyr AspLeu Leu LysAsp Leu Glu Glu Gly110115120lie Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu AspGly Ser Pro Arg Thr125130135Gly Gln lie Phe Lys Gln ThrTyr Ser LysPhe Asp Thr Asn Ser140145150His Asn Asp Asp Ala Leu LeuLys Asn TyrGly Leu Leu Tyr Cys155160165Phe Arg Lys Asp Met Asp LysVal Glu ThrPhe Leu Arg lie Val170175180Gln Cys Arg Ser Val Glu GlySer Cys GlyPhe Pro Gly Ser Gly185190195Ser Gly lie Glu Gly Pro ThrLeu Arg GlnTrp Leu Ala Ala Arg200205210Ala Pro Ser Gly Pro Ala Arg Ala Ala LeuTrp Gln Arg Leu Thr215220225
Pro Gly Glu lie<210>7<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>编码融合蛋白-1 (SEQ ID NO 3)的DNA序列<400>7atgatcgaag gtcctactct gagacagtgg ctggctgcac gtgctccatc tggtccaatt 60gagggaccaa cattacgtca gtggctggct gcacgtgctc caggttctgg ttctggtttc 120ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 180caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 240tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 300tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 360ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 420gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 480cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 540acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 600ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 660tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc t a a 693<210>8<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>编码融合蛋白_2 (SEQ ID NO 4)的DNA序列
<400>8
atgatcgaag gtcctactct gagacagtgg ctggctgcac gtgctccatc tggtccagct 60cgtgcagctc tgtggcagcg tttaacacca ggagagattc caggttctgg ttctggtttc 120ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 180caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 240tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 300tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 360ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 420gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 480cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 540acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 600ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 660tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc t a a 693<210>9<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>编码融合蛋白_3 (SEQ ID NO 5)的DNA序列<400>9atgttcccaa ctattccact gagtcgcctg ttcgataacg cgatgctgcg tgcgcatcgt 60ctgcaccaac tggctttcga cacttaccag gagttcgaag aagcatacat cccgaaagaa 120cagaaataca gcttccttca gaacccacag acctcgttgt gtttctctga aagtatcccg 180 accccttcta accgcgaaga gacccagcag aaatcgaacc ttgaactgct tcgtatctcg 240
ctgcttctca ttcagtcgtg gctggagcca gtacagttcc tgcgttcggt tttcgcaaac 300tcactggttt acggtgcgtc tgacagtaac gtttacgacc tgctgaaaga ccttgaagaa 360gggatccaga ccctgatggg tcgcctggaa gatggttcac cacgcactgg tcagatcttc 420aaacagactt actccaaatt cgatactaac tctcataacg atgatgctct gctgaaaaac 480tacggcctgc tgtactgttt ccgtaaagat atggataaag ttgaaacttt cctgcgtatc 540gttcagtgtc gttctgttga agggtcgtgt ggcttcccag gttctggttc tggtatcgaa 600ggtcctactc tgagacagtg gctggctgca cgtgctccat ctggtccaat tgagggacca 660acattacgtc agtggctggc tgcacgtgct t a a 693<210>10<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>编码融合蛋白_4(SEQ ID NO 6)的DNA序列<400>10atgttcccaa ctattccact gagtcgcctg ttcgataacg cgatgctgcg tgcgcatcgt 60ctgcaccaac tggctttcga cacttaccag gagttcgaag aagcatacat cccgaaagaa 120cagaaataca gcttccttca gaacccacag acctcgttgt gtttctctga aagtatcccg 180accccttcta accgcgaaga gacccagcag aaatcgaacc ttgaactgct tcgtatctcg 240ctgcttctca ttcagtcgtg gctggagcca gtacagttcc tgcgttcggt tttcgcaaac 300tcactggttt acggtgcgtc tgacagtaac gtttacgacc tgctgaaaga ccttgaagaa 360gggatccaga ccctgatggg tcgcctggaa gatggttcac cacgcactgg tcagatcttc 420
aaacagactt actccaaatt cgatactaac tctcataacg atgatgctct gctgaaaaac 480
tacggcctgc tgtactgttt ccgtaaagat atggataaag ttgaaacttt cctgcgtatc 540gttcagtgtc gttctgttga agggtcgtgt ggcttcccag gttctggttc tggtatcgaa 600ggtcctactc tgagacagtg gctggctgca cgtgctccat ctggtccagc tcgtgcagct 660ctgtggcagc gtttaacacc aggagagatt t a a 693.
权利要求
一种具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于该融合蛋白由两个串联在一起的TPO模拟肽和一个人生长激素分子组成。
2.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于TPO模拟肽 的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；人生长激素的氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于两个TPO模 拟肽通过C-C端串联或通过C-N端串联。
4.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于两个串联的 TPO模拟肽位于该融合蛋白的N-末端，人生长激素位于该融合蛋白的C-末端；或两个串联 的TPO模拟肽位于该融合蛋白的C-末端，人生长激素位于该融合蛋白的N-末端。
5.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于两个串联的 TPO模拟肽之间以及TPO模拟肽与人生长激素分子之间均设有3-15个柔性氨基酸组成的桥 接肽。
6.编码权利要求1-5所述的融合蛋白的DNA序列。
7.包含权利要求7所述的DNA序列的重组表达载体。
8.制备权利要求1-5所述的融合蛋白的方法，包括将权利要求7所述的重组表达载体 转化、转染或转导宿主细胞，分离、纯化所述融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于原核表达为大肠杆菌，真核表达为酵母。
10.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于所述的融 合蛋白可以用于治疗多种原发性和继发性血小板减少症。
全文摘要
本发明涉及一种具有高效升血小板作用的融合蛋白，所述融合蛋白由两个串联在一起的TPO模拟肽和一个人生长激素分子构成。所述融合蛋白能显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，减少用量、降低毒副作用。本发明可以大大减少治疗周期和治疗时间，并且所述融合蛋白升血小板的效果更显著。所述融合蛋白用于药物制剂可用于治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病。
文档编号A61P7/00GK101812135SQ20091019145
公开日2010年8月25日 申请日期2009年11月11日 优先权日2009年11月11日
发明者王军平, 王崧, 申明强, 粟永萍, 许杨, 陈芳, 陈默 申请人:中国人民解放军第三军医大学