专利名称：一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
红细胞以及由其所产生的血红蛋白在机体生命活动中发挥着重要作用。促红细胞生成素(Erythropoiet in, ΕΡ0)是体内红细胞生成过程中最重要的调控因子,在正常成年人中EPO主要由肾脏产生。慢性肾衰时，肾脏产生EPO相对不足或不能分泌ΕΡ0，从而导致贫血。因此，应用重组人促红细胞生成素(rh-EPO)可以有效治疗肾性贫血。此外，rh-EPO还可用于实体瘤放/化疗所致贫血、外科手术红细胞动员、自体输血等的辅助治疗。
现有的重组EPO类药物，其生产都需要采用哺乳动物细胞系统进行表达和制备，原因是EPO分子必需经过翻译后的糖基化修饰才具有生物活性。与大肠杆菌和酵母表达系统相比，采用哺乳动物细胞表达系统生产目的蛋白的周期相对较长，成本也相对较高。EPO 模拟妝(Erythropoietin mimetic peptide, EMP)是 1996 年 Wrighton 等米用噬菌体展示技术从肽库中筛选出来的一种含有20个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与EPO完全不同源，但却能特异性结合EPO受体，尤其是该多肽的二联体能够有效激活EPO受体及相应的细胞内信号通路，从而产生与EPO相似的生物学功能(Wrighton, et al.，Science,1996，273: 458-463)。由于不需要糖基化修饰，所以无论是化学合成，还是通过细菌或酵母表达系统所制备出的EMP 二联体都具有较高的生物活性。然而，EMP的分子量较小，难以通过基因工程技术进行表达与制备，而且由于半衰期短，其体内应用效果也较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白可显著延长EMP 二联体半衰期，具有长效促红细胞生成的特性。本发明所述的促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，包含I个人血清白蛋白HSA和I个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP 二联体(dEMP)o人血清白蛋白HSA存在天然多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括这些多态型。优选地,所述促红细胞生成素模拟肽EMP具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述促红细胞生成素模拟肽EMP活性的氨基酸序列。优选地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA活性的氨基酸序列。优选地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP 二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-dEMP，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID N0:5所示。 优选地，所述EMP 二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为dEMP- HSA，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0:4所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID N0:6所示。优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间的连接肽均由1-30个氨基酸残基组成。
更优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间的连接肽由13个氨基酸残基组成，两个EMP之间的连接肽由4个氨基酸残基组成。更优选地,组成连接肽的氨基酸主要为Gly与Ser、Pro的组合。本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，主要包含步骤
1)获取编码EMP二联体和连接肽的基因序列，通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将该基因序列克隆至载体质粒I中，获得质粒2 ；
2)以含有HSA的质粒DNA为模版，通过PCR扩增获得两端带有合适限制性内切酶识别位点的HSA的cDNA片段；
3)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA的cDNA片段插入含有EMP 二联体的基因的质粒2中，获得含编码HSA与EMP 二联体的融合蛋白的基因的质粒3 ；
4)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因从质粒3亚克隆至表达载体质粒4中，获得含编码HSA与EMP 二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒5 ；
5)将步骤4)所述的重组表达质粒5转化感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。其中步骤I)的质粒I为可用于基因克隆的常见质粒载体，优选的是PUC57质粒。其中步骤4)的质粒4为可用于重组基因表达的常见质粒载体，优选酵母表达质粒载体，更优选的是PPICZa质粒。其中步骤5)所述宿主是酵母。本发明还涉及含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体。可用于携带编码本发明融合蛋白的基因的表达载体包括但不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。本发明还涉及含有上述重组表达载体的宿主表达系统。宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母；对于重组表达的本发明融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括离心、超滤及液相层析等技术，其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。人血清白蛋白(HSA)是血浆中的主要蛋白成分，是一种稳定的惰性蛋白，并且具有长达两周以上的血浆半衰期，因此，常被用做药物的载体。HSA由585个氨基酸残基组成，分子量为66. 5kDa,属于非糖基化单链蛋白(A. Dugaiczyk et al. , PNAS, 1982, 79:71-75)。HSA已被成功地在多种宿主中进行表达(EP330451和EP361991 )，尤其是人们已经实现了 HSA在酵母细胞中的高水平稳定表达。HSA在宿主细胞中是以一种原肽形式合成，其中由24个氨基酸残基组成的信号肽和前肽在转运和分泌过程中能够被自动切除。当目的多肽与HSA融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性，而且还可以增加多肽药物在体内的半衰期。通过与HSA进行融合表达，一些造血生长因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF以及干扰素等其它活性因子，都实现了药物作用的长效性(CN1727488A、CN1405181A、CN1405182A)。申请人:通过生物活性测定和代谢动力学分析实验表明，HSA-dEMP可以显著促进红细胞的增殖，而且在体内具有较长的半衰期，说明本发明所述融合蛋白保留了 EMP 二联肽的促红细胞增殖活性，并能在体内维持较长时间的发挥作用。因此，本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗慢性肾功能衰竭导致的贫血、肿瘤化疗导致的贫血、失血后贫血等的药物。本发明所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用，这些药物载体包括水、盐水、糖类、醇类及氨基酸等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水量低于3%或不含水的冻干制 剂。这些药物制剂可以用于肾性贫血和其它原因所致贫血的治疗，给药方式包括静脉输注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻内、呼吸道等，其中优选的是皮下或肌肉注射。本发明的优越性本发明采用基因重组技术，将两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP序列与人血清白蛋白HSA进行融合，HSA和EMP 二联体之间及两个EMP之间设置有合适长度的连接肽，通过与HSA融合不仅可以使EMP 二联体能够采用基因工程技术进行表达与制备，而且还可以达到显著延长EMP 二联体半衰期的目的。本发明在保持EMP 二联体较高生物活性的基础上，同时解决EMP 二联体的基因工程制备和半衰期短的难题。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图I为pPICZ a / HSA-dEMP重组质粒的构建流程；
图2为HSA-dEMP编码序列的5’端和3’端测序结果，其中A为5’端的测定序列包含了部分载体序列以及编码HSA信号肽、前肽和N端成熟肽的序列；B、C为3’端的测定序列，其中B显示的是编码HSA的C末端数个氨基酸及连接肽的序列，C显示的是编码EMP 二联体的序列；
图3为HSA-dEMP融合蛋白的Western blot鉴定分析，其中I为HSA标准品，2为纯化后的HSA-dEMP融合蛋白；
图4为纯化所得HSA-dEMP融合蛋白的SDS-PAGE纯度分析结果，其中M为蛋白Marker，I为纯化后的HSA-dEMP融合蛋白；
图5为HSA-dEMP融合蛋白的体外促EPO依赖细胞株UT-7/Epo增殖分化活性分析，其中I为空白对照组，2为化学合成的EMP 二联体多肽处理组，3为HSA处理组，4为HSA-dEMP融合蛋白处理组。图6为HSA-dEMP融合蛋白在大鼠体内的药代动力学分析。图7位HSA-dEMP融合蛋白对大鼠慢性肾性贫血的治疗作用分析。
具体实施例方式主要实验材料
1.限制性核酸内切酶I^Asu11,Not I,BamH I,Hind III，T4 DNA连接酶试剂盒为TaKara公司产品(中国大连)； 2.质粒DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品(美国)；
3.DNA胶回收试剂盒为Omega公司产品(美国)；
4.质粒载体pPICZα、毕赤酵母菌株Χ-33为Invitrogen公司产品(美国)；
5.大肠杆菌DH5a感受态细胞为Invitrogen公司产品(美国)；
6.pUC57/HSA质粒由本室构建并保存(发明专利201110420870.0)；
7.UT-7/Epo细胞购自协和医学大学基础医学细胞中心(北京)；
8.Zeocin 购自 Invitrogen 公司(美国)；
9.SP阳离子层介质、Q阴离子层析介质、疏水和分子筛等层析介质及层析柱为GE公司产品(美国)；
10.酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxford公司(美国)；
11.磷酸盐缓冲液
NaCl8g
KClO. 2g
Na2HPO41.44g
KH2PO4O. 24g
溶于1000ml去离子水中，并用浓HCl调节pH值至7. 4，高压蒸气灭菌。12.LB 培养基 酵母提取物 5g
胰蛋白胨IOg
NaClIOg
溶于IOOOml去离子水中，并用ImoI/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。13.YPD 培养基 酵母提取物 IOg
胰蛋白胨20g
Agar20g
溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入IOOml经滤器除菌后的20%的右旋糖和适当浓度的Zeocin。14.YPDS 培养基 酵母提取物 IOg 胰蛋白胨 20g
山梨糖醇182. 2g
溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入IOOml经滤器除菌后的20%的右旋糖和适当浓度的Zeocin。15.BMGY液体培养基 酵母提取物 IOg胰蛋白胨20g
无氨基酸酵母氮源 13. 4g 甘油IOg
磷酸钾26.631g
溶于IOOOml双蒸水中高压灭菌，冷至室温，调节pH至6. 0，4°C保存备用。实施例I :编码EMP 二联体及连接肽的cDNA序列的人工合成
I、首先根据EMP 二联体及连接肽的氨基酸序列推导出其对应的编码核苷酸序列，并根据毕赤酵母偏爱密码子对编码序列进行优化，为了便于与HSA基因进行融合，选择将紧临HSA的两个氨基酸(Gly、Ser)的编码序列设计为限制性内切酶及_7 I的识别位点(ggatcc);同时，为了便于克隆，在该编码核苷酸序列的5’端引入I酶切识别位点和保护性碱基，在3’端引入Afoi I和/Ziz7i/ III的酶切识别位点及保护性碱基，最终所得核苷酸序 列如下(SEQ ID N0:7)
aRCRaa ttcffga tccggc gga ggt gga tct gga ggc ggt gga tct ggt ggt ggaact tattcc tgc cat ttt ggt cct ctg aca tgg gtg tgt aaa cct cag gga ggt cca tctgga ccagga ggt aca tac tct tgt cac ttt gga cca tta act tgg gtt tgc aaa cca caa ggt ggataa gcg gcc gcg aag ctt tgc
其中，5’端和3’端最外侧3个碱基为保护性碱基序列，带下划线的碱基序列分别为EcoR 1和历/^ III酶切识别位点，带阴影的碱基序列分别为I和I酶切识别位点，斜体部分的碱基序列为编码连接肽的序列，加粗部分的碱基序列为编码EMP的序列。2、委托上海生工生物工程公司合成上述序列并将其装载到pUC57质粒中的及^7 I取Hind III酶切位点之间(pUC57质粒载体由上海生工生物公司提供)，获得质粒pUC57/dEMP ο实施例2 :编码HSA的cDNA片段的获得 I、设计合成HSA基因的PCR引物
Pl (SEQ ID NO:8) :5' -age Raa ttc ttc gaa acg atg aag tgg gta acc ttt atttcc ctt c -3'
P2 (SEQ ID NO:9) :5' -gat gga tcc taa gcc taa ggc age ttg ac_ 3'
其中Pl中下划线部分碱基为限制性内切酶I识别位点序列，阴影部分碱基为限制性内切酶II识别位点序列，加框部分碱基为翻译起始密码子序列；P2中阴影部分为限制性内切酶及 # I的识别位点序列。2、PCR 扩增
以pUC57/HSA质粒DNA为模版(pUC57/HSA质粒为本室保存，具体构建方法参见发明专利201110420870. O),以Pl和P2分别作为上、下游引物，进行PCR扩增。反应条件如下①变性94°C,5min ;②变性94°C，lmin ;③复性55°C, Imin ;④延伸72°C,2min 返回步骤“②”，35循环；⑥延伸72°C，IOmin,总循环次数为35次。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约I. 9kb大小的DNA条带，该条带即为编码HSA的cDNA片段，且其5’端带有I,Asu II的识别位点，3’端带有I的识别位点。实施例3 pPICZ a /HSA-dEMP重组表达载体的构建 I、编码HSA-dEMP的cDNA片段的克隆与测序将实施例I所得pUC57/dEMP质粒DNA以及实施例2所得HSA的PCR产物同时进行EcoR I + BamH I双酶切，胶回收酶切后的DNA片段，然后采用T4 DNA连接酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂于氨苄抗性LB板37 °C培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送上海生工生物工程公司测序，序列正确的克隆命名为pUC57/HSA-dEMP。2、酵母表达载体pPICZ a /HSA-dEMP的构建
提取上一步测序正确的pUC57/HSA-dEMP质粒DNA，A / II和I双酶切质粒DNA，胶回收HSA-dEMP对应的DNA片段。同时，Asw II和Afoi I双酶切pPICZ a -ACInvitrogen公司产品)质粒DNA，胶回收pPICZ a -A载体片段。采用Τ4 DNA酶将HSA-dEMP和pPICZ α -A载体进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，并进行Zeocin抗性筛选，提取质粒DNA，再用II和Afoi I双酶切鉴定，将能够切下约2. Okb大小DNA片段的质粒送上海生工生物工程公司进行测序验证。整个pPICZ a /HSA-dEMP重组表达质粒的构建流程如图I所示，所得阳性克隆质粒的测序结果如图2所示，由于编码HSA-dEMP的序列较长，为 了清楚显示测定序列的正确性，特别选择了关键部位的测序结果在图2中进行展示，其中A为5’端的测定序列包含了 pPICZ α载体的部分序列，以及编码HSA信号肽、前肽(前24个氨基酸对应的DNA序列)和N端成熟肽的序列；B、C为3’端的测定序列，其中B显示的是编码HSA的C末端数个氨基酸及连接肽的序列，C显示的是编码部分连接肽及EMP 二联体的序列。 采用限制性内切酶fee I对测序正确的pPICZ a /HSA-dEMP质粒DNA进行线性化，胶回收DNA大片断，转化X-33感受态细胞，然后接种于Zeocin抗性YPDS平板，30°C培养3天后挑取克隆，并进行PCR扩增和测序鉴定。选取6个以上的阳性克隆分别接种BMGY液体培养基，30°C进行培养表达，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，并用抗人HSA的单抗(R&D公司产品，美国)进行Western blot分析，显色阳性且分子量约为71kD左右蛋白条带即为HSA-dEMP融合蛋白(图3)，最后选择表达水平最高的菌株作为工程菌，并放置于_80°C进行保种冻存。实施例4: HSA-dEMP融合蛋白的表达与纯化
将实施例3筛选出的高表达HSA-dEMP融合蛋白的酵母工程菌种接种于YPDS平板，30°C过夜培养活化，然后挑取单个菌落接种于BMGY培养基，30°C振荡培养20h，然后按I 10转种并继续培养至0D_ 4，并以此菌液为种子液移种于装有基础盐培养基的15L发酵罐中(瑞士比欧公司)进行高密度发酵培养。每IL基础培养基中含有甘油50g、浓磷酸 12ml, KOH 2. 6g, CaSO4 · 2H20 O. 6g, K2SO4 9. 5g, MgSO4 · 7H20 7. 8g,生物素 0. 32mg, YTB溶液(内含有 65g/L 的 FeSO4 · 7H20,6g/L 的 CuSO4 · 5H20, 20g/L 的 ZnSO4 · 7H20,6g/L 的MnSO4 · 5H20和0. 5%的浓硫酸)2ml。发酵条件选择如下发酵温度控制在30°C，溶解氧控制在30% 40%之间，pH值控制在6. O以下，培养至甘油耗尽后开始流加甘油，继续培养至OD600 150时开始流加甲醇诱导，甲醇流加速率控制在1%左右。诱导表达72h后停止发酵，低温离心取上清，随后进行纯化。纯化按以下方法进行收集发酵上清并进行超滤层析，以去除部分色素、降低盐离子浓度和更换缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH=7. O);随后样品过SP Sepharose FastFlow柱进行阳离子交换层析,收集含有目的多肽的组分,然后再上Q Sepharose Fast Flow柱进行阴离子交换层析，最后进行Sephadex G_75凝胶层析，最终所得收集分离组分即为纯化的HSA-dEMP融合蛋白，分子量约为71KD (如图4所示)，HPLC测定其纯度大于95%。实施例5 HSA-dEMP融合蛋白的体外生物活性测性
以EPO依赖的细胞株UT-7/Epo为观察对象，采用CCK-8法(改良MTT法)检测HSA-dEMP融合蛋白对该细胞的促增殖活性，具体操作如下取对数生长期的UT-7/Epo细胞，离心洗涤，再用仅含10%胎牛血清的1640培养液重新悬浮细胞，培养18-24h后收集进行细胞计数，并按5X 105/ml转接至96孔U型板中，每孔IOOul。分别设立空白对照组(培养液中不含任何细胞因子)、HSA对照组(10nM)、EMP 二联肽处理组(IOnM)及等摩尔浓度的HSA-dEMP融合蛋白处理组(ΙΟηΜ)，每组6个复孔，置于37°C、5%C02孵箱培养，培养72h后每孔加入CCK-8试剂10ul，37°C、5%C02孵箱培养6h后于酶标仪490nm波长检测细胞光密度值并分析细胞的增殖情况。结果显示，HSA-dEMP可以显著促进红细胞的增殖(如图5所示)，说明本发明融合蛋白保留了 EMP 二联肽的促红细胞增殖活性。实施例6 HSA-dEMP融合蛋白在大鼠体内的代谢动力学分析
给Wistar大鼠体内皮下注射HSA-dEMP融合蛋白(150ug/kg)，于处理后2、12、24、48、72、96、120、144时间点取样采血，应用美国R&D公司的人HSA特异性ELISA检测试剂盒，通过免疫吸附方法检测大鼠血清中HSA-dEMP融合蛋白的浓度，并计算药代动力学参数，从而推导出HSA-dEMP融合蛋白在受试大鼠血液中的半衰期约为96h (如图6所示)。实施例7 HSA-dEMP融合蛋白对慢性肾衰大鼠贫血的治疗作用分析
参照文献方法(N印hron，1986，44: 230-234 ;中国生物制品杂志，1999，12 (I):32-35)，用含O. 75%腺嘌呤饲料喂养Wistar大鼠7周，复制慢性肾性贫血大鼠实验动物模型。之后，给予模型大鼠单次皮下注射HSA-dEMP融合蛋白，剂量为150ug/kg，同时设置生理盐水阴性对照组和化学合成EMP 二联肽(与HSA-dEMP融合蛋白等摩尔浓度剂量)处理组，分别于HSA-dEMP融合蛋白处理后的第7、14、21天尾静脉取血进行血常规测定。结果显示，单次给予HSA-dEMP融合蛋白治疗可以显著提升慢性肾衰大鼠外周血红细胞水平(如图7所示)，而单次给予等摩尔浓度的EMP 二联肽则无显著升红细胞作用，从而提示HSA-dEMP融合蛋白对慢性肾性贫血具有较好的救治效果。结论本发明所公开的HSA-dEMP融合蛋白及其制备方法在保持EMP 二联体较高生物活性的基础上，同时解决EMP 二联体的基因工程制备和半衰期短的难题，为EMP 二联体的临床应用奠定了基础。
权利要求
1.一种促红细胞生成素模拟肽EMP与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含I个人血清白蛋白HSA和I个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP 二联体(cEMP)。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述促红细胞生成素模拟肽EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
4.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述EMP 二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-dEMP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为dEMP-HSA，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
6.根据权利要求4或5中所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间的连接肽均由1-30个氨基酸残基组成。
7.权利要求I所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，有以下步骤 1)获取编码EMP二联体和连接肽的基因序列，通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将该基因序列克隆至载体PUC57质粒中，获得质粒pUC57/dEMP ； 2)以含有HSA的pUC57/HSA质粒的DNA为模版，通过PCR扩增获得两端带有合适限制性内切酶识别位点的HSA的cDNA片段； 3)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA的cDNA片段插入含有EMP 二联体的基因的质粒pUC57/dEMP中，获得含编码HSA与EMP 二联体的融合蛋白的基因的质粒 pUC57/HSA-dEMP ； 4)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因从质粒pUC57/HSA-dEMP亚克隆至表达载体质粒pPICZ a中，获得含编码HSA与EMP 二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒pPICZ a /HSA-dEMP ； 5)将步骤4)所述的重组表达质粒pPICZa /HSA-dEMP转化感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述宿主是酵母。
9.一种含有权利要求I所述的融合蛋白的编码基因的重组表达载体。
10.一种含有权利要求9所述的重组表达载体的宿主表达系统。
11.权利要求I所述的融合蛋白在制备治疗因慢性肾功能衰竭、肿瘤化疗及失血所导致贫血的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种促红细胞生成素模拟肽(EMP)与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法。所述融合蛋白由1个HSA和1个EMP二联体(dEMP)构成，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP二联体位于融合蛋白的C-末端，或EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，HSA位于融合蛋白的C-末端；在HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有由柔性氨基酸组成的连接肽。所述融合蛋白不仅具有显著促红细胞生成活性，而且具有较长的体内半衰期。
文档编号A61K38/10GK102796201SQ20121032914
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者赵景宏, 王军平, 申明强, 聂凌, 杨惠标 申请人:中国人民解放军第三军医大学