专利名称：胡桃醌在制备治疗自身免疫及炎症性疾病药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药应用技术领域，涉及中药单体胡桃醌(Juglone)在制备作为治疗自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病药物方面应用。
背景技术：
核桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)为胡桃科胡桃属落叶乔木,为珍贵的用材树种和重要的药源植物。胡桃醌(Juglone ；Nucin)又名5-羟基-1,4-萘醌;5_羟基-I,
4-萘二酮。是从胡桃楸新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基萘醌类化合物，是胡桃揪中主要的活性物质。胡桃揪皮为收敛药，对细菌性痢疾，骨结核等有一定疗效。近年来大量研究显示，胡桃醌有抗真菌、抗衣原体或HIV病毒、降血糖和杀虫等生物活性，而且具有抗肿瘤作用，其在对肝癌、肺癌、黑色素瘤、小鼠自发性胃癌等多种肿瘤细胞株有抑制作用，越来越被人们所重视。但是胡桃醌对自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病的影响尚未报道。因此，进一步开发胡桃醌免疫调节和抗炎症活性，有着非常重要的应用前景。多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点，好发于青壮年，发病年龄多在20 40岁，具有高致残率、高复发性的特点，部分患者病情呈进行性加重。因多发性硬化症会侵犯神经纤维的髓鞘、故临床症状端看受损神经纤维为何而决定。一般而言运动、感觉以及视觉的影响都很常见；若脑干及小脑系统的神经纤维受损、复视、吞咽困难、步履不稳、晕眩的症状亦可能发生。如果脊髓发炎、除了运动、感觉功能外、排泄的功能亦发生障碍。少数病患还会有癫痫及智能障碍的发生。迄今尚无肯定有效的治愈办法。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE, experimental autoimmuneencephalomyelitis)是多发性硬化(MS)的成熟动物模型，因其可模拟多发性硬化的病理发生和临床表现而被广泛应用。实验室常用致敏原多为脑或脊髓组织匀浆、髓鞘碱性蛋白成分或其多肽片段等，免疫对象多为啮齿类动物来构建EAE模型，不同的致敏原可产生发病症状不同的EAE模型，可根据其要建立的EAE模型的类型选择不同的致敏原及不同的被免疫对象。本实验选用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)作为抗原免疫C57BL/6小鼠制作M0G35-55-EAE小鼠模型。本实验中用到的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白虽然在髓鞘蛋白中含量很少，只占髓鞘蛋白成分的0. 01%-0. 05%，但由于MOG存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，具有高度免疫原性，且在构建EAE过程中发现，MOG是唯一能引起脱髓鞘抗体反应又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。因此，用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白去免疫小鼠可以建立发病机理及其临床症状同MS极其相似的EAE模型。目前，EAE/MS的病理发生机制还没有被完全了解，但是普遍认为EAE是由辅助性T细胞(THl和TH17)介导的自身免疫性炎症引起的中枢神经系统炎症性疾病，不同的辅助性T细胞的定向分化取决于树突状细胞来源的不同抗原信号刺激。树突状细胞是专职抗原提呈细胞，其主要功能是摄取、加工处理和提呈抗原，启动特异性免疫应答。成熟树突状细胞表面特征性标志位⑶IaXDl Ic和⑶83，可高表达MHC II / I类分子(人的MHC称为HLA)和共刺激分子(如CD80，CD86，其摄取、加工处理抗原能力弱，而提呈抗原、启动免疫应答能力强。树突状细胞能诱导初始T细胞活化，因此是机体特异性免疫应答的始动者。我们通过监测树突状细胞表面标记物⑶83，⑶86以及HLA-DR的表达来研究胡桃醌是否影响树突状细胞的成熟及功能。T细胞是免疫细胞中的较大群体，分为不同亚群(如CD4阳性和CD8阳性两大群体)。CD4阳性初始T细胞通过来源于树突状细胞的不同信号(如不同细胞因子)刺激，进而又定向分化为不同的T细胞亚型来行使不同的免疫功能。CD4阳性T细胞又分为辅助性T细胞和调节性T细胞。辅助性T细胞分为TH1，TH2，TH17三大群体。THl由IL-12或IFN- y刺激⑶4阳性初始T细胞，通过转录因子T-bet分化而来，THl细胞分泌IFN- y，可介导细胞免疫起始以及炎症反应。研究显示IFN-Y体内失衡可导致自身免疫性疾病的发生；TH2细胞由IL-4刺激⑶4阳性初始T细胞细胞，通过转录因子GATA-3分化而来，在机体中其主要通过分泌IL-4、IL-IO等抗炎因子来抑制炎性反应；TH17由TGF-P、IL-23及IL-6刺激⑶4阳性初始T细胞，通过转录因子ROR y t分化而来，TH17细胞分泌IL-17A，可介导炎症反应。因此，抑制炎性因子的释放和促进抗炎因子的分泌成为治疗自身免疫性疾病的方向之一。
发明内容
本发明的目的是公开一种胡桃醌(Juglone )在制备作为治疗自身免疫性、神经系统炎症性疾病药物方面的应用。其中胡桃醌在治疗自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病药物中的口服有效剂量优选为3 mg/Kg体重/天。按照人50-60Kg体重0. 15-0. 18g/天。本发明进一步公开了胡桃醌在制备治疗器官移植抑制免疫排斥药物中的应用。实验结果表明胡桃醌(Juglone)抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎脾脏中CDllb+抗原提呈细胞⑶83和MHC II的表达即抑制树突细胞表型成熟；它可以抑制免疫系统的激活，因此可以治疗自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥。本发明所述的自身免疫性疾病指的是免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫性疾病。本发明所述的免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫疾病指的是多发性硬化症(图1-8)、自身免疫性视网膜炎(图5-7)、视神经脊髓炎(图5-7)、系统性红斑狼疮(图
5-7)、桥本氏甲状腺炎(图5-7)、自身免疫性溶血性贫血(图5-7)、自身免疫性血小板减少症(图5-7)、重症肌无力(图5-7)、原发性胆汁性肝硬变(图5-7)、侵袭性慢性肝炎(图5-7)、慢性肾小球炎(图5-7)、肌炎(图5-7)、系统性硬化症(图5-7)。本发明所述的神经系统炎症性疾病指的是多发性硬化症(图1-8)、视神经脊髓炎(图5-7)和急性播散性脑脊髓炎(图5-7);因为本发明中所用实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型是研究这三种疾病的动物模型。其口服有效剂量优选为3 mg/Kg体重/天。本发明运用实验动物模型进行了大量的药理实验，实验结果表明胡桃醌可以降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病率、临床评分平均分、临床评分最高分和临床评分总分；降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的脊髓中IFN-Y分泌相关Thl细胞和IL-17A分泌相关Thl7细胞占CD4+T细胞的百分数；抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎MOG诱导的T细胞的增殖；降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎脾脏中CDllb+抗原提呈细胞CD83和MHC II的表达。实验性自身免疫脑脊髓炎是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎的实验动物模型，也是研究自身免疫和炎症性疾病的典型的动物模型。因此，本发明有望在临床上成为治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性炎症性疾病的药物。
图I为口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病率图；说明胡桃醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症、神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；
图2为口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病临床评分平均分数图；说明胡桃醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症、神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；
图3为口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病临床评分的最高分数图；说明胡桃醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症、神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；
图4为口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病临床评分的总分数图。说明胡桃醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症、神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；
图5为口服胡桃醌(Juglone，3mg/kg)降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的脊髓中IFN- y分泌相关Thl细胞占CD4阳性T细胞的百分数；说明胡桃醌可以治疗以辅助性T细胞THl亚群介导为特点的疾病；
图6为口服胡桃醌(Juglone，3mg/kg)降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的脾脏中IL-17A分泌相关Thl7细胞占CD4阳性T细胞的百分数；说明胡桃醌可以治疗以辅助性T细胞TH17亚群介导为特点的疾病；
图7为口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎不同浓度MOG诱导的脾脏中T细胞的增殖；说明胡桃醌可以治疗以T细胞介导为特点的自身免疫性疾病；
图8为口服胡桃醌(Juglone，3mg/kg)降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎脾脏中⑶Ilb+抗原提呈细胞⑶83和MHC II的表达；说明胡桃醌可以抑制抗原提呈细胞尤其是树突状细胞的成熟；可以抑制免疫系统的激活，因此可以治疗自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥(n=8只小鼠，图表示为平均值土标准差，*p〈0. 05, ** p〈0. 01, ***p〈0. 001，t 检验)。
具体实施例方式 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定，其中胡桃醌(Juglone)有市售，其它所用的试剂，除特别标注外均有市售。实施例I
I.I EAE小鼠模型的构建方法
(I)实验动物及来源
雌性野生型C57BL/6无病原体(SPF级)小鼠30只，6_8周龄，体重18_20g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于天津医科大学实验动物中心，小鼠的饲养环境为室温20-25°C，相对湿度为40%-60%。
(2)抗原佐剂乳化物的制备
100 Ii g M0G35-55 多妝和 500 u g 灭活的分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,结核杆菌，购自Difco公司)与100 ill生理盐水和100 ill Freund’s佐剂(购自SIGMA公司)完全混合，乳化。⑶实验分组
为研究胡桃醌在小鼠EAE动物模型中的药物作用，小鼠随机分四组，每组8只小鼠，分别为两个生理盐水对照组和两个3mg/kg/天胡桃醌给药组。一个对照组和一个胡桃醌给药组每天检查记录小鼠EAE发病情况和临床神经功能分级至免疫诱导后35天；另一个对照组和一个胡桃醌给药组在小鼠EAE发病高峰期即免疫诱导后第15天处死，取脊髓和脾脏。 (4)实验方法和步骤
a.小鼠后背皮下分2个点注射乳化剂(100 U I/点)。b.同时在当天尾静脉注射200ng的百日咳毒素。c.免疫48小时后每只小鼠再次尾静脉注射200ng百日咳毒素(pertussis toxin,购自 List Biological Laboratories)。d.胡桃醌给药组从免疫诱导后第7天开始每天用胡桃醌灌胃给药，剂量为3mg/kg/ 天。e. 7-14天后小鼠开始发生EAE。每天检查记录小鼠EAE发病情况和临床神经功能分级。(5) EAE小鼠模型临床评分标准
小鼠经MOG免疫后，隔日采用盲法由两名观察者，采用国际通用的5分评分制对小鼠进行临床评分，每天检查并记录疾病的临床神经功能分级，直至MOG免疫后35天。小鼠EAE动物模型神经功能评分具体标准如下0分，无明显异常，没有明显的临床症状；0. 5分，部分尾巴无力松弛；1分，完全尾巴瘫痪可见轻度笨拙；2分，后肢无力，行动迟缓，轻度共济失调；2. 5分，一条后肢瘫痪；3分，双侧后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可挪动；3. 5分，双侧后肢瘫痪，前肢无力；4分，双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪；5分，濒死状态或死亡。I. 2取脊髓做细胞内染色
(1)细胞准备
a.麻醉小鼠，无菌分离脊髓组织。b.用注射器活栓轻轻研磨脊髓完全破碎
c.细胞悬液用40 iim筛网过滤，并加2-3ml无血清RPMI1640培养基冲洗筛网两次。d. 1500转/分钟，离心5分钟收集细胞，弃上清，重悬细胞。e.用6mlRPMI1640完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为5x107ml
(2)刺激细胞因子分泌
a.每孔加入浓度为fcefeldin A(BFA) I u I/ml，100ng/ml佛波醇酯(PMA)和终浓度
IV- g/ml I丐离子霉素(Ionomycin) , 37。。，5% CO2 刺激 5 小时。(3)收集细胞进行细胞因子染色
a.1500rpm/min离心收集细胞,弃上清。b.充分重悬细胞后加入荧光标记表面抗体⑶4，4°C避光反应30分钟。
c.每管加入staining buffer (SB) lml, 1500转/分钟洗两次,弃上清。d.每管加入BD cytofix/prem试剂250 ii 1,4°C避光反应30分钟 e.每管加入BD cytoprem/wash试剂，1800转/分钟洗一次,弃上清。f.每管加入封闭液25 ill (其中包括20 U I 10%BSA和5 大鼠血清)，4°C避光反应30分钟。g.加入荧光标记的细胞因子抗体IFN-Y和IL-17A (及同型对照)，4°C避光反应30分钟。h.每管加入BD cytoprem/wash试剂，1800转/分钟洗一次,弃上清。i.每管加入SB Iml, 1800转/分钟洗一次，弃上清， j.细胞用2%PFA 200 u I重悬。
k.上流式细胞仪检测
I.3 MOG重刺激T细胞增殖 (I)脾细胞准备
a.麻醉小鼠，无菌分离脾脏组织。b.将脾脏放在40 筛网上，用注射器活栓轻轻研磨脾脏至完全破碎。c.加2_3ml无血清RPMI1640培养基冲洗筛网两次，将细胞悬液转移至15ml管中。d. 1500转/分钟，离心5分钟收集细胞，弃上清。e.加入I. 8ml无菌超纯水,迅速混勻后加入200 U I无菌的IOxPBS迅速混勻，裂
解红细胞。f. 1500转/分钟，离心5分钟离心收集细胞，弃上清。g.用预温的IXPBS (含0. 1%BSA)重悬细胞，调整细胞密度为lxl06/ml。 (2)标记CFSE标记细胞
a.每ml细胞中加入0. 4 ill的CFSE贮存液，终浓度为2 y M。b. 37 °C 孵育 10 分钟。c.加入5倍体积的预冷培养基，终止染色。d.冰上孵育5分钟。e. 1300转/分钟，离心5分钟收集细胞。f.用新鲜培养基洗3次。g.转移细胞至孔板中培养
(3)MOG重刺激细胞
a.加入不同浓度的MOG刺激(0，2，5，10，15,20 u g/ml)
b.72h后收集细胞，做流式检测。I. 4 CDllb 阳性 APC 表染 C083, CD86, MHC II
(I)脾细胞准备
a.麻醉对照组及胡桃醌治疗组小鼠，无菌分离脾脏组织。b.将脾脏放在40 筛网上，用注射器活栓轻轻研磨脾脏至完全破碎。c.加2-3ml无血清RPMI1640培养基冲洗筛网两次，将细胞悬液转移至15ml管中。d. 1500转/分钟，离心5分钟离心收集细胞，弃上清。e.加入I. 8ml无菌超纯水,迅速混勻后加入200 U I无菌的IOxPBS迅速混勻，裂解红细胞。f. 1500转/分钟，离心5分钟离心收集细胞，弃上清。g.用1640RPMI完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为lxl06/ml。(2) MOG重刺激细胞
a.加入同浓度的MOG刺激(20ii g/ml)
b.48h后收集细胞。(3)加入抗体染色
a. 1500转/分钟，离心5分钟离心收集细胞，弃上清。 b.每管加入封闭液25 ill (其中包括20 U I 10%BSA和5 大鼠血清)，4°C避光反应30分钟。c.每管加入荧光标记的细胞因子抗体⑶I Ib+和⑶83 (或⑶86，或MHC
II)(及同型对照)，4°C避光反应30分钟。d.每管加入I XPBS，1500转/分钟，离心5分钟洗2次，弃上清。e.细胞用 2%PFA 200 U I 重悬。f.流式细胞仪检测
实验结果胡桃醌可以降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病率(图I)、临床评分平均分(图2)、临床评分最高分(图3)和临床评分总分(图4);降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的脊髓中IFN- y分泌相关Thl细胞和IL-17A分泌相关Thl7细胞占⑶4+T细胞的百分数(图5，6);抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎MOG诱导的T细胞的增殖；降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎脾脏中⑶Ilb+抗原提呈细胞⑶83和MHC II的表达。因此，本发明涉及制备抑制免疫系统的药物，有望在临床上成为治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性炎症性疾病的药物。实施例2
胡桃醌50g与280g淀粉混合均匀，用淀粉浆(取淀粉220g用水制成淀粉浆)制颗粒，过筛，干燥，装胶囊。实施例3
胡桃醌80g与淀粉340g混合均匀，用淀粉浆(取淀粉2IOg用水制成淀粉浆)制颗粒，过筛，干燥，加6%。硬脂酸镁，混匀，压制成片，包薄膜衣即得。实施例4
胡桃醌100g、淀粉400g和纤维素适量过筛，并充分混合，将适量聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于60°C干燥，将羧甲基淀粉钠盐，6%。硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。
权利要求
1.胡桃醌在制备作为治疗自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病药物方面的应用。
2.胡桃醌在制备作为治疗器官移植抑制免疫排斥药物中的应用。
3.权利要求I所述的应用，其中所述的自身免疫性疾病指的是免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫性疾病。
4.权利要求3所述的应用，其中免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫疾病指的是多发性硬化症、自身免疫性视网膜炎、视神经脊髓炎、系统性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬变、侵袭性慢性肝炎、慢性肾小球炎、肌炎、系统性硬化症。
5.权利要求I所述的应用，其中神经系统炎症性疾病指的是多发性硬化症、视神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎。
6.权利要求5所述的应用，其胡桃醌有效剂量按照人体50-60Kg体重0.15-0. 18g/天。
全文摘要
本发明公开了胡桃醌(Juglone)在制备治疗自身免疫疾病药物方面的应用。本发明的实验结果表明胡桃醌可以降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病率、临床评分平均分、临床评分最高分和临床评分总分；降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的脊髓中IFN-γ分泌相关Th1细胞和IL-17A分泌相关Th17细胞占CD4+T细胞的百分数；抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎MOG诱导的T细胞的增殖；降低小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎脾脏中CD11b+抗原提呈细胞CD83和MHCⅡ的表达。因此，本发明涉及制备抑制免疫系统的药物，有望在临床上成为治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性炎症性疾病的药物。
文档编号A61P21/04GK102793690SQ201210329059
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者张荣信, 葛禛禛, 张凯, 薛振毅 申请人:天津医科大学