专利名称：棉铃虫增效蛋白基因工程菌株的构建及其增效蛋白的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及在大肠杆菌中表达棉铃虫颗粒体病毒(HaGV)增效蛋白，含有HaGV增效蛋白的基因的表达载体，在大肠杆菌中表达HaGV增效蛋白的方法。
目前，已在9种颗粒体病毒、舞毒蛾(Lymantria dispar)NPV和4种痘病毒中发现了昆虫病毒增效蛋白(enhancin)[1.2]。昆虫病毒增效蛋白是病毒基因编码的一种金属蛋白酶，分子量为89-10KD，具有一个典型的金属蛋白酶锌-结合域HEXXH，位置十分保守，且对中肠围食膜的降解作用受到金属螯合剂的抑制。[3.4]昆虫病毒增效蛋白可以提高昆虫的敏感性，加速核型多角体病毒NPV的感染进程，[5]同时能提高苏云金杆菌伴孢晶体对幼虫的毒力。[6]增效蛋白的作用机制有二种一种是增效蛋白能与中肠细胞膜上的特异位点结合，介导病毒囊膜与细胞质膜之间的融合，促进杆状病毒进入宿主细胞内，从而增加病毒感染的效果。[7-9]但增效蛋白与中肠细胞膜上的特异位点结合并不是增进病毒感染所必需的。[10，11]另一种机制是增效蛋白通过降解肠粘蛋白IIM而破坏昆虫幼虫中肠围食膜，使病毒粒子更容易进入中肠细胞，同时提高了某些必须穿透围食膜而发生作用的生物杀虫剂的效能。
目前，昆虫病毒增效蛋白实施的基因工程主要有三种方式1.将增效蛋白基因重组在AcMNPV等广谱高效的病毒中，构建含增效蛋白基因的重组AcMNPV。2.构建含增效蛋白基因的转基因植物，提高害虫对NPV的敏感性。3.在原核细胞中表达增效蛋白。表达产物形成包涵体晶体，稳定且易纯化。
本发明的目的是提供一种新型的含有HaGV增效蛋白基因的工程菌株、该菌株的构建方法，以及利用该菌株生产增效蛋白的方法。该工程菌株含有HaGV增效蛋白的基因的表达载体，并能有效表达HaGV增效蛋白。该工程菌株命名为Escherichia coli M15(pEHa)，已于2000年4月11同保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册号为CCTCC NOM 201010，该载体由下列DNA元件组成。
(1)棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因3′端2.1Kb片段。
(2)大肠杆菌质粒复制起始点。
(3)氨卡青霉素抗性基因。
(4)6个连续组氨酸编码区。
本发明用于构建HaGV增效蛋白的工程菌株的原材料有如下几种(1)HaGV，由美国汤姆·杰弗逊大学微生物学及免疫学系Zailin Yu博士赠送。
(2)pQE-30、E.coli M15(pREP4)，购自QIAGEN公司。
(3)T4DNA连接酶购自华美生物技术公司。
采用基因工程方法构建含HaGV增效蛋白基因的工程菌株，方法如下1.HaGV增效蛋白基因的扩增(1)HaGV DNA的提取取HaGV悬液100ul，加等体积0.04mol/L NaOH碱解液及终浓渡为1％SDS，56℃水浴处理10分钟，待悬液半透明后，用碱性酚、氯仿，异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液抽提HaGV DNA各一次，用预冷无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜，离心后用75％乙醇洗，干燥沉淀，将DNA溶于TE(10mMTris.1mMEDTA pH8.0)缓冲液中，-20℃保存。(2)HaGV增效蛋白基因的PCR扩增设计引物如下P15′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT 3′P25′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT 3′上述引物由上海生工公司合成。按B.M.公司Taq DNA Polymerase试剂(从栖热水生菌YT-1中提纯得到的耐热DNA多聚酶)操作手册，依次加入①10×PCR反应缓冲液10μl；②两种引物各2μl；③10mol/L dNTPs 2μl；④Taq DNA Polymerase(5U/μl)1μl；⑤补去离子水至100μl反应体积；⑥加石蜡油覆盖液面。
进行PCR扩增。反应条件为94℃预变性5min，PCR循环参数94℃、60秒；56℃、90秒，72.5℃、180秒，循环30次，最后一次循环在72.5℃延伸7min。经0.7％ Agarose电泳检测，得到单一的长约2.7Kb的HaGV增效基因片段。2.重组表达质粒pEHa的构建和酶切鉴定用Sac I/Pst I双酶切质粒pQE-30和PCR产物，PCR产物经Sac I/Pst I双酶切，产生0.6kb(HaGV enhancin gene 5′端片段)和2.1kb(HaGV enhancin gene 3′端片段)的两个片段，0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收2.1kb的片段和双酶切消化的质粒片段。用T4DNA连接酶于16℃水浴连接4h，转化感受态细胞Ecoli M15(pREP4)，经Ampcillin和Kanamycin双抗平板筛选得到阳性转化子。此构建的重组质粒命名为pEHa。
重组质粒pEHaDNA分别经Pst I，Sac I单酶切，BamHI/HindIII，KpnI/HindIII双酶切，0.7％琼脂糖电泳照相。
pEHa经PstI单酶切，得5.5kb的片段，宿主菌自身携带有质粒，pREP4(3.7kb)，pREP 4上具有Pst I的两个识别位点，经Pst I单酶切，得2.8kb和0.9kb片段；pEHa经Bam HI/HindIII双酶切，得3.4kb和2.1kb的片段，pREP4具有HlindIII单一酶切位点，无BamHI酶切位点，经HindIII单酶切，得3.7kb的片段，pEHa经Kpn I/HindIII双酶切，应得4.6kb和0.9kb的片段，pREP4上无Kpn I酶切位点，有HindIII单一酶切位点，凝胶电泳结果与预期相符，见图3。3.棉铃虫增效蛋白的表达及其纯化挑取重组子单菌落接种于5mL LB培养基中(Ampcillin 100μg/mL和Kanamycin 25μg/mL，下同)活化过夜。活化菌液以1∶20稀释接种到10mL LB中，37℃培养3h，加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导5h，取诱导5h和未诱导培养物各1mL，收集菌体进行SDS-PAGE。离心收集诱导后菌体，加裂解液(50mmol/L Tris-HCl PH8.0，0.1mol/L NaCl，2mg/g溶菌酶菌体蛋白)，溶菌酶37℃1h，水浴超声波破碎10min，处理液上蔗糖梯度30-60％，4000(r/min)×40min，取出白色包涵体带，洗糖3次，将包涵体样品稀释后于透射电镜下观察并照相，剩余样品4℃保存备用。
表达产物的10％ SDS-PAGE见图4，结果表明，含重组质粒的EscherichiacoliM15(pEHa)菌表达了含增效蛋白C-端702个氨基酸，共720个氨基酸的融合蛋白。根据氨基酸序列推算的融合蛋白分子量为78.17×103D(命名为pHEaP78)，SDS-PAGE结果显示融合蛋白的分子量约为78KD。
外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达，常导致形成包涵体。溶菌酶-超声波处理诱导表达菌体，经蔗糖梯度离心得白色包涵体带，洗糖离心得纯净的包涵体，在透射电镜下可见形状不规则的包涵体，结果见图5。
图面说明
图1重组表达质粒pEHa。
图2重组表达质粒pEHa构建示意图。
图3重组质粒pEHa酶切鉴定；图中符号代表MλHindIII marker；1pEQ/EnC+PstI；2pEHa+SacI；3pEHa+BamHI/HindIII；4pEHa+KpnI/HindIII；5pQE(pREP4)+PstI.
图4 HaGV增效蛋白在大肠杆菌中的表达。图中符号代表MProtein marker；1、2、3Bacterial protein；4Punified occlusion body；5、6、7IPTG induced 5h.
图5HaGV增效蛋白包涵体。
权利要求
1.一种工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)，该工程菌株已提交中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NOM 201010
2.根据权利要求所述的工程菌株，其特征在于它含有重组质粒pEHa由下列DNA元件构成。(1)棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因3’端2.1Kb片段。(2)大肠杆菌质粒复制起始点。(3)氨苄青霉素抗性基因。(4)六个连续组氨酸编码区。
3.根据权利要求所述的工程菌株，其特征在于该工程菌株携带棉铃虫颗粒体病毒N未端截短增效蛋白的基因，具有卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因，能够使HaGV增效蛋白在大肠杆菌中获得表达。
4.一种构建权利要求1-4所述的工程菌株的方法，其特征在于用SacI、Pst I分别双酶切质粒pQE和PCR法扩增的2.1Kb HaGV增效蛋白基因片段，用T4 DNA连接酶连接、转化感受态细胞E.coli M15，经氨苄霉素和卡那霉素双抗平板筛选，获得Escherichia coli M15(pEHa)的工程菌株。
5.一种构建权利要求1-3所述工程菌株的方法。其特征在于以HaGV基因组DNA为模板，设计引物P15′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT 3′P25′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT 3′PCR法扩增棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因，获得2.1Kb HaGV N端截短的增效蛋白基因片段。
6.一种利用权利要求1、2、3、4、5所述的工程菌株生产HaGV增效蛋白的方法。其特征在于将工程菌株CCTCC NOM 201010单菌落挑到含100μg/ml的的氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，37℃，200rpm过夜培养，次日以1∶4比例接种到含上述双抗的500ml2YT培养基中，当其浓度达计OD600＝0.3时，加入异丙基-β-D-硫代单乳糖苷至终浓渡1mM，于37℃，200rpm诱导表达5h，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法获得表达的HaGV增效蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种通过基因工程方法构建获得工程菌株:CCTCC NO:M201010 Escherichia coli M15(pEHa)工程菌株的构建方法和工程菌株的用途。该菌株是以棉铃虫颗粒体病毒(HaGV)DNA为模板,通过PCR扩增产生HaGV增效蛋白基因,再经酶切,酶连接构建含HaGV增效蛋白基因的重组载体pQEHa,转化E.coli M15(pREP4)而获得。该工程菌株所携带的重组载体pQEHa,含HaGV增效蛋白基因,并能够高效表达HaGV增效蛋白。图1为本发明含HaGV增效蛋白基因的重组表达质粒pEHa示意图。
文档编号C12N1/21GK1384189SQ0111467
公开日2002年12月11日 申请日期2001年5月9日 优先权日2001年5月9日
发明者孟小林, 徐进平 申请人:深圳万德福基因工程有限公司