一种抗传染性脾肾坏死病毒的dna疫苗的制作方法

一种抗传染性脾肾坏死病毒的dna疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗，该DNA疫苗的核酸序列为ISKNV病毒主衣壳蛋白MCP的基因序列。本发明的DNA疫苗与佐剂QCDC的联合使用，具有很好的免疫原性，相对免疫保护率达80%，显著优于现有MCP蛋白疫苗的相对免疫保护率（64.3%），可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗。本发明DNA疫苗的制备方法简单，容易操作，成本低廉，易于市场推广应用。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程疫苗领域，涉及一种DNA疫苗，具体涉及一种抗传染性脾肾 坏死病毒（ISKNV)的DNA疫苗。 一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗

【背景技术】
[0002] 鳜（Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一，由传染性脾肾 坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)引起的績鱼虹彩病毒 病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜死亡率接近100%，成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。 长期以来，对于鳜病毒病的防治一直没有有效的药物，而且药物防治疾病弊端众多，如病原 耐药性、环境污染、食品安全等。因此作为符合环境友好和可持续发展战略的病害控制措 施，疫苗防治正成为国际现代水产养殖业的标准生产规范和研究开发的前沿热点领域。因 此，研制与发展鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗是防治鳜鱼虹彩病毒病具有战略意义的辅助 措施。
[0003] DNA疫苗是通过基因重组技术，由编码某种抗原蛋白质的外源基因和作为真核 表达载体的质粒构建的重组质粒。重组质粒通过某种方式被导入生物体内，在宿主细胞 中通过宿主细胞的基因转录和表达系统选择性表达外源抗原基因，诱导宿主产生对该抗 原蛋白质的特异性免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。主衣壳蛋白（major capsid protein，MCP)是ISKNV的主要结构蛋白，在病毒的感染晚期大量表达，表达量占病毒粒 子可溶性蛋白的90%，是主要的免疫原性蛋白。2004年，张敏等进行了 ISKNV主衣壳蛋白 (Major capsid protein, MCP)的原核表达，采用免疫印记的方法初步确定了重组MCP蛋 白与ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，为ISKNV重组亚单位疫苗的研制提供了思路。2009 年，付小哲等对重组MCP蛋白的免疫原性进行了初步研究，发现重组MCP蛋白有较好的免疫 原性，相对免疫保护效果可达到64. 3%，可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答。到目 前为止，还没有以ISKNV MCP基因作为DNA疫苗应用的研究报道。


【发明内容】

[0004] 为了解决上述存在的问题，本发明研制了含抗传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗的重 组质粒pcMCP，通过与QCDC佐剂的联合使用，可作为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗， 其相对免疫保护率达到80% (现有重组MCP蛋白疫苗的相对免疫保护率为64. 3%)，本发明 的MCP DNA疫苗显著优于现有MCP蛋白疫苗。
[0005] 本发明的目的在于提供一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗。
[0006] 本发明所采取的技术方案是： 一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0007] 进一步的，上述DNA疫苗的核酸序列在真核表达载体中进行表达。
[0008] 进一步的，上述DNA疫苗的佐剂为Q⑶C。
[0009] 进一步的，上述DNA疫苗在制备预防抗病毒药物中的应用。
[0010] 进一步的，上述病毒为传染性脾肾坏死病毒。
[0011] 本发明的有益效果是： 1)本发明构建了一种抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病DNA疫苗，是一种新疫苗，其具 有很好的免疫原性，相对免疫保护率达80% (现有重组MCP蛋白疫苗的相对免疫保护率为 64. 3%)，显著优于现有MCP蛋白疫苗，可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗。
[0012] 2 )本发明的DNA疫苗的制备方法简单，容易操作，成本低廉，易于市场推广应用。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1为重组质粒的酶切鉴定图；1为200bp DNA Maker ;2为MCP基因条带；3为 重组质粒pcMCP经幻7/7 I和feoR I酶切后的条带；4为空质粒PCDNA3. 1 (+)经幻7/7 I和 I酶切后的条带； 图2为免疫斑点检测pcMCP在鳜脑组织细胞（CPB)中的表达情况，1为转染了 pcMCP的 CPB细胞；2为空细胞对照； 图3为RT-PCR检测pcMCP在鱼体内的转录表达情况；Μ为200bp DNA Marker ;1为 RT-PCR产物；2为Mcp基因对照； 图4为免疫印迹分析检测pcMCP在鱼体内的蛋白表达情况；1为表达纯化的MCP蛋白； 2为注射PBS的鳜鱼肌肉蛋白；3,注射pcMCP的鳜鱼肌肉蛋白； 图5为不同实验组的累积死亡率曲线图，Q+M代表Q⑶C+pcMCP组；Q+3. 1代表 QCDC+pcDNA3. 1 ;Q+P 代表 QCDC+PBS 组；P 代表 PBS 组。

【具体实施方式】
[0014] 实验例1 : 一、DNA疫苗的构建 1. 1 ISKNV MCP基因的扩增 (1)根据GenBank中传染性脾肾坏死病毒（ISKNV) MCP基因序列[HQ317460. 1]设计 引物，并引入酶切位点（以下划线标注)，引物序列如下： P1 :5'_ CGGGTACCATGGCTGCAATCTCA -3'（SEQ ID N0 :2)，引入 Κρη I 酶切位点（下划 线部分)， Ρ2 :5'_ GCGAATTCTTACAGGATAGGGAAGC _3'（SEQ ID Ν0 :3)，引入 EcoR I 酶切位点（下 划线部分)，该对引物可扩增出MCP基因序列（如SEQ ID N0 :1所示)。
[0015] (2)以本实验室自保存的病毒基因组为模板进行PCR扩增，25 μ L PCR反应体系包 含：10Xbuffer (含 Mg2+)2. 5μ L，4XdNTP (10mmol/L)0· 5μ L，上下游引物（20μ mol/L)各 0.5以1^，了&9〇嫩聚合酶（5"以〇0.3以1^，0嫩1.(^1^无菌双蒸水补足。？0?反应条件 ： 94°C预变性 4min ;94°C变性 45S，58°C复性 45S，72°C延伸 90S，30 个循环；72°C延伸 10min。
[0016] (3)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果显示，在1375bp左右出现亮带，片 段大小与预期基本相符，将目的产物进行胶回收纯化(具体操作参考试剂盒说明书)。
[0017] 1. 2重组真核表达质粒pcMCP的构建 (1)将纯化后的ISKNV mcp PCR产物及提取的真核表达载体PCDNA3.1 ( + )，分别用 Κρη I 和EcoR I 进行双酶切。pcDNA3. 1( + )的酶切体系为：10XNEB Buffer 5yL，100XBSA 0· 5μ L，Kpn I (2〇υ/μ L)1 μ L，EcoR I (2〇υ/μ L)1 μ L，PCDNA3. 1( + )15μ L(7y g/μ L)，灭 菌双蒸水补足 50yL。MCP 的酶切体系为：10XNEB Buffer 5yL，100XBSA 0.5yL，Kpn I (20U/yL)lyL，EcoR I (20U/yL)lyL, MCP 35yL (3以8/^〇，灭菌双蒸水补足5(^1^ 将酶切产物进行回收纯化(具体操作参考试剂盒说明书)。
[0018] (2)将回收后的PCR产物和pcDNA3. 1 ( + )质粒16°C连接过夜，连接体系为： pcDNA3. l( + )(9ng/y L) 3. 0yL,MCP 5. 0 μ L(7ng/μ L), T4 DNA ligase (5U/μ L) l.OyL, 2X Rapid Ligation Buffer 1. 0 μ L. (3)将连接反应液5yL加入100yL DH5a感受态细胞（Takara, Japan)中，轻轻旋 转离心管以混匀，置冰浴30min后，将感受态细胞置于42°C水浴热激90S，然后快速转到冰 浴中冷却3min。再向每个离心管中加入900 μ L灭菌的LB培养基，混匀后置于37°C摇床振 荡培养45min (转速200rpm/min)。吸取100 μ L已转化的感受态细胞涂布LB平板(含amp 50 μ g/mL)，37°C正置培养30min后，倒置培养16h。
[0019] (4)挑取白色菌落，接种于3mL加 Amp (终浓度50 μ g/mL)的LB液体培养基中， 37°C、200rpm培养过夜。吸取1. 5mL菌液提取质粒，用Kpnl，EcoRI酶切鉴定重组子，反应 体系如下： 10X H buffer lyL;ddH20 6 yL;Kpn I (15U/yL) 0.5yL;质粒 DNA 2.5yL。
[0020] 10XH buffer 1 μ L ;(ΜΗ206 μ L ;EcoR I (15U/y L) 0· 5μ L ;质粒 DNA 2.5yL。
[0021] 37°C反应lh，l%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。结果显示（图1)可以从重组的 质粒中酶切出相应大小的目的片段，说明目的片段已插入质粒中。再将质粒送至测序公 司测序，测序结果证明重组表达载体pcMCP已正确构建，即获得含抗传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV) DNA疫苗的重组质粒pcMCP。
[0022] 二、重组质粒pcMCP的表达效果检测 2. 1重组真核表达质粒pcMCP在鳜脑组织细胞系（CPB)中的表达 (1)质粒pcMCP转染CPB细胞 1)转染前一天，胰酶消化细胞并计数，在24孔板中接种细胞，过夜，贴壁生长，使其在 转染日密度为90%，细胞铺板在0. 5mL含10%血清M199培养基中正常生长。
[0023] 2)对于每孔细胞，使用50yL无血清培养基（MEM培养基）稀释0.8yg-1.0yg DNA。
[0024] 3)对于每孔细胞，使用 50 μ L MEM 培养基稀释 1 μ L-3 μ L Lipofectamine 2000 试齐[J。Lipofectamine 2000稀释后，在5min内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活 性。
[0025] 4)混合（2)中稀释的DNA和⑶中稀释的Lipofectamine2000,在室温保温 20min〇
[0026] 5)将细胞用无血清的MEM培养基洗两次。
[0027] 6)将（4)中的混合物直接加入细胞培养板中，摇动培养板，轻轻混匀。用胶布封 好并作好标记。
[0028] 7) 28°C培养5h后，更换新鲜的含10%血清的M199培养基，28°C继续培养。细胞 转染时，设空细胞对照。
[0029] 8) 72h后，胰酶消化收获细胞。
[0030] (2)免疫斑点分析pcMCP在细胞内的表达 1)培养细胞先用PBS清洗，然后用8M的尿素和50mM的Tris-Cl (pH7. 5)进行溶解。
[0031] 2)将5 μ L细胞溶解液滴到PVDF膜上，60°C烘干lh。
[0032] 3)用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭，室温摇床孵育l_2h。
[0033] 4)弃封闭液,立即加入一抗和新的封闭液（1:1000),室温孵育l_2h。
[0034] 5)用 PBST 漂洗 3 次，lOmin/次。
[0035] 6)弃掉一抗及封闭液，立即加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)和新的封闭液 (1:5000)，室温孵育lh。
[0036] 7)去掉辣根过氧化物酶溶液，PBST漂洗3次，lOmin/次。
[0037] 8)漂洗后的膜移入干净培养皿，按膜面积加入0. lmL/cm2的底物溶液与H202混合 液（10mL底物溶液加入10 μ L 30%H202液，混匀后立即使用）。
[0038] 9)室温轻摇，仔细观察蛋白带的生色反应，一旦蛋白带的颜色深度达到要求（约 2-3min)，即用水稍为漂洗，将滤膜转移到装PBS的培养皿中，终止反应。
[0039] 10)结果显示，转染pcMCP质粒的细胞样品有明显的斑点出现，而阴性细胞对照则 没有斑点（图2)。说明本发明的DNA疫苗可以很好地真核细胞内表达。
[0040] 2. 2重组质粒pcMCP在鱼体内的表达检测 (1) pcMCP在鱼体内的转录检测 1)用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 无菌状态下大量提取 pcMCP。
[0041] 2)鳜鱼(约10g)暂养一周后，在其背鳍基部用lmL注射器肌注20 μ g pcMCP (溶 于100 μ L生理盐水)，同时分别设注射pcDNA3. 1+和生理盐水的鳜鱼做对照。
[0042] 3)免疫三天后，用Trizol试剂分别提取免疫组和对照组注射部位肌肉的总RNA， 免疫组的总RNA用DNase处理以彻底除去pcMcp的污染。
[0043] 4)用经PCR检测无 pcMCP污染的总RNA做模板，按RT-PCR试剂盒Powerscript II reverse transcriptase (Clontech)介绍的方法进行 cDNA 合成。PCR 扩增条件与 "1.1" 中的PCR相同。结果显示（图3)所扩增的片段与MCP基因大小相符合，说明pcMcp在鱼体 内能够正常地进行转录。
[0044] (2) pcMCP在鱼体内的蛋白表达检测 1)用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 无菌状态下大量提取 pcMCP。
[0045] 2)鳜鱼(约10g)暂养一周后，在其背鳍基部用lmL注射器肌注20 μ g pcMCP (溶 于100 μ L生理盐水)，同时设注射PBS的鳜鱼做对照。
[0046] 3)免疫三天后，取免疫组和对照组注射部位肌肉用50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)匀浆(终浓度为 100mg/ml)，然后 4°C 16,000 g 离心 10 min。
[0047] 4)取20 μ L上清，进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，将凝胶上分离的蛋白转移到 PVDF膜上，在80mA的电流下转移4h，丽春红染色观察转移情况。
[0048] 5)用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭无关蛋白的潜在结合位点，室温摇床孵育 l-2h。
[0049] 6)弃封闭液,立即加入一抗和新的封闭液（1:1000),室温孵育l_2h。
[0050] 7)转移掉封闭液，用PBST漂洗3次，lOmin/次。
[0051] 8)立即加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)和新的封闭液（1:5000)，室温孵育 lh〇
[0052] 9)去掉辣根过氧化物酶溶液，PBST漂洗3次，lOmin/次。
[0053] 10)漂洗后的膜移入干净培养皿，按膜面积加入0. lmL/cm2的底物溶液与H202混 合液（10mL底物溶液加入10 μ L 30%H202液，混匀后立即使用）。
[0054] 11)室温轻摇，仔细观察蛋白带的生色反应，一旦蛋白带的颜色深度达到要求（约 2-3min)，即用水稍为漂洗，将滤膜转移到装PBS的培养皿中，终止反应。
[0055] 12)结果显示免疫鳜肌肉组织样品所在泳道有一特异的蛋白带（蛋白分子量约为 50kD)，而对照鳜样品中则无此带（图4)。说明pcMCP在鱼体内能够正常地进行蛋白表达。
[0056] 三、重组质粒pcMCP的免疫保护效果 3. 1实验鳜鱼 体质量40-50g，在充气及流水养殖池内暂养2周。从中随机挑取20尾，经镜检观察寄 生虫、肝脏分离细菌、PCR检测ISKNV全部阴性，确认健康后用于实验。实验期间水温27? 31°C，每天投喂饵料鱼（鲮鱼），攻毒后改为每隔3天投喂一次饵料鱼。
[0057] 3.2疫苗的制备 1)用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 无菌状态下大量提取 pcMCP。
[0058] 2)将pcMCP用PBS调整浓度为100 μ g/ml的pcMCP溶液，然后滴加佐剂Q⑶C(含 quilA 20 yg/ml，胆固醇20yg/ml，二甲溴化铵10 yg/ml，聚丙烯酸树脂0·05%(ν/ν))，每 100mL的pcMCP溶液中滴加3. 5mL佐剂QCDC。
[0059] 3.3实验分组 将实验鳜鱼随机分为4个实验组，分别为Q⑶C+pcMCP，Q⑶C+pcDNA3. 1，Q⑶C+PBS和 PBS组，每组30尾。其中QCDC+pcMCP组背肌注射核酸疫苗20 μ g/尾，QCDC+pcDNA3. 1组背 肌注射空质粒20 μ g/尾。各组的注射体积均为200 μ L/尾。
[0060] 3. 4攻毒实验 免疫后28天，腹腔注射10TCID50病毒液，连续观察15d，每天早晚观察记录各组鱼的 死亡情况。取死亡鱼的脾、肾进行ISKNV的PCR检测，对肝、脾、肾、脑进行细菌分离，以确定 死因，并计算相对免疫保护率（Relative percentage survival, RPS)。结果显示（图5)， Q⑶C+pcMCP组的相对保护率为80%，明显高于其他三组。
[0061] 上述实验结果说明，添加佐剂QCDC的pcMCP核酸疫苗具有很好的免疫原性，可以 开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗。 〈110>中国水产科学研究院珠江水产研究所 〈120> -种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗 <130> <160> 3 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 1359 <212> DNA 〈213>病毒基因 <400> 1 atgtctgcaa tctcaggtgc aaacgtaacc agcgggttca tcgacatctc cgcgtttgat 60 gcgatggaga cccacttgta cggcggcgac aatgccgtga cctactttgc ccgtgagacc 120 gtgcgtaggt cctggtacag caaactgccc gtcaccctgt caaaacagac tggccatgcc 180 aattttgggc aggagtttag tgtgacggtg gcgaggggcg gcgactacct cattaatgtg 240 tggctgcgtg ttaagatccc ctccatcaca tccagcaagg agaacagcta catccgctgg 300 tgcgacaatc tgatgcacaa tctagtggag gaggtgtcgg tgtcatttaa cgacctggtg 360 gcacagaccc tcaccagcga gttccttgac ttctggaacg cctgcatgat gcccggcagc 420 aaacagtctg gctacaacaa gatgattggc atgcgcagcg acctggtggc cggcatcacc 480 aacggccaga ctatgcccgc cgtctacctt aatttgccca ttcccctctt cttt acccgt 540 gacacgggcc tggcgttgcc taccgtgtct ctgccgtaca acgaggtgcg catccacttc 600 aagctgcggc gctgggagga cctgctcatc agccagagca accaggccga catggccata 660 tcgaccgtca ccctggctaa cattggcaat gtagcacccg cactgaccaa tgtgtctgtg 720 atgggcactt acgctgtact gacaagcgag gagcgtgagg tggtggccca gtctagtcgt 780 agcatgctca ttgaacagtg ccaggtggcg ccccgtgtgc ccgtcacgcc cgcagacaat 840 tctttggtgc atctggacct caggttcagt caccccgtga aggccttgtt ctttgcagta 900 aagaacgtca cccaccgcaa cgtgcaaagc aactacaccg cggccagtcc cgtgtatgtc 960 aacaacaagg tgaatctgcc attgatggcc accaatcccc tgtccgaggt gtcactcatt 1020 tacgagaaca cccctcggct ccaccagatg ggagtagact acttcacatc tgtcgacccc 1080 tactactttg cgcccagcat gcctgagatg gatggtgtta tgacctactg ctatacgttg 1140 gacatgggca atatcaaccc catgggttca accaactacg gccgcctgtc caacgtcacc 1200 ctgtcatgta aggtgtcgga caatgcaaag accaccgcgg cgggcggtgg cggcaacggc 1260 tccggctaca cggtggccca aaagtttgaa ctggtcgtta ttgctgtcaa ccacaacatc 1320 atgaagattg ctgacggcgc cgcaggcttc cctctgtaa 1359 〈210〉 2 〈211〉 23 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400> 2 cgggtaccat ggctgcaatc tea 23 〈210〉 3 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400> 3 gcgaattctt acaggatagg gaagc 25
【权利要求】
1. 一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 根据权利要求1所述的一种DNA疫苗，其特征在于：其核酸序列在真核表达载体中 进行表达。
3. 根据权利要求1所述的一种DNA疫苗，其特征在于：该疫苗的佐剂为QCDC。
4. 权利要求1?3任一所述的DNA疫苗在制备预防抗病毒药物中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的病毒为传染性脾肾坏死病毒。
【文档编号】A61K48/00GK104096240SQ201410280461
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】李宁求, 付小哲, 吴淑勤, 林强, 刘礼辉, 张德峰 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所