专利名称：对虾传染性肌肉坏死病毒一步法rt-pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及对虾传染性病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。
背景技术：
传染性肌肉坏死病为2002年在巴西发现的一种危害对虾生产的新的病毒性传染病，2004年美国亚利桑纳大学Donald V. Lightner博士研究发现该病由一种新的病毒引起并将之定名为传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，简称IMNV)。这种新型病毒为双链RNA病毒，属于整体病毒科。对虾传染性肌肉坏死病毒的易感对虾种类为南美白对虾，主要是感染60-80天的幼虾。该病毒能造成感病对虾全身肌肉组织坏死，一般情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率可达70%。目前已有的传染性肌肉坏死病毒RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)检测方法为套式RT-PCR检测方法，检测过程较为繁琐、费时。而进行对虾传染性肌肉坏死病毒早期检测并采取预防措施是对虾养殖中降低对虾传染性肌肉坏死病毒流行风险、减少对虾发病导致经济损失的有效手段，所以建立简单快速高灵敏的检测方法，以及配合该检测方法使用的病毒检测试剂盒极为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有套式RT-PCR检测方法中存在的检测过程繁琐费时的问题，提供对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，同时还提供了利用该试剂盒进行检测的检测方法，该检测方法灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。本发明是通过以下技术方案实现的对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，其特殊之处在于包括(1)、RT-PCR buffer 管，内装 2 X RT-PCR buffer ；(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；(5)、阴性对照管，内装SPF(无特定病原体)对虾核酸；(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。所述RT-PCR弓丨物对包括正向引物序列5，-CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3，反向引物序列5，-ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3，产物长度为123bp。对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测方法如下(I)RT-PCR 反应体系
权利要求
1.对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，特征在于包括(1)、RT-PCRbuffer 管，内装 2XRT-PCR buffer ；(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；(5)、阴性对照管，内装SPF对虾核酸；(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。
2.按照权利要求1所述对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述RT-PCR引物对包括正向引物序列 5’ -CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3， 反向引物序列 5’ -ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3 ‘ 产物长度为123bp。
3.权利要求1所述检测试剂盒用于检测对虾传染性肌肉坏死病毒。
4.利用上述权利要求1或2所述试剂盒实现的一种对虾传染性肌肉坏死病毒一步法 RT-PCR检测方法，其特征在于RT-PCR反应体系试剂体积/体系(μ )终浓度2xRT-PCR buffer10Ix正反引物(ΙΟμΜ)0.40.2μΜRT/Taq Mix0.41μ1/50μ1 体系模板RNA1IOpg Ipg无菌去离子水8.2总体积20-RT-PCR反应程序cDNA合成和预变性:45°C 30min,94°C 2min, 1个循环；PCR扩增94°C变性15s，55°C退火 30s, 72°C cDNA 合成 lmin，40 个循环； 终延伸72°C延伸5min，1个循环；4°C保存。
全文摘要
本发明涉及对虾传染性病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。本发明目的提供检测试剂盒及检测方法，该检测方法更加灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。检测试剂盒包括(1)、RT-PCR buffer管，内装2×RT-PCR buffer；(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；(5)、阴性对照管，内装SPF对虾核酸；(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。检测方法包括(1)RT-PCR反应体系(2)RT-PCR反应程序。
文档编号C12Q1/70GK102251057SQ201110173709
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月18日 优先权日2011年6月18日
发明者刘鸿玲, 谢玮, 闫冬春 申请人:鲁东大学