专利名称：同时检测对虾wssv和ihhnv的方法及所用检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产动物病原检测技术，具体是对虾白斑综合症及传染性皮下及造血
组织坏死病毒的核酸多重等温扩增检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
对虾白斑综合症病毒WSSV最早出现在上世纪90年代初，是一种具有高度感染性 和致死性的病毒，是危害全球对虾养殖业最主要的病毒。WSSV能感染广泛的宿主，包括所有 种类的对虾和其它大多数甲壳类动物，甚至在昆虫体内也有发现，而且还能垂直传播。对虾 被感染后表现出非常高的死亡率，累积死亡率通常在观察到第一次明显的感染迹象后3-10 天达到100%。 传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)最初在夏威夷地区养殖的细角滨对 虾(Litopenaeus stylirostris)中被发现，分布广，危害严重，引起死亡率高达90 %以上 (Lightneret al， 1983)，而且可感染世界各地养殖对虫下，是国际兽疫局(0IE)划定的甲壳 类其他重要疾病之一，对世界对虾养殖事业发展影响重大。在可感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的多种病毒中，IHHNV可导致慢性矮小残缺综合症(Runt-deformity syndrome, 简称RDS)，虽不会导致对虾大量死亡，但是病毒感染实际上会造成经济上的重大损失。感染 IHHNV的南美白对虫下，畸形率高，个体成长差异性大，饵料效率差，商品价值低，产量偏低，整 体养殖经济损失可能高达50% 。研究发现感染传染性皮下及造血组织坏死病毒或患病后存 活下来的南美白对虾会终生带毒，并可通过垂直和水平传播方式把病毒传给下一代和其他 种群。 对于对虾病毒性疾病，目前还没有有效的药物进行治疗，生产上多以预防为主，所 以病毒病原的检测，特别是早期的检测显得格外重要。 目前，有关对虾病毒的检测方法主要有五种，第_种是电镜观察法，第二种是HE染 色法，第三种是抗体检测法，第四种是核酸探针杂交法，第五种是PCR检测法。电子显微镜 技术虽然可以直观察到病毒粒子的存在，但操作复杂、耗费时间长、成本高。HE染色法基于 病理学技术，不能直接对病毒进行检查，只能利用发病的组织病理征兆进行检测；抗体检测 法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，其检测灵敏度较低，耗 时较长，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测，对于尚未引发感染或在感染的极 早期很难用以上的方法检测；PCR检测法，虽然克服了前四种方法的缺点，在实验室条件下 能实现对病毒的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳 和成像系统，且检测时间稍长，也大大限制了 PCR检测方法在生产实际中的推广应用。
近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP)，该方法可以高灵敏地非常有选择性 地高效扩增靶序列，最终的LAMP产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环 花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱。 LAMP是一种新型的恒温核酸扩增方法，和其它核酸扩增技术相比，其反应原理、引物设计更 加复杂。但是它具有等温扩增只需要一个恒温装置就可以；高效灵敏模板仅需要10个拷贝或更少；扩增特异性强应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；检测 时间短扩增可以在60min完成，比普通PCR反应要省时间；产物可以通过直接在反应管中 加荧光染色或用琼脂糖凝胶电泳检测。以LAMP为基础发展而来的多重环介导等温扩增法 (multi-LAMP)可以实现在同一反应体系中一步同时检测多种耙基因，同LAMP —步反应只 能检测一种耙基因相比，节省了检测步骤和检测时间。 鉴于目前在对虾养殖或相关产品的进出口贸易中经常出现多种病毒混合感染的 状况，如WSSV和IHHNV等病毒混合感染南美白对虫下，开发一项对多种病毒同时进行一步检 测的多重环介导等温扩增技术显得非常迫切和急需。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供 一 种检测灵敏度高且易操作的对虾WSSV及 IHHNV同时检测的方法以及配套的试剂盒。 为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时检测对虫下WSSV和IHHNV核酸多重等
温扩增检测试剂盒，该试剂盒包括 (1)、研磨液管内装研磨液； (2)、核酸提取液A管内装乙酸钠溶液； (3)、核酸提取液B管内装无水乙醇； (4)、核酸提取液C管内装质量浓度为70%的乙醇； (5) 、 TE缓冲液管内装TE缓冲液； (6) 、 UNG酶管内装尿嘧啶DNA糖基化酶； (7) 、multi-LAMP反应液管内装multi-LAMP反应液； (8) 、 Bst DNA聚合酶管内装Bst DNA聚合酶； (9)、显色剂管内装核酸染料SYBR Green I ; (10)、阳性对照核酸管内装拷贝数比为1 : 1的对虾WSSV和IHHNV阳性DNA ;
(11)、阴性对照管内装灭菌的双蒸水。 作为本发明的同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒的改进， 研磨液是由以下体积份的组份组成 1 2M的三羟甲基氨基甲烷溶液5 10份，O. 25 1. OM的乙二胺四乙酸二钠溶 液0. 5 2. 0份，质量浓度5 10%的十二烷基磺酸钠溶液5 10份，巯基乙醇0. 01 1. 0份，8-羟基喹啉0. 01 0. 02份，平衡酚5 10份和氯仿5 10份，以双蒸水定容到 100份。 作为本发明的同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒的进 一步改进，multi-LAMP反应液由以下组份组成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP禾P IHHNV-BIP各1 4 ii M， multi-LAMP引物WSSV—F3、 WSSV—B3、 IHHNV—F3和 IH丽-B3各0. 1 0. 4线dATP、 dGTP和dCTP各0. 5 2mM， dTTP、 dUTP各0. 25 lmM， Tris-HCllO 40mM， KC1 10 20mM， (NH4)2S04 5 15mM， MgS04 1 4mM， TritonX-100 0. 05% 1. 0%， Betaine 0. 8 1. 2M ;其余为双蒸水。 作为本发明的同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒的进一 步改进，multi-LAMP引物的核酸序列如下
WSSV-FIP(SEQ ID NO. 1): WSSV-BIP(SEQ ID NO. 2): 5' -GCGAGCAAGGCAATTTCAGCTTTTCAAATCCAAGAGGCACTCCAAAT ; WSSV-F3 (SEQ ID NO. 3): 5' -CTCCTGCGATAAAGGGATGTC ; WSSV-B3(SEQ ID NO. 4): 5' -AGTTGGATGGATTGAGGCGT ; IHHNV-FIP (SEQ ID NO. 5): IH丽-BIP(SEQ ID NO. 6): 5' -GAAAATCTCTTACCATCGGTGCATTTTGAAGGTGTTTGAGTCTCCT ;
IHHNV-F3 (SEQ ID NO. 7):
5' -CGACATCCGTGTACCAGA ;
IHHNV-B3 (SEQ ID NO. 8):
5' -AGAGCGTAGGACTTTCCG。 本发明还同时公开了利用上述任意一种试剂盒同时检测对虫下WSSV和IHHNV的方 法，包括下列步骤 (1)、取待测品对虾的头胸部组织0. 2g置于离心管I中，加入0. 5ml研磨液，用研 磨棒充分磨碎至桨状； (2)、将上述研磨所得的浆状样品煮沸后以10000r/min离心5min，取上清液置于 离心管II中； (3)、向离心管II内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀，所述乙酸钠溶液 与上清液的体积比为1/10 ;再加入-2(TC预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇混合，静置 10min，以12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物，所述无水乙醇与上清液的体积比 为2 : 1 ; (4)、用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤(3)所得的沉淀物，然后以 12000r/min离心5min，弃去上清液，并保留沉淀物； (5)、用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤(4)所得的沉淀物，然后以 12000r/min离心5min，弃去上清液，并保留沉淀物； (6)，将上述步骤(5)所得的沉淀物于室温晾干，加入20 iU TE缓冲液溶解沉淀 物，得到样品核酸； (7)、分别将上述样品核酸、阴性对照管内的双蒸水及阳性对照核酸管内的阳性对 照核酸2iil，加入43ii1 multi-LAMP反应液，再加入liil UNG酶，从而分别得检测管、阴性 对照管和阳性对照管；将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于37t:保温10min进行 酶解； (8)、将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管中的酶解后的反应体系分别进行如 下操作先于95t:保温5min，然后再迅速置于碎冰块中5min ; (9)、向步骤(8)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加入2 ill Bst DNA聚合酶和2 ii 1核酸染料SYBR Green I ; (10)、将上述步骤(9)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管别进行如下操作 先于64。C保温45min，然后于90。C保温2min完成multi-LAMP反应； (11)、multi-LAMP反应结束后，如果检测管内反应产物的颜色同阴性对照管内反 应产物的颜色，则待测品IHHNV检测结果为阴性；如果检测管内反应产物的颜色同阳性对 照管内反应产物的颜色，则待测品IHHNV检测结果为阳性。 在本发明的试剂盒中，原料能以市购的方式获得，例如乙二胺四乙酸二钠、三羟甲 基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、醋酸钠、氯仿、平衡酚、巯基乙醇、8-羟基喹啉、MgCl2、 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP购自上海生物工程有限责任公司，dUTP购自上海闪晶分子生物科技有限 公司，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、Bst DNA聚合晦等购自美国NEB公司，核酸染料SYBR Green I购自北京鼎国生物科技有限公司，Betaine、 Triton X-100购自Sigma公。
multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和IHHNV-BIP以及multi-LAMP 引物WSSV-F3、WSSV-B3、IHHNV-F3和IHHNV-B3可委托美国invitrogen (上海)英骏生物技 术有限公司合成。 对虫下WSSV阳性DNA的获得方式为感病对虫下样品采自浙江宁波对虫下养殖场，按 照本发明的步骤1) 步骤6)提取模板DNA，用PCR引物WSSV-Pf和WSSV-Pr对其进行 扩展，反应体系为25iU体系包括2. 5iU 10XPCR反应缓冲液、1. OiU dNTPs(10mM)、 l.Oii 1WSSV-Pf和WSSV-Pr (20 iiM)、0. 5 ii 1 Taq DNA聚合酶(5U/ii l，北京鼎国生物科技有 限公司)，其余为双蒸水。扩展程序为94t:预变性5min，之后进入扩增循环，94t:变性30s， 60。C退火30s， 72。C延伸60s完成一个扩增循环，重复循环30次，最后72°C 10min， 4。C保存。 扩增得635bp的条带，回收该片段后，按T载体说明书要求连接到T载体(pMD-18T-Vector， 购自大连宝生物公司)上，并按感受态细胞操作要求将重组质粒转化至大肠杆菌感受态 细胞JM109(购自大连宝生物公司)内，用蓝白斑方法筛选阳性菌，并用引物WSSV-Pf和 WSSV-Pr进行PCR验证(程序同上)。最后用碱法提取阳性菌的质粒，作为WSSV阳性DNA。
对虾IHHNV阳性DNA的获得方式为感病对虾样品采自浙江萧山对虾养殖场，按 照本发明的步骤1) 步骤6)提取模板DNA，用PCR引物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr对其进 行扩展，反应体系为25iU体系包括2. 5iillOXPCR反应缓冲液、1.0ii1 dNTPs(10mM)、 l.Oii IIHHNV-Pf禾P IHHNV-Pr(20iiM)、0.5ii 1 Taq DNA聚合酶(5U/ii 1，北京鼎国生物科 技有限公司)，其余为双蒸水。扩展程序为94t:预变性5min，之后进入扩增循环，94t:变 性30s，58。C退火30s，72。C延伸60s完成一个扩增循环，重复循环30次，最后72°C 10min， 4t:保存。扩增得523bp的条带，回收该片段后，按T载体说明书要求连接到T载体 (pMD-18T-Vector，购自大连宝生物公司)上，并按感受态细胞操作要求将重组质粒转化至 大肠杆菌感受态细胞JM109(购自大连宝生物公司)内，用蓝白斑方法筛选阳性菌，并用引 物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr进行PCR验证(程序同上)。最后用碱法提取阳性菌的质粒，作为 IHHNV阳性DNA。 病毒IHHNV由Lightner D V， Redman R M， Bell T A等人于1983年在美国细 角滨对虾和南美白对虾中首次发现报道。IHHNV DNA的GenBank序列号为EF633688，目 标序列位置为2195-2410。 WSSV DNA的GenBank序列号为AF369029，目标序列位置为: 55303-55517。
本发明检测方法的步骤(7)中，通过在提取的对虾样品核酸中加入1个单位的UNG 酶来消除模板污染对检测结果的干扰。在步骤(9)中预先加入核酸染料，能避免开盖检测 反应结果，大大降低了模板污染的产生可能，进一步降低了假阳性的产生。
本发明检测方法的步骤(ll)multi-LAMP反应结束后，阳性对照管内显示蓝绿色， 阴性对照管内显示紫色；用肉眼观察被测样品(即检测管)的multi-LAMP反应产物，如果 显示蓝绿色则表示该样品的检测为阳性，样品中含有其中一种(WSSV或IHHNV)或两种病毒 (WSSV和IHHNV);若显示紫色则表示该样品的检测为阴性，样品中不含其中的任意一种病 毒(WSSV或IHHNV)。 与其他报道的LAMP技术相比，本发明的核心之_是针对WSSV及IHHNV基因组，优 选了目的基因区段来设计multi-LAMP特异性引物，使得该引物能有效检测WSSV及IHHNV 的所有毒株，而且检测特异性好；核心之二是用专门设计的研磨液进行样品的处理，使得样 品的处理过程极其简单；核心之三是在同一反应体系中能同时检测WSSV及IHHNV的存在， 判断检测的对虾样品或养殖水体是否存在这两种病毒或其中之一 ；核心之四是采用尿嘧啶 DNA糖基化酶(UNG酶)消除LAMP扩增产物的污染，避免了由于multi-LAMP检测方法的产 物扩增量非常大，极易使被检样品污染，造成的假阳性的结果；核心之五是使用不抑制反应 的核酸染料，实现了不开盖检测，从源头上避免了污染的产生，进一步降低了假阳性结果的 出现；核心之六是优化了整个操作过程的技术参数，并将其标准化、配套化，形成检测试剂 盒，以便于现场应用。 本发明的积极效果在于在试剂盒中汇集WSSV及IHHNV检测所需的研磨液、核酸 提取液等十种试剂和三种器材，使得WSSV-IHHNV的检测能有序地进行，实现了检测过程现 场化、程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明的试剂盒检测方法是以根据WSSV 及IHHNV基因保守区序列设计的一套LAMP引物为主体而设计的，因而使WSSV-IHHNV检测 完全具有了 LAMP技术灵敏、快速、安全和简便的特点；同时本发明的试剂盒及检测方法中 采用不开盖检测，降低污染产生的可能，另外UNG酶能彻底消除多次检测过程中核酸污染 导致的假阳性，解决了限制LAMP技术广泛应用的易被污染干扰的问题。使用本发明的试剂 盒及检测方法在2小时内就可完成对虾WSSV及IHHNV的同时检测，检测过程无需昂贵的仪 器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需有水浴锅或金属浴和离心机即可；而且检测结果非 常容易判别；与对虾病毒已有检测技术相比，本发明的试剂盒检测方法成本低，可实现现场 检测，并且检测灵敏度极高，检出病毒的拷贝可低至100个。总之，该方法具有比普通PCR 检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，可以替代对虾白斑综合病及传染性皮下及造血 器官坏死病毒之前的相关检测方法如电镜观察法、HE染色法、抗体检测法、核酸探针杂交和 PCR检测法。 综上所述，本发明具有灵敏度高、简单快速、方便、节约时间和经费的优点，在同一 反应体系中可一步同时检测WSSV、 IHHNV等多种病毒病原，大大提高了对虾病毒检测的效 率，既有技术上的突破和创新，又符合实际应用的需要。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步说明(溶液中以双蒸水为溶剂)。 实施例1 、一种同时检测对虫下WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒(5样份，即可用于5样次的检测)，其由以下内容物组成
(1)研磨液管，1管，3ml。 研磨液配制1M的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl， pH8. 0) 10份，O. 25M的乙二
胺四乙酸二钠溶液(EDTANa2) 2. 0份，质量分数5%的十二烷基磺酸钠溶液(SDS) 10份，巯基
乙醇0. 5份，8-羟基喹啉0. 01份，平衡酚7份，氯仿8份，以双蒸水定容到100份而成。 (2)核酸提取液A管，1管，内装400 ill 3M乙酸钠溶液(NaAc， pH5. 2)。 (3)核酸提取液B管，1管，内装10ml无水乙醇。 (4)核酸提取液C管，1管，内装10ml质量浓度70%的无水乙醇。 (5) TE缓冲液管，1管，内装400 ii 1 TE缓冲液(含10mM Tris-HCl和lmM EDTA，其
余为双蒸水，pH8. 0)。 (6) UNG酶管，1管，内装6个单位(U)的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。 (7)multi-LAMP反应液管，1管，内装450 ii 1 multi-LAMP反应液， 该反应液的组成成分如下multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和
IHHNV-BIP各2 ii M， multi-LAMP引物WSSV-F3、 WSSV-B3、 IHHNV-F3和IHHNV-B3各0. 5 ii M，
dATP、dGTP和dCTP各lmM，dTTP、dUTP各0. 5mM，Tris-HCl 25mM，KCl 15mM， (NH4)2S04 10mM，
MgS04 2mM， Triton X-1000. 5% (质量浓度)，Betaine 1M ;其余为双蒸水。 上述WSSV-IHHNV检测试剂盒中所述的multi-LAMP引物根据WSSV及IHHNV
基因保守区序列(AF369029和EF633688)设计的，multi-LAMP引物设计的首选软件是
PrimerExplore 4. 0 (http://primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)，也可以使用
常用的引物设计软件(如Primer Primier 5. 0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的设计要求
进行引物设计。本发明中利用软件PrimerExplore 4. 0在线设计的multi-LAMP引物的DNA
序列如下 WSSV-FIP : WSSV-BIP : 5' -GCGAGCAAGGCAATTTCAGCTTTTCAAATCCAAGAGGCACTCCAAAT ; WSSV-F3 : 5' -CTCCTGCGATAAAGGGATGTC ; WSSV-B3 : 5' -AGTTGGATGGATTGAGGCGT ; IH丽-FIP : IH丽-BIP : 5' -GAAAATCTCTTACCATCGGTGCATTTTGAAGGTGTTTGAGTCTCCT ; IHHNV-F3 : 5' -CGACATCCGTGTACCAGA ; IH丽-B3 : 5' -AGAGCGTAGGACTTTCCG。 (8)BstDNA聚合酶管，1管，内装lOii 1 BstDNA聚合酶。
(9)显色剂管，1管，内装10 ill的液体染料，该液体染料由核酸染料SYBR Green I
和双蒸水按照l : ioo的体积比混合而得。 (10)阳性对照核酸管，1管，10 iU，内装分别带有对虫下WSSV及IHHNV DNA的T载 体重组质粒，各100copies/iil。
制备方法具体如下 用分别位于WSSV及IHHNV LAMP目标片段上下游的PCR引物
WSSV-Pf(SEQ ID NO. 9) :5' -AGCCAACCAAGCACCCGT，
WSSV-Pr(SEQ ID NO. 10) :5' -CGATTTCCTCCCCCGTCTT，
IHHNV-Pf(SEQ ID NO. 11) :5' —GAAAACCAGACTACGACAAT，
IHHNV-Pr(SEQ ID NO. 12) :5' -TCGTACTGGCTGTTCATC， 分别对WSSV及IHHNV基因进行扩增，得到635bp及523bp的条带，回收该片段后，
分别与T载体连接，转化大肠杆菌，验证后，提取质粒，分别稀释至200copies/ y 1，之后再
等量混合；从而对虾WSSV及IHHNV DNA的T载体重组质粒，各100copies/ ii 1 。 (11)阴性对照管，l管，内装100iU灭菌双蒸水。 (12)研磨棒，5支。 (13)盒子(78 X 78 X 50mm)。 (14) —块泡沫板，泡沫板高22mm，有三列空，第-列四个孔，孔径5. 5mm，第二列三 个空，孔径10mm，第三列三个空，孔径15. 5mm。上述各小管放置于这些小孔中，泡沫板与上 述盒子的底面大小相同，装于盒子中。
(15)试剂盒使用说明书_份。 实施例2、一种同时检测对虫下WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒(5样 份)，其仅以下内容不同于实施例l，其余均同实施例1。 研磨液配制2M的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl， pH8. 0)5份，O. 5M的乙二胺四乙 酸二钠(EDTANa》l份，质量分数7X的十二烷基磺酸钠(SDS) 7份，巯基乙醇1份，8-羟基 喹啉0. 02份，平衡酚5份，氯仿10份，以双蒸水定容到100份而成。 multi-LAMP反应液由以下组份组成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和IHHNV-BIP各1 ii M，multi-LAMP引物WSSV-F3、WSSV-B3、 IHHNV-F3和IHHNV-B3 各O. liiM，dATP、dGTP和dCTP各2mM，dTTP、dUTP各lmM，Tris-HC110mM，KCl 10mM， (NH4)2S04 5mM，MgS04 4mM， Triton X-100 0. 05%， Betaine 1. 2M ;其余为双蒸水。
实施例3、一种同时检测对虫下WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒(5样 份)，其仅以下内容不同于实施例l，其余均同实施例1。 研磨液配制1. 5M的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl， pH8. 0)7份，1. 0M的乙二 胺四乙酸二钠溶液(EDTANa2) 0. 5份，质量分数10%的十二烷基磺酸钠溶液(SDS) 5份，巯基 乙醇0. 01份，8-羟基喹啉0. 015份，平衡酚10份，氯仿10份，以双蒸水定容到100份而成。
multi-LAMP反应液由以下组份组成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和IHHNV-BIP各4 ii M，multi-LAMP引物WSSV-F3、WSSV-B3、 IHHNV-F3和IHHNV-B3 各0. 4线dATP、 dGTP和dCTP各0. 5mM， dTTP、 dUTP各0. 25mM， Tris-HC140mM， KC1 20mM， (NH4)2S04 15mM，MgS04 4mM， Triton X-1001 %， Betaine 0. 8M ;其余为双蒸水。
实施例4、一种同时检测对虫下WSSV和IHHNV的方法，利用上述实施例1 实施例3中任意一种试剂盒，依次进行下列步骤 (1)、取待测品对虾的头胸部组织0. 2g置于离心管I中，加入0. 5ml研磨液，用研 磨棒充分磨碎至桨状； (2)、将上述研磨所得的浆状样品煮沸(IO(TC， 10min)后以10000r/min离心5min， 取上清液置于离心管II中； (3)、向离心管11内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀，所述乙酸钠溶液与 步骤(2)所得上清液的体积比为1/10 ;再加入-2(TC预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇 混合，静置10min，以12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物，所述无水乙醇与步骤 (2)所得上清液的体积比为2 : 1 ; (4)、用核酸提取液C管内的lml乙醇溶液洗涤上述步骤(3)所得的沉淀物，然后 以12000r/min离心5min，弃去上清液，并保留沉淀物； (5)、用核酸提取液C管内的lml乙醇溶液洗涤上述步骤(4)所得的沉淀物，然后 以12000r/min离心5min，弃去上清液，并保留沉淀物； (6)，将上述步骤5)所得的沉淀物于室温晾干，加入20 iU TE缓冲液溶解沉淀物， 得到样品核酸； (7)、分别将上述样品核酸、阴性对照双蒸水及试剂盒中的阳性对照核酸2iU，加 入43 iil multi-LAMP反应液，再加入1 yl UNG酶，分别得检测管、阴性对照管和阳性对照 管；将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于37t:保温10min进行酶解；目的是以酶解 方法消除其中可能存在的污染模板； (8)、将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管中的酶解后的反应体系分别进行如 下操作先于95t:保温5min，然后再迅速置于碎冰块中5min ; (9)、向步骤(8)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加 入2 iil Bst DNA聚合酶和2 ii 1核酸染料； (10)、将上述步骤(9)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管分别进行如下操 作先于64。C保温45min，然后于90。C保温2min，终止multi-LAMP反应；
(11)、multi-LAMP反应结束后，如果检测管内反应产物的颜色为紫色，即同阴性 对照管内反应产物的颜色，则待测品检测结果为阴性；即样品中不含其中的任意一种病毒 (WSSV或IH丽)。 如果检测管内反应产物的颜色为蓝绿色，即同阳性对照管内反应产物的颜色，则 待测品检测结果为阳性；即样品中含有其中一种(WSSV或IHHNV)或两种病毒(WSSV和 IH丽)。 对比实验1、以自然感染IHHNV的南美白对虫下作为待测样品，利用实施例1中的试 剂盒，按实施例4的方法进行检测。 结果显示阳性对照管与检查管均为蓝绿色，阴性对照管为紫色，表示该样品的检 测结果为阳性。 将上述同一只南美白对虾按照常规的PCR检测法进行检测，具体为将模板使用 引物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr进行PCR扩增，并测序，结果证实是IHHNV阳性结果。
对比实验2、以自然感染WSSV的南美白对虾作为待测样品，利用实施例1中的试剂 盒，按实施例4的方法进行检测。
结果显示阳性对照管与检查管均为蓝绿色，阴性对照管为紫色，表示该样品的 WSSV检测结果为阳性。
将上述同一只南美白对虾按照常规的PCR检测法进行检测，具体为将模板使用 引物WSSV-Pf和WSSV-Pr进行PCR扩增，并测序，结果证实是WSSV阳性结果。
对比实验3、以混合感染WSSV和IHHNV南美白对虾作为待测样品，利用实施例1中 的试剂盒，按实施例4的方法进行检测。 结果显示阳性对照管与检查管均为蓝绿色，阴性对照管为紫色，表示该样品的检 测结果为阳性。 将上述同一只南美白对虾按照常规的PCR检测法进行检测，具体为将模板分别 使用引物WSSV-Pf 、WSSV-Pr和IHHNV-Pf、IHHNV-Pr进行复合PCR扩增，并测序，结果证实是 WSSV和IHHNV的阳性结果。 对比实验4. 1、以同一只南美白对虾(已确认仅感染IHHNV)作为待测样品，利用实
施例1中的试剂盒，按实施例4中步骤(1) 步骤(6)的方法制备自然感染IHHNV对虫下的
检测模板(即样品核酸)。将模板(即提取的感染IHHNV对虾DNA模板)用TE缓冲液进行
101， 102， 103， 104， 105， 106， 107倍系列稀释，分别作为multi-LAMP和PCR检测模板。 1)、按照实施例4中步骤(7) 步骤(11)所述方法，分别对1(^-107模板进行检查。 2)、以同样的模板进行PCR检测，使用引物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr 。 结果表明，本发明的LAMP反应能检测到106倍稀释的模板，而PCR只能检测至103
倍稀释的模板，LAMP检测的灵敏度比PCR高1000倍，且用时更少，设备更简单。 对比实验4. 2、以确认仅被感染WSSV的南美白对虾作为待测样品，利用实施例1中
的试剂盒，按实施例4中步骤(1) 步骤(6)的方法制备自然感染WSSV对虾的检测模板。
将模板(即提取的感染WSSV对虾DNA模板)用TE缓冲液进行IO1， 102， 103， 104， 105， 106， 107
倍系列稀释，分别作为multi-LAMP和PCR检测模板。 1)、按照实施例4中步骤(7) 步骤(11)所述方法，分别对1(^-107模板进行检查。 2)、以同样的模板进行PCR检测，使用引物WSSV-Pf 、 WSSV-Pr。 结果表明，本发明的LAMP反应能检测到106倍稀释的模板，而PCR只能检测至103
倍稀释的模板。 对比实验4. 3、以确认被同时感染WSSV和IHHNV的南美白对虫下作为待测样品，利 用实施例1中的试剂盒，按实施例4中步骤(1) 步骤(6)的方法制备自然感染WSSV和 IHHNV对虫下的检测模板。将模板(即提取的感染WSSV和IHHNV对虫下DNA模板)用TE缓冲 液进行IO1， 102， 103， 104， 105， 106， 107倍系列稀释，分别作为multi-LAMP和PCR检测模板。
1)、按照实施例4中步骤(7) 步骤(11)所述方法，分别对1(^-107模板进行检 查。 2)、以同样的模板进行PCR检领lj ，使用引物WSSV-Pf 、 WSSV-Pr禾P IHHNV-Pf 、 I朋NV-Pr进行复合PCR扩增。 结果表明，本发明的LAMP反应能检测到1(f倍稀释的模板，而PCR只能检测至103 倍稀释的模板。
对比实验5. 1 对比实验5. 3，利用实施例2中的试剂盒，其余内容对应地等同于 对比实验4. 1 对比实验4. 3 : 对比实验5. 1的结果为LAMP反应能检测到10M咅稀释的模板，而PCR只能检测至 103倍稀释的模板。 对比实验5. 2的结果为LAMP反应能检测到106倍稀释的模板，而PCR只能检测至 103倍稀释的模板。 对比实验5. 3的结果为LAMP反应能检测到106倍稀释的模板，而PCR只能检测至 103倍稀释的模板。 对比实验6. 1 对比实验6. 3，利用实施例3中的试剂盒，其余内容对应地等同于 对比实验4. 1 对比实验4. 3 : 对比实验6. 1的结果为LAMP反应能检测到10M咅稀释的模板，而PCR只能检测至 103倍稀释的模板。 对比实验6. 2的结果为LAMP反应能检测到106倍稀释的模板，而PCR只能检测至 103倍稀释的模板。 对比实验6. 3的结果为LAMP反应能检测到106倍稀释的模板，而PCR只能检测至 103倍稀释的模板。 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQ ID NO. 1 :ctgcaacctc aaaaategcc tctgttttgg cagtttcttccgttcttttg t51SEQ ID NO. 2 :gcgagc朋gg c朋tttcagc ttttca朋tc C朋g3ggC3Ctccaaat47SEQ ID NO. 3 :ctcctgcgat aaagggatgt c21SEQ ID NO. 4 :3gttgg3t gg3ttg3ggC gt22SEQ ID NO. 5 :gtccttggag tecaagagtg tttettttte atcttegcttggateatcat cgt53SEQ ID NO. 6 :gaaaatctct teccatcggt gcattttgaa ggtgtttgag tctcct46SEQ ID NO. 7 :cgacatccgt gteccaga18SEQ ID NO. 8 :agagcgtegg actttccg18SEQ ID NO. 9 :agccaaccaa gcacccgt18SEQ ID NO. 10 :
cgatttcctc ccccgtctt 19 SEQ ID NO. 11 : gaaaaccaga ctecgacaat 20 SEQ ID NO. 12 : tcgtactggc tgttcatc 18
权利要求
一种同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂盒，其特征是该试剂盒包括(1)、研磨液管内装研磨液；(2)、核酸提取液A管内装乙酸钠溶液；(3)、核酸提取液B管内装无水乙醇；(4)、核酸提取液C管内装质量浓度为70％的乙醇；(5)、TE缓冲液管内装TE缓冲液；(6)、UNG酶管内装尿嘧啶DNA糖基化酶；(7)、multi-LAMP反应液管内装multi-LAMP反应液；(8)、BstDNA聚合酶管内装Bst DNA聚合酶；(9)、显色剂管内装核酸染料SYBR Green I；(10)、阳性对照核酸管内装拷贝数比为1∶1的对虾WSSV和IHHNV阳性DNA；(11)、阴性对照管内装灭菌的双蒸水。
2. 根据权利要求书1所述的同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂 盒，其特征在于所述研磨液是由以下体积份的组份组成1 2M的三羟甲基氨基甲烷溶液5 IO份，O. 25 l.OM的乙二胺四乙酸二钠溶液 0. 5 2. 0份，质量浓度5 10%的十二烷基磺酸钠溶液5 10份，巯基乙醇0. 01 1. 0 份，8-羟基喹啉0. 01 0. 02份，平衡酚5 10份和氯仿5 10份，以双蒸水定容到100 份。
3. 根据权利要求书2所述的同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试 剂盒，其特征在于所述multi-LAMP反应液由以下组份组成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP禾P IHHNV-BIP各1 4 ii M， multi-LAMP弓|物WSSV-F3、 WSSV-B3、 IHHNV-F3和IH丽-B3各0. 1 0. 4线dATP、 dGTP和dCTP各0. 5 2mM， dTTP、 dUTP各 0. 25 lmM，Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM， (NH4) 2S045 15mM，MgS04l 4mM， Triton X-1000. 05% 1. 0%， Betaine 0. 8 1. 2M ;其余为双蒸水。
4. 根据权利要求书3所述的同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温扩增检测试剂 盒，其特征在于所述multi-LAMP引物的核酸序列如下<formula>formula see original document page 2</formula>I朋NV-F3 :<formula>formula see original document page 2</formula>
5.利用如权利要求书1 4中任意一种试剂盒同时检测对虾WSSV和IHHNV的方法，其 特征在于包括下列步骤(1) 、取待测品对虾的头胸部组织0. 2g置于离心管I中，加入0. 5ml研磨液，用研磨棒 充分磨碎至桨状；(2) 、将上述研磨所得的浆状样品煮沸后以10000r/min离心5min，取上清液置于离心 管II中；(3) 、向离心管I1内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀，所述乙酸钠溶液与步骤 (2)所得上清液的体积比为1/10 ;再加入-2(TC预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇混合， 静置10min，以12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物，所述无水乙醇与步骤(2)所 得上清液的体积比为2 : 1;(4) 、用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤(3)所得的沉淀物，然后以12000r/ min离心5min，弃去上清液，保留沉淀物；(5) 、用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤(4)所得的沉淀物，然后以12000r/ min离心5min，弃去上清液，保留沉淀物；(6) ，将上述步骤(5)所得的沉淀物于室温晾干，加入20 iU TE缓冲液溶解沉淀物，得 到样品核酸；(7) 、分别在上述样品核酸、阴性对照管内的双蒸水及阳性对照核酸管内的阳性对照核 酸2iil中，加入43ii1 multi-LAMP反应液，再加入liil UNG酶，分别得检测管、阴性对照管 和阳性对照管；将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于37t:保温10min进行酶解；(8) 、将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管中的酶解后的反应体系分别进行如下操 作先于95t:保温5min，然后再迅速置于碎冰块中5min ;(9) 、向步骤(8)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加入 2 ii 1Bst DNA聚合酶和2 ii 1核酸染料SYBR Green I ;(10) 、将上述步骤(9)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管分别进行如下操作先 于64。C保温45min，然后于90。C保温2min完成multi-LAMP反应；(11) 、multi-LAMP反应结束后，如果检测管内反应产物的颜色同阴性对照管内反应产 物的颜色，则待测品检测结果为阴性；如果检测管内反应产物的颜色同阳性对照管内反应 产物的颜色，则待测品检测结果为阳性。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测对虾WSSV和IHHNV的核酸多重等温扩增检测试剂盒，包括内装研磨液的研磨液管、内装乙酸钠溶液的核酸提取液A管、内装无水乙醇的核酸提取液B管、内装质量浓度为70％的乙醇的核酸提取液C管、内装TE缓冲液的E缓冲液管、内装尿嘧啶DNA糖基化酶的UNG酶管、内装multi-LAMP反应液的multi-LAMP反应液管、内装Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管、内装核酸染料SYBR Green I的显色剂管、内装拷贝数比为1∶1的对虾WSSV和IHHNV阳性DNA的阳性对照核酸管和内装灭菌双蒸水的阴性对照管。本发明还同时提供了一种检测灵敏度高的同时检测对虾WSSV和IHHNV的方法。
文档编号C12Q1/68GK101792818SQ20091015431
公开日2010年8月4日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者何琳, 徐海圣, 王美珍 申请人:浙江大学