专利名称：一种对虾病毒感染模型的建立方法
技术领域：
本发明属于抗病毒研究领域，特别涉及一种对虾病毒感染模型的建立方法。
背景技术：
对虾繁殖力強，生长迅速，肉味鲜美等特点。而凡纳滨对虾又具有广泛的适盐性和抗病カ较强的特点，因而被世界大面积养殖。我国养殖对虾品种中80%以上是凡纳滨对虾。对奸白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)以其对宿主的泛嗜性、高致病性以及高致死率而位居对虾病毒之首。感染对虾一般在3 IOd内死亡率可高达100%。由于对奸与其他无脊椎动物ー样,特异性免疫机制的缺乏导致其病毒病防治一直以 非特异性预防为主，缺少特异性的防治方法。因此，WSSV几乎毎年均给我国对虾养殖业带来巨大经济损失，塘ロ因暴发白斑症而导致对虾绝收的现象也常有发生。鉴于我国凡纳滨对虾在我国水产养殖业中的重要地位，寻求高效、特异的防治WSSV的方法成为确保我国对虾养殖业健康发展的关键。RNA干扰(RNAi)技术是在真核细胞中由双链RNA (dsRNA)诱导的特异性RNA降解过程，在细胞水平和动植物体内均表现出高效特异的抗病毒能力。近几年的相关研究证明，RNAi在水生无脊椎动物体内也能激发高效的抗病毒效应。由于WSSV基因组序列已经明确，因此，运用RNA干扰技术抗WSSV、研究抗病毒专用制剂是完全可能的。但是，我们在脊椎动物中的RNA干扰抗病毒研究方法并不适用于对虾这样的水生无脊椎动物。因为对虾没有稳定的传代细胞系，相关RNA干扰研究只能直接在对虾体内水平进行；而不同批次的对虾由于个体差异很大，它们对病毒的易感性必定不同。在这样的条件下进行RNA干扰抗病毒试验势必会影响实验结果的重现性和可信度。因此，建立ー个相对稳定的RNA干扰研究体系对于在对虾体内水平进行RNA干扰研究是必不可少的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对虾病毒感染模型的建立方法，该方法建立的对虾病毒感染模型重现性好，RNA干扰研究结果可信度高。本发明的一种对虾病毒感染模型的建立方法，包括(I)将人工接种WSSV后发病死亡的凡纳滨对虾去除附肢、头胸甲和肝胰腺并称重，与0. OlM PBS按质量体积比I : 10稀释，玻璃匀浆器匀浆，匀浆液于4°C离心20min，上清液依次用滤纸和0. 45 ii m滤膜过滤除菌井分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(2)体重7 9g、PCR检测阴性的健康凡纳滨对虾在室内池塘暂养I周后，随机分组，每组14只，分别暂养于玻纤桶中；每次RNA干扰实验前将病毒保存液稀释成10_(n_2)、10_(n_D、10_n、10_(n+1)、10_(n+2)共5个浓度的感染液，用胰岛素注射器分别于凡纳滨对虾第四腹节处肌肉注射，每尾50 u L，对照组同法注射0. OlM PBS ;对虾养殖水温控制在27 28°C，每天换水l/2，24h持续充气；每天观察四次，捡出死亡和濒死对虾，记录死亡数，持续观察8d ；
(3)根据判定标准，进行RNA干扰实验时，病毒感染液浓度为病毒保存液作10_n倍稀释，既而确定对虾的病毒感染量，建立病毒感染模型。所述步骤(2)中n的值为新收集病毒保存液预感染对虾后，7天内致90%以上对虾死亡的最大稀释度。所述步骤(2)中每批对虾建立模型用病毒均来自(I)中同批收集井分装的病毒保存液。所述步骤(2)中的观察天数为8天。所述步骤(3)中的判定标准为7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒保存液的稀释度作为RNA干扰用病毒感染浓度。有益效果 通过本发明的方法建立的对虾病毒感染模型重现性好，RNA干扰研究结果可信度高；操作简便，判断标准明晰，不仅适用于RNA干扰的抗病毒研究，也可用于将来RNA干扰制剂在水产实践中的推广应用。
图I为凡纳滨对虾WSSV感染模型的建立；图中显示的是凡纳滨对虾感染不同稀释度的WSSV保存液后在7天内的累积死亡率；图中E-I到E-5分别代表不同组的WSSV保存液的稀释度=KT1到10_5 ；图2是不同shRNA处理组(包括阳性和阴性对照组)凡纳滨对虾体内WSSV的PCR检测结果；其中，Al和A2为第一次实验的结果；A1为各组对虾样品的WSSV平均感染量；A2为同组对虾体内18S核糖体DNA平均表达量；B1和B2为第二次重复实验(另ー批对虾病毒感染模型)的結果。图中2 6列分别代表不同的RNA干扰处理组的结果；1和7分别代表阳性和阴性对照的結果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例IWSSV病毒分离和病毒保存液的制备将人工接种WSSV后发病死亡的凡纳滨对虾去除附肢、头胸甲和肝胰腺并称重，与0.01M PBS (pH 7.4)1 10(g/mL)稀释，玻璃匀浆器匀浆，匀浆液于4°C 4000rpm离心20min,上清液依次用滤纸和0. 45 ii m滤膜过滤除菌井分装成病毒保存液，_80°C冻存备用。不同浓度WSSV保存液感染凡纳滨对虾体重7 9g、PCR检测阴性的新购健康凡纳滨对虾在室内池塘暂养I周后，随机分组，每组14只，分别暂养于90L的白色玻纤桶中。将病毒保存液稀释成10'10_2、10_3、10_4、10_5共5个浓度的感染液(通过新分离病毒保存液预感染对虾后获知稀释度范围)，用胰岛素注射器分别于凡纳滨对虾第四腹节处肌肉注射，每尾50 y L，对照组同法注射0. OlMPBS (pH7. 4)。对虾养殖水温控制在27 28 °C，每天换水1/2，24h持续充气。每天观察四次，及时捡出死亡和濒死对虾，记录死亡数，持续观察8d。对虾累积死亡率观察法确定该次RNA干扰研究的对虾病毒感染量如图I所示，随着WSSV感染浓度的降低，凡纳滨对虾死亡高峰的出现时间相对延后，且观察时间内对虾累积死亡数相对减少；当WSSV保存液的稀释度在KT1 10_3倍吋，7d内对虾几乎全部死亡(大于90%)，而稀释度为10_4倍时死亡数明显减少(小于90 %)。根据本发明的判定标准7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒保存液稀释度作为RNA干扰用病毒感染浓度。因此，该批对虾进行RNA干扰实验时，适用的病毒感染液浓度为病毒保存液作10_3倍稀释(n = 3)。由于每只对虾的病毒感染体积是固定的(50 u L/只)，因而对虾的病毒感染量也随之确定，病毒感染模型成功建立。利用以上方法建立WSSV感染模型进行RNA干扰抗WSSV的研究，实验重复2次。如图2所示，两次实验(对应图中A、B)后半定量PCR对对虾体内病毒感染量的检测结果基本 一致。而且，实验还表明，WSSV的感染量结果与对虾死亡率实验结果也基本一致。
权利要求
1.一种对虾病毒感染模型的建立方法，包括 (1)将人工接种WSSV后发病死亡的凡纳滨对虾去除附肢、头胸甲和肝胰腺并称重，与O.OlM PBS按质量体积比I : 10稀释，玻璃匀浆器匀浆，匀浆液于4°C离心20min，上清液依次用滤纸和O. 45 μ m滤膜过滤除菌井分装成病毒保存液，-80°C冻存备用； (2)体重7 9g、PCR检测阴性的健康凡纳滨对虾在室内池塘暂养I周后，随机分组，每组14只，分别暂养于玻纤桶中；每次RNA干扰实验前将病毒保存液稀释成loi'ioin、10_n、10_(n+1)、10_(n+2)共5个浓度的感染液，用胰岛素注射器分别于凡纳滨对虾第四腹节处肌肉注射，每尾50 μ L，对照组同法注射O. OlM PBS ;对虾养殖水温控制在27 28°C，每天换水1/2，24h持续充气；每天观察四次，捡出死亡和濒死对虾，记录死亡数，持续观察8d ； (3)根据判定标准，进行RNA干扰实验时，病毒感染液浓度为病毒保存液作10_n倍稀释，既而确定对虾的病毒感染量，建立病毒感染模型。
2.根据权利要求I所述的ー种对虾病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步骤(2)中η的值为新收集病毒保存液预感染对虾后，7天内致90%以上对虾死亡的最大稀释度。
3.根据权利要求I所述的ー种对虾病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步骤(2)中每批对虾建立模型用病毒均来自(I)中同批收集并分装的病毒保存液。
4.根据权利要求I所述的ー种对虾病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步骤(2)中的观察天数为8天。
5.根据权利要求I所述的ー种对虾病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步骤(3)中的判定标准为7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒保存液的稀释度作为RNA干扰用病毒感染浓度。
全文摘要
本发明涉及一种对虾病毒感染模型的建立方法，包括(1)WSSV病毒分离和保存液的制备；(2)不同浓度WSSV保存液感染凡纳滨对虾；(3)对虾累积死亡率观察法确定该次RNA干扰研究的对虾病毒感染量。通过本发明的方法建立的对虾病毒感染模型重现性好，RNA干扰研究结果可信度高；操作简便，判断标准明晰，不仅适用于RNA干扰的抗病毒研究，也可用于将来RNA干扰制剂在水产实践中的推广应用。
文档编号A01K61/00GK102613112SQ20121006279
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者万夕和, 周俊芳, 房文红 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所