一种建立胰腺癌模型的方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于动物模型的建立方法，具体涉及利用慢病毒介导癌基因的过表达及抑癌基因的敲降以诱导树駒胰腺癌模型的方法。
【背景技术】
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[0002]胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来明显上升，5年生存率〈5%，是预后最差的恶性肿瘤之一。研究胰腺癌的发生发展机制、寻找有效的检测及治疗手段是非常重要的，而肿瘤动物模型是研究肿瘤发生发展机制、探索新的治疗靶点、新的治疗手段及药物开发的重要工具之一。
[0003]目前，有关胰腺癌的动物研究主要在以啮齿类动物建立的胰腺癌模型上进行，但是啮齿类与人类的物种差异性较大，不能很好地模拟人类疾病；随着树駒基因组测序完成，以及部分蛋白组学的研究提示树駒与灵长类亲缘关系最为接近，这为树駒作为一种新型实验动物模型，在人类重大疾病研究领域部分替代非人灵长类动物提供了重要依据。
[0004]现有的胰腺癌动物模型主要包括:基因工程鼠模型、裸鼠移植瘤模型、化学致癌剂诱导模型等；这些模型存在一定的缺陷性:不能很好地模拟人类疾病的发病机理、诱发周期长、诱发率低等。近年来，慢病毒技术由于具有感染物种局限性小、分裂期和静止期细胞均可有效感染、转移的DNA片段大、目的基因表达时间长等优点，在基因过表达和沉默中获得了广泛应用，包括在体外细胞水平和体内感染等。
[0005]本发明将采用慢病毒技术表达特定的癌基因同时沉默抑癌基因，诱导树駒胰腺癌模型。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是针对现有胰腺癌模型的不足，提供一种以与人类亲缘关系更近的动物——树駒，建立诱导周期短、诱发率高且稳定、操作简单方便的胰腺癌动物模型的方法。
[0007]本发明的建立胰腺癌模型的方法，根据TCGA数据库人类胰腺癌中变异率最高的癌基因和抑癌基因，构建过表达一个癌基因、同时敲降两个抑癌基因的慢病毒，在胰腺头部原位注射此慢病毒，以诱导胰腺癌的发生。
[0008]所述的同一个慢病毒载体中过表达人类胰腺癌中变异率最高的癌基因为Kras，同时敲降抑癌基因为TP53和⑶KN2A。
[0009]所述的以与人类亲缘关系更近的树駒为对象，将慢病毒原位注射到树駒胰腺头部以诱导胰腺癌发生。
[0010]本发明的建立胰腺癌模型的方法，具体包括以下步骤:
[0011](I)慢病毒载体的构建
[0012]根据TCGA数据库中人类胰腺癌变异率最高的癌基因Kras和抑癌基因TP53和⑶KN2A，以pTomo空载体为出发质粒，通过一系列常规的酶切连接在CMV启动子后面引入KrasG12D以过表达Kras G12D,然后用自带Hl启动子的shRNA敲降TP53和CDKN2A ；
[0013](2)病毒包装、滴度测定及体外验证
[0014]将构建好的慢病毒载体和包装质粒pCMV8.l、pMD2.G共转染HEK293T细胞，转染后6小时更换新的完全培养基(含10% FBS, I % penicillin/Streptomycin)，分别在48h、72h收集病毒上清，0.45um过滤除去细胞碎片后，用25000rpm、4°C离心2.5h浓缩病毒，PBS溶解；用QPCR检测病毒滴度，滴度值达到1.5xl(T12;用病毒体外感染树駒原代肝脏细胞96h后，提取RNA，QPCR检测TP53和CDKN2A的敲降效果；
[0015]⑶病毒注射
[0016]选取野生驯养或者人工繁殖的Fl成年树駒，用氯胺酮麻醉后，用胶带将树駒仰面固定在消毒泡沫板上，剃毛后用75%酒精对腹部进行消毒，无菌剪刀在距离胸骨1-1.5cm的位置剪开腹部，创口 1cm，用无菌镊子找到胰腺，确认胰腺头部，用微量注射器原位注射含0.4%的 trypan blue 的病毒 20ul ；
[0017](4)树駒的监测和病理鉴定
[0018]注射病毒后实时监控树駒的状态，注射后2周时树駒开始发病，解剖后手术剥取胰腺肿瘤组织，胰腺肿瘤组织液氮冷冻后-80°C保存，其余组织按常规组织病理检测方法进行固定、脱水、包埋，H&E染色检测组织病理特征及肿瘤所属类型，确定慢病毒诱导的树駒胰腺癌模型属于胰腺导管腺癌。
[0019]本发明具有以下优点和积极效果:
[0020]1、利用亲缘关系与人类更近的树駒，建立了胰腺癌模型的方法。相对于啮齿类的动物模型，树駒胰腺癌模型应能更好的模拟人类胰腺癌的发生发展。
[0021]2、本发明方法快速高效，注射病毒后2周即能诱发胰腺癌，周期短，且诱发成功率达到85%。
[0022]3、构建的慢病毒载体中过表达的癌基因Kras，敲低的抑癌基因为TP53和⑶KN2A，这三个基因都是人类胰腺癌中变异率最高的基因。因此，本发明建立的树駒胰腺癌模型能很好的模拟人类胰腺癌的遗传机理，该模型在胰腺癌基础研究及抗肿瘤药物的测试上具有很大的应用潜力。
[0023]4、本发明方法操作简单快捷，且对实验条件要求不高，只需要普通的动物实验室，简易的操作台，普通的剪刀、镊子、微量注射器即能完成实验，因此该方法极易广泛推广应用。
【附图说明】
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[0024]图1是TCGA数据库中人类胰腺癌样本中突变率最高的基因及其突变率；
[0025]图2是本发明构建的慢病毒载体示意图，在同一个慢病毒载体中过表达癌基因Kras，敲降抑癌基因TP53和CDKN2A ；
[0026]图3是慢病毒载体中两个shRNA在树駒细胞中的敲降效率检测，其中TP53敲降率达到97%，CDKN2A敲降率达到77% ；
[0027]图4是树駒发病后的解剖示意图，如图中箭头所指，能够看到树駒胰腺上有明显的肿瘤，肿瘤大小达到1.5cm ；
[0028]图5是注射病毒后树駒的生存曲线，从图中看到树駒的发病时间集中在2-3周之间；
[0029]图6是本发明所诱导的树駒胰腺癌的H&E染色，其病理特征包括:具有分化程度不同的导管样结构的腺体，伴有丰富的纤维间质(B-D);细胞形状多样化，大小不一，部分细胞变大，且细胞胞质呈透明状，也会有部分嗜酸性细胞(E-F);细胞核表现出多形性，染色较深，且核仁较显著，部分细胞的细胞核位于细胞基底，失去极性(G-1)。
【具体实施方式】