专利名称：一组早期胰腺癌模型差异表达的相关蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及差异蛋白质组学技术，更具体地讲，涉及一组早期胰腺癌模型差异表 达的相关蛋白质及其应用。
背景技术：
胰腺癌具有起病隐匿，早期发生转移，恶性程度高等生物学特性，造成胰腺癌早期 诊断困难，临床治疗效果差。建立较理想的胰腺癌早期诊断肿瘤标记物，通过对正常或高危 人群进行筛检，早期发现可疑病例，对提高胰腺癌的临床早期诊断水平和治疗效果等都具 有十分重要的意义。目前常用的诊断方法对早期胰腺癌的诊断率也非常低，目前的方法主要包括(1) 影像学和内镜检查计算机断层扫描(computed tomography, CT)在评断胰腺癌分期，预 测手术切除率方面具有一定优越性，但在诊断直径小于Icm的胰腺癌，诊断淋巴结浸润转 移和肝内小转移灶等方面准确性下降，近年来随着多排螺旋CT性能的改善，诊断效率有 所提高。核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)在诊断肝内转移灶方面优 于CT，但对淋巴结浸润诊断效果却比CT差，核磁共振胰胆管造影(magnetic resonance cholangio-pancreatography MRCP)和核磁共振血管造影可以提供胰腺胆管异常和血管壁 浸润等方面的信息。超声内镜(endoscopic ultrasound,EUS)是一种效价比较高的诊断方 法，可以发现较小的胰腺肿瘤，可以比CT更准确的评估肿瘤大小和淋巴结受累情况。EUS引 导下的细针吸引活检可以完成原发肿瘤、淋巴结和远处转移灶的病理学诊断。逆行性胰胆 管造影(endoscopic cholangio-pancreatography ERCP)是一种有创性检查方法，可以详 细反映主胰管及其分支的病变情况，并且可以完成胰腺导管活检，细胞刷细胞学检查，以及 胰液收集进行细胞学和基因检测。腹腔镜和腹腔镜超声可以发现隐藏的腹膜转移灶和其他 方法漏诊的肝内转移灶，但目前多推荐用于胰腺癌的术前评估检查。(2)血清肿瘤标记物血清肿瘤标记物具有较长的发展历程，目前临床常用的有 CA19-9, CA50、CA242, Span-I、MIC-I、Dupan-2等较多种类，但其灵敏性和特异性均不十分 理想，对早期胰腺癌的诊断效果更加不尽人意。CA19-9为迄今为止报道的对胰腺癌敏感性 最高的标志物，但在胰腺癌早期或肿瘤较小时可以正常。(3)基因突变检测基因组学发展为胰腺癌的诊断提供了新的手段。K-ras基因突 变是胰腺癌发生最频繁的基因变异，胰腺癌患者的外周血、胰液、十二指肠液、粪便以及细 针抽吸或胰管刷检标本中具有较高的κ-ras基因突变。κ-ras基因突变也出现在导管增生 等胰腺癌癌前病变中，尽管降低了诊断的特异性，但为更早更好的诊断预测提供了可能。其 他开展的基因突变检测还有抑癌基因P53、P16、Smad4等。(4)蛋白质标记物近年来随着蛋白质组学特别是差异蛋白质组学研究的兴起， 为胰腺癌早期诊断标记物的研究提供了一种新的研究方法。以双相电泳结合质谱为代表的蛋白质分离鉴定技术路线是经典的蛋白质组学核 心技术，蛋白质样品中不同类型的蛋白质可以通过双相电泳进行分离，其原理是第一相按蛋白质的等电点不同而用等电聚焦分离，第二相则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，从而 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。质谱技术是目前蛋白质组学研究中发展 最快，也最具活力和潜力的技术之一，它通过灵敏而高通量地测定蛋白质的PMF来判别蛋 白质的种类，从而得到蛋白质的定性数据。双相电泳的主要问题是结果可重复性差，稳定 性差，导致无法有效地区分系统误差和样品间的真正差异，因此需要花费大量的时间和劳 动进行重复以期得到更准确的定量结果。差异凝胶电泳(DIGE)技术在传统双相电泳技术 的基础上结合了多重荧光标记分析的方法，用于蛋白质标记的荧光染料包括三种，分别是 Cy2, Cy3和Cy5。这些荧光标记物化学结构上相似，分子量接近，带有相同的活化基团-NHS 脂，可以特异性标记在赖氨酸残基的ε氨基上，由于三种染料均带有一个正电荷，分子量 和电荷是匹配的，标记后的蛋白质不应该有等电点上的改变，分子量上的改变也基本保持 最小，而且不同荧光染料导致的分子量改变应该一致。由于不同的荧光标记样品有不同的 激发波长，可通过不同的滤光片记录互不干扰的胶图结果。多色荧光标记使得在同一块胶 中分离并分析多个样本成为可能，这样有效避免了不同胶间的系统误差。DIGE技术第一次在双相电泳中引入了内标，DIGE的内标是将试验中所有样品取 等量混合，单独用一种荧光染料(通常是C^标记，和所有样品一起电泳，这意味着所有样 品中的蛋白质点都会有对应的内标，通过内标可以方便的对胶内不同荧光染料标记的样品 和胶间样品进行归一化定量，而且不同凝胶之间的匹配变得十分轻松。传统双相电泳技术 可分别在等电点和分子量两个方向上对蛋白质组进行分离，然而在第三个方向即定量准确 性上并不尽如人意。内标在双相电泳中的引入，极大地提高了结果的定量准确性、可靠性和 重复性，有效降低了系统误差，确保了实验结果的高可信度。近年来利用DIGE技术，研究者对胰腺癌进行了多项差异蛋白质组学研究，以期冀 发现与胰腺癌发病、转移相关，或具有诊断价值的蛋白质标记物。仇KH等和Kakisaka T等 分别利用高效液相色谱法和免疫吸附法去除血清高丰度蛋白后，利用DIGE结合质谱技术 比较研究了正常人和胰腺癌患者的血清差异蛋白质组，发现了一些在胰腺癌表达显著差异 的蛋白质。此外，DIGE技术还被用于研究正常人和胰腺导管腺癌患者胰液中的蛋白质组， 发现并验证了 MMP-9，DJ-1和AlBG蛋白具有显著差异表达。胰腺癌具有早期发生转移的特 点，有研究分别利用高转移性和低转移性胰腺癌细胞株，以及有淋巴结转移和无淋巴结转 移胰腺癌组织，利用DIGE结合质谱技术发现的一些差异蛋白质可能与胰腺癌侵袭转移机 制密切相关。建立符合人类胰腺癌主要特征的动物模型是深入开展胰腺癌研究的重要基础，通 常这些特征应包括以下几个方面(1)为胰腺导管表现型和推测的胰腺导管细胞起源；(2) 广泛的结缔组织反应性增生；C3)疾病进展可导致胆道和胃的梗阻；(4)以神经浸润和腹 膜、肝脏早期侵袭性转移为特征；( 具有较高的K-ras基因、P16基因和P53基因突变。目 前建立胰腺癌的动物模型的方法主要包括裸鼠移植瘤模型、基因工程小鼠模型和化学致 癌物诱癌模型。不同种类的胰腺癌动物模型分别具有其优点和缺点，因此针对各自特点可 以用于不同目的的实验研究。裸鼠的胰腺癌移植模型通过在裸鼠皮下组织植入组织或细胞 系，可以实现胰腺癌的异位移植，但是产生的肿瘤通常局限于局部生长而很少转移，而且由 于胰腺癌细胞的多次传代，基因的不稳定性增加，可能会出现一些改变原发肿瘤特征的基 因改变，该模型多用于研究胰腺癌生物学和药物治疗效果等。基因工程胰腺癌模型主要为转基因小鼠模型，通过转染胰腺癌基因或生长因子基因过度表达创建胰腺癌模型，多用于 胰腺癌转化及进展的研究。多种化学致癌物已经被应用诱导胰腺癌动物模型，主要包括有 重氮丝氨酸、亚硝基胺和DMBA等。重氮丝氨酸诱导产生的是胰腺腺泡细胞癌，没有出现胰 腺导管的增生和改变，不同于人类导管起源的胰腺癌；而亚硝基胺诱导的胰腺癌尽管能够 表达导管细胞角蛋白标记物，并且具有K-ras基因突变，但是亚硝基胺诱导缺乏对胰腺的 特异性和选择性，在诱导出胰腺癌的同时易诱导出其他脏器肿瘤。DMBA最初于1975年开始被用于诱导大鼠的胰腺腺癌，尽管当时的研究证明DMBA 诱导的胰腺癌具有导管表现型，但是由于后来Bockman通过实验推断DMBA诱导的肿瘤不 是导管起源的，而是腺泡细胞去分化的结果，腺泡细胞经过去分化呈现导管的形态，这种结 果假设使得DMBA诱导胰腺癌模型的方法遭到冷遇。直至1997年，DMBA诱导胰腺癌模型的 效果被重新评估，研究证实DMBA胰腺组织内植入或导管内注射能可靠的诱导出胰腺癌，病 理组织学上诱导的肿瘤表现为在显著的纤维组织增生间质内有不规则的侵袭性腺体，同时 可以观察到胰腺导管的增生、萎缩以及不典型增生直至侵袭性癌等多种病理改变，提示了 DMBA诱导后胰腺导管由正常上皮向侵袭性癌的逐步转变。对DMBA诱导的胰腺癌进行导管 和腺泡细胞标记物表达的免疫组化检测发现，细胞角蛋白19、20等导管细胞标记物表达阳 性而腺泡细胞标记物糜蛋白酶表达阴性，而且在DMBA植入2周后的癌前病变组织中同样提 示细胞角蛋白19表达阳性而糜蛋白酶表达阴性，但周围正常胰腺组织糜蛋白酶表达阳性， 这些研究提示DMBA诱导的胰腺癌与人胰腺癌类似，可能实际为胰腺导管起源，而并不是 Bockman认为的胰腺腺泡起源。在PanIN分级系统推出建立后，依据该分级标准对DMBA小鼠胰腺局部种植诱导产 生的诱癌效果进行分析发现，在1月的较短时间内，DMBA已经可以诱导出级别丰富的PanIN 和早期胰腺癌病理学变化，并且不诱导其他脏器肿瘤，大大缩短了先前实验中DMBA诱导出 肉眼可见的胰腺肿瘤需耗时9个月以上的漫长等待。DMBA诱导胰腺癌的具体机制目前了 解并不深入，但是研究发现，DMBA诱导的PanIN和胰腺癌具有高达90%的K_ras基因突变， 而且smad 4, cyclin Dl and p53等的表达水平与人胰腺癌类似。在DMBA诱导的过程中 Notch-I的表达也呈阳性，而且通过抑制Notch信号通路可以降低胰腺癌细胞的生长，因此 认为DMBA诱导胰腺癌的机制可能与Notch信号通路的激活有关。DMBA由于其自身的特质 因而成为建立胰腺癌化学诱癌模型的重要诱癌物质，近年来，DMBA诱导的胰腺癌和PanIN 模型已经被应用于胰腺癌致癌物质的确定，胰腺癌肿瘤成像诊断，胰腺癌发病的分子生物 学机制等研究中。
发明内容
本发明的目的是提供一组早期胰腺癌模型差异表达的相关蛋白质。本发明的第二个目的是提供所述相关蛋白质作为胰腺癌早期诊断标记物的应用。本发明通过建立7，12- 二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的大鼠胰腺上皮内瘤变和胰腺 癌模型，应用DIGE蛋白质分析技术，分别动态检测正常胰腺、胰腺上皮内瘤变和早期胰腺 癌大鼠胰腺组织中蛋白质的差异表达，利用生物信息学软件从中筛选出随胰腺癌变程度表 达同步发生显著变化的蛋白质，并利用质谱技术对其进行鉴定，明确在早期胰腺癌发生中 差异表达的具体蛋白质。
所述相关蛋白质是1、烯醇化酶 l(enolase 1)；2、TPT1;3、胰腺弹性蛋白酶;3B(pancreatic elastase 3B, ELA3B)；4、憐酸;I；希醇式丙丽酸幾基Sl 2(phosphoenolpyruvate carboxykinase 2)；5、羧基酯酶(carboxyl ester lipase, CEL)；6、不均一核糖核蛋白 A2/B1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNP, A2/B1)；7、染色质域解旋酶 DNA 结合蛋白 3 (chromodomain heIicase DNA binding protein 3, CHD3)；8、细胞转移抑制蛋白(non-metastatic cells 2,protein (NM23B) expressed in, NME2)；9、necdin;10、Hbp23;11、unnamed protein product ；12、retinoid χ receptor interacting protein ；13、 guanine nucleotide binding protein(G protein), beta polypeptide 2-like l(Gnb211)；14、glycine C-acetyItransferase0所述差异蛋白质点的PMF图利用Mascot软件在美国国家生物技术信息中心 (National center for biotechnology information, NCBI)数据库 O007 年 11 月 30 日 版本，567848kequences ； 1961803296residues)中搜库。通过对早期胰腺癌动物模型差异表达的蛋白质进行筛选和鉴定，有助于从蛋白质 水平揭示胰腺癌的发生机制，并为胰腺癌的干预治疗提供新靶点。本发明公开的相关蛋白 质灵敏性高，特异性强，可作为胰腺癌早期诊断的蛋白标记物，为临床早期诊断胰腺癌提供 有效方法。
下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。图1是正常胰腺、胰腺上皮内瘤变和胰腺癌之间表达显著差异的蛋白质点图。图2选择待进行质谱鉴定的差异表达蛋白质点图。图3为差异蛋白质点1402在正常胰腺㈧、PanIN(B)和胰腺癌(C)组织中的表达变化。图4为差异蛋白质点1205经MALDI-T0F MS鉴定酶解肽段的PMF图谱。图5为enolase 1蛋白在人胰腺癌及癌旁组织的表达。(A:胰腺癌表达阳 性，X200 ；B 胰腺癌表达阳性，X400 ；C 癌旁组织表达弱阳性，X200 ；D 癌旁组织表达弱 阳性，X400)。图6为人胰腺癌和癌旁组织enolase 1表达阳性细胞平均阳性率。
具体实施例方式一、早期胰腺癌模型的建立和胰腺组织标本的获得1.动物与分组雄性清洁级SD大鼠60只，体重lOO-llOg，购自中科院上海实验动物中心(生产 许可证号为SCXK (沪)2003-0003,使用许可证号为SYXK (沪)2007-0007)。在标准饲养条 件下进行饲养。大鼠随机分为1月模型组(20只)、2月模型组(20只)和正常对照组(20只)。2.手术方法手术大鼠当日晨起禁食禁水，盐酸氯胺酮100mg/kg肌肉注射麻醉，中上腹备皮消 毒铺巾，腹部正中切口开腹，充分暴露胰腺后在胰腺体部小心剪开胰腺被膜，将剪开处周围 胰腺被膜荷包缝合。模型组大鼠在荷包内植入10mg/100g体重剂量的DMBA颗粒(Sigma公 司)后，将荷包收紧结扎，确认无DMBA漏出后关腹。3.大体观察和组织HE染色模型组大鼠分别于手术后1个月和2个月处死，正常对照组大鼠与2月模型组同 时处死。剖腹观察胰腺手术部位与周围组织粘连情况，胰腺DMBA植入处的形态、质地。从 腹腔中切下胰腺组织PBS漂洗后，模型组剪取DMBA包埋种植周围胰腺组织，正常对照组剪 取少量正常胰腺组织，立即用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片进行常规HE染色。将 留取病理鉴定后的其余胰腺组织置入_80°C冰箱保存。4.胰腺上皮内瘤变和胰腺癌分级HE染色组织切片由同一位专业胰腺病理医师在不知道实验分组的情况下，依据 PanIN分级标准，对胰腺组织病变进行分级，分为PanIN-l、PanIN-2、PanIN-3和胰腺癌4级。 均以切片中出现的最高级别病变作为诊断。5.病理及分级结果大鼠手术切口未发生感染，愈合良好。模型组大鼠毛色暗淡，体重增加较缓慢。术 后实验观察期内，1月模型组、2月模型组的死亡率分别为15% (3/20),30% (6/20)。死亡 大鼠未计入病理组织学统计分析。
模型组大鼠在胰腺DMBA植入部位形成直径约0. 3-0. 6cm球形包块，切开包块少数 可见黄色残留的DMBA颗粒。包块壁的胰腺组织质地较硬，与正常胰腺组织明显不同，胰腺 与胃、肠管等周围器官粘连明显。模型组各例胰腺组织中均有明显的炎性细胞浸润和广泛 的间质结缔组织增生；除1月模型组中2例为正常导管上皮外，其它均并出现不同程度的导 管上皮增生，部分导管上皮细胞异形增生明显，突破基底膜形成胰腺癌。经病理分级证实共 形成胰腺癌11例，PanIN18例，其中PanIN-I级4例，PanIN-2级5例，PanIN-3级9例。二、胰腺上皮内瘤变和早期胰腺癌模型的差异蛋白质组学研究1.组织的获得和裂解组织标本共分为3组，分别为正常对照组(A组)，胰腺上皮内瘤变组(B组， PanIN-2级)，胰腺癌组(C组)，每组3个样品(1、2、3)。将300mg左右的胰腺组织剪切成 3mm见方的小块，用PBS洗3遍，加入DIGE裂解液(DIGE裂解液和酶抑制剂以体积比50 1 混合)约1ml，用Dounce’ s勻浆器勻浆。转入离心管中，超声破碎细胞(80W，5次，每次10 秒，间隔15秒，冰上完成)。4°C离心，15，000g, 45分钟，上清用Bradford法定量，每组内5例样品等量混合，分装成IOOyg—管，置于500μ1离心管中，低温保存(_80°C)。预备试 验，每个样品上样100 μ g，13cm pH3-10NL,做3块凝胶，判断样品2D可行性。2.双相电泳预试验第一相等电聚焦在Amersham的Ettan IPGphor等电聚焦系统仪器上进行，上样 量为lOOug，采用13cm长pH3-10非线性胶条，等电聚焦电泳条件为:30V 12hrs,500V lhr, 1000V lhr,8000V 8hrs，500V 4hrs。等电聚焦结束后，胶条取出在50mM Tris-HCl，6M尿素， 30%甘油，2% SDS, 1% DTT和痕量溴酚蓝的平衡液中平衡15min，后于2. 5%碘代乙酰胺替 换DTT的相同平衡液中平衡15min。然后将胶条移至第二相SDS线性胶上端，0. 5%琼脂 糖封顶，第二相SDS-PAGE采用Imm厚12. 5%的凝胶，施加电流15mA/胶电泳30min，后改用 电流30mA/胶，电泳直至溴酚蓝到达距离胶下沿0. 5cm处截止。整个过程中始终注意要避 光。电泳后行银染法染色，具体方法为将SDS-PAGE胶Milli-Q水漂洗5min，在含40%乙 醇和10%乙酸的固定液中固定Ihr，5%乙醇和5%乙酸固定过夜，水洗20min共2次，5%戊 二醛浸泡Ihr，水洗30min共4次，银染液温育30min后水洗!Bmin共3次。显影液(50mg/L 柠檬酸，0.5ml 36%甲醛/L)显影至背景出现，5%乙酸停显15min。UMax2110XL光密度扫 描仪扫描获得图谱，判断各样品2D可行性。3. DIGE 试验3. 1样品染料标记把各样品浓度都稀释到5ug/ul，将所有样品等量混合，然后50ug/10ul分装得内 标样品。取样品和内标各50ug，调节pH值到8. 0-9. 0之间，然后分别按照表1标记样品，分 别加入DIGE染料Cy2，Cy3，Cy5各lul，标记30分钟，置于冰上避光进行。标记结束后再加 Iul IOmM lysine终止反应10分钟。3. 2双相电泳将上述标记好的样品按表格分布分别在五块胶上进行上样，第一相等电聚焦 在Amersham的Ktan IPGphor等电聚焦系统仪器上进行，上样量为lOOug，采用13cm长 PH3-10 非线性胶条，等电聚焦电泳条件为30V 12hrs，500V lhr, 1000V lhr, 8000V 8hrs, 500V 4hrs。等电聚焦结束后，胶条取出在50mM Tris_HCl，6M尿素，30 %甘油，2 % SDS， 1% DTT和痕量溴酚蓝的平衡液中平衡15min，后于2. 5%碘代乙酰胺替换1 % DTT的相同 平衡液中平衡15min。然后将胶条移至第二相SDS线性胶上端，0. 5%琼脂糖封顶，第二相 SDS-PAGE采用Imm厚12. 5 %的凝胶，施加电流15mA/胶电泳30min，后改用电流30mA/胶， 电泳直至溴酚蓝到达距离胶下沿0. 5cm处截止。整个过程中始终注意要避光。3. 3 扫描使用Typhoon扫描仪，分别用三种不同的波长488nm(Cy2)，532nm(Cy3)， 633nm(Cy5)扫描，获得图谱。3. 4软件分析差异蛋白质点采用GE公司DeCyder 分析软件进行分析，采用One-Way ANOVA方法进行正常对 照组(A组)，PanIN组(B组)，胰腺癌组(C组)3组样品之间的差异分析，以P < 0. 01为 具有统计学差异。4差异蛋白质点的质谱鉴定4.1制备型双相电泳
制备型双相电泳条件与双相电泳条件基本相同，取各组样品Img左右上样，电泳 结束后考马斯亮蓝染色法染色，用刀片沿待鉴定的差异蛋白质点边缘切下蛋白质点。4. 2胶内酶解切下的含待鉴定差异蛋白质点的胶块加入30%乙酸/IOOmM NH4HCO3脱色，然后切 碎干燥，凝胶碎片浸泡于含Trypsin的40mM的NH4HCO3溶液做胶内酶解20个小时，0. 1% TFA/60 % ACN抽提酶解肽段2次，得到的肽溶液冷冻干燥后低温保存。
4. 3MALDI-T0F 或 MALDI-T0F-T0F 质谱分析干燥的肽段溶于0. 1 %的FA中，ZipTip脱盐，0. 1 % TFA/60% ACN溶液洗脱下的肽 段与基质溶液HCCA (5mg/ml)混合。使用 Bruker 公司 Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFT质谱仪进行肽段检测，检测方式为正离子，反射检测，飞行管长2. 7M，加速电压20KV， 反射电压23KV。最终得到每个样品的多肽质量指纹图谱(P印tide mass fingerprint, PMF)。4. 4数据库搜索由MALDI-TOF MS得到的每个差异蛋白质点的PMF图利用Mascot软件在美国国 家生物技术信息中心(National center for biotechnology information, NCBI)数据库 (2007 年 11 月 30 日版本，5678482sequences ；1961803296 residues)中搜库，种类选择为 大鼠(Rattus，67989 sequences)，蛋白酶选为胰蛋白酶，最大允许丢失的酶切位点为1个， 蛋白质的固定修饰为半胱氨酸的羧甲基化(Carbamidomethyl(C)),选择性修饰为甲硫氨酸 的氧化(Oxidation (M))，使用单同位素峰(Monoisotopic)，肽段的质量误差为士 lOOppm。表IDIGE上样表格Cy2Cy3Cy5Gel 1内标AlB3Gel 2内标B3C2Gel 3内标ClA2Gel 4内标B2C3Gel 5内标A3Bl5.结果5. 1样品双相电泳的可行性通过对三组正常对照组(A组)，PanIN组(B组，PanIN-2级)，胰腺癌组(C组)， 每组3个样品(1、2、；3)进行双相电泳预试验，所获得的图谱显示样品蛋白点迁移基本稳定 正常，可以进行下一步DIGE正式实验。5. 2DIGE蛋白质组图谱通过分别采用488nm(Cy2)，532nm(Cy3)，633nm(Cy5)三种不同的波长扫描各电 泳凝胶，所获得的图谱显示Gell凝胶蛋白质点数量为1445个，Gel2凝胶蛋白质点数量为 1469个，Gel3凝胶蛋白质点数量为1380个，Gel4凝胶蛋白质点数量为1512个，Gel5凝胶蛋白质点数量为1637 1
5. 3三组样品间蛋白质组差异表达变化采用GE DeCyder 分析软件，采用One-Way ANOVA方法对正常对照组(A组)， PanIN组(B组)，胰腺癌组(C组)3组样品之间的蛋白质组进行定量差异表达的统计学分 析，我们发现共有巧5个蛋白质点在三组样品之间的表达具有显著差异(P <0.01)。其中 与正常对照组比较，PanIN组和PC组表达强度显著上调的蛋白质点有89个，显著下调的蛋 白质点有56个；其中对照组、PanIN组和PC组表达强度呈逐级递增趋势的蛋白质点31个， 表达强度呈逐级递减趋势的蛋白质点有17个；此外PanIN组和PC组表达强度变化无规律 或因某组中蛋白质点检测缺失造成无法判断的蛋白质点有10个。如图3所示，以标号1402 的蛋白质点为例说明其在3组样品中的差异表达情况，1402蛋白在正常胰腺组织(A组)中 表达水平最高，而在PanIN组(B组)和PC组(C组)，表达水平则逐级显著下降。5. 4部分差异表达蛋白质点的鉴定从差异表达的155个蛋白质点中选择21个蛋白质点进行MALDI-T0F或 MALDI-TOF-TOF质谱分析，待鉴定的蛋白质点编号依次为90，230，780,1205,1402，329， 1132，1066，1272,226,1405,755,1259,298,1585，1030，1057,993,1040，1470,658。选择进 行鉴定的差异蛋白质点主要标准为(1)在正常对照组(A组)，PanIN组(B组)，胰腺癌 组(C组)三组间表达差异较显著；( 表达水平具有随病理学分级而逐级发生改变的趋 势；(3)组内不同样品间变异系数较小。21种待鉴定差异蛋白质点中，蛋白质点1259使用 MALDI-T0F-T0F质谱分析，其他蛋白质点为MALDI-T0F质谱分析。质谱分析结果利用Mascot 软件在NCBI数据库中进行搜库，以蛋白质点1205为例，图4是1205蛋白质点酶解肽段的 PMF图谱，用Mascot软件在NCBI数据库中搜库，蛋白质匹配的可能性判定依据Mowse积分， 以积分超过61分为具有统计学显著性(P < 0. 05)，结果显示，1205蛋白质点与肿瘤蛋白翻 译调节因子 l(tumor protein-translationally-controlled Ι,ΤΡΤ 1)相符合的 Mowse 积 分为98分，因而鉴定蛋白质点1205为TPTl蛋白。差异蛋白质点1205在Mascot数据库检索结果如下
权利要求
1.一组早期胰腺癌模型差异表达的相关蛋白质，其特征在于，所述相关蛋白质为 以下一种或几种烯醇化酶1 ；TPTl ；胰腺弹性蛋白酶;3B ；磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶2 ； 羧基酯酶；不均一核糖核蛋白A2/B1 ；染色质域解旋酶DNA结合蛋白3 ；细胞转移抑制 蛋 白；necdin ；Hbp23 ；unnamed proteinproduct ；retinoid χ receptor interacting protein ；guanine nucleotide binding protein, beta polypeptide 2一like 1 ；glycine C-acetyltransferase ο
2.权利要求1所述的相关蛋白质作为胰腺癌早期诊断标记物的应用。
全文摘要
本发明通过建立7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的大鼠胰腺上皮内瘤变和胰腺癌模型，应用DIGE蛋白质分析技术，分别动态检测正常胰腺、胰腺上皮内瘤变和早期胰腺癌大鼠胰腺组织中蛋白质的差异表达，利用生物信息学软件从中筛选出随胰腺癌变程度表达同步发生显著变化的蛋白质，并利用质谱技术对其进行鉴定，明确在早期胰腺癌发生中差异表达的具体蛋白质。本发明公开一组在早期胰腺癌模型胰腺组织中差异表达的灵敏性高，特异性强的相关蛋白质，并作为胰腺癌早期诊断的蛋白标记物的应用，为临床早期诊断胰腺癌提供有效的方法。差异蛋白质点的PMF图利用Mascot软件在美国国家生物技术信息中心数据库中搜库。
文档编号C12Q1/527GK102053159SQ20091019773
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者刘海林, 王磊 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院