一种筛选抗生素结合蛋白的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体公开了一种筛选抗生素结合蛋白的方法。本发明利用抗生素应激生物体，获得生物体的应激差异蛋白质组，再通过检测差异蛋白点中的抗生素含量，筛选并鉴定抗生素结合蛋白。本发明方法适用范围广，能够快速、准确地筛选出新的抗生素结合蛋白，对抗生素的检测和耐药菌的防治具有重要的意义。
【专利说明】一种筛选抗生素结合蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地，涉及一种鉴定抗生素结合蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]抗生素结合蛋白可以用于抗生素的检测，同时也为抗生素作用机制与细菌耐药机制的研究提供分子靶位。目前抗生素结合蛋白的筛选主要采用经典的同位素结合标记法。这一方法是利用稳定同位素标记的抗生素与所抑制的代谢活动相关的细胞器，如核糖体，细胞组分，如细胞壁提取物等孵育，再利用放射自显影，SDS-PAGE等方法分离出抗生素结合蛋白。这种研究思路的优点在于“有的放矢”，首先研究抗生素所影响的代谢活动，再分离出该代谢活动中与抗生素结合的蛋白质，可以减少筛选工作量，节省时间与成本；不足之处在于，抗生素进入到细胞内部之后，还可能会与其他蛋白质结合影响细菌的生理活动，如果该蛋白质不在目的细胞器或者细胞组分之内，则难以被发现。从而难以发现新的抗生素结合蛋白，也直接影响对抗生素作用机制和细菌耐药机制的深入研究。
【发明内容】
[0003]本发明针对现有技术的不足，提供一种筛选抗生素结合蛋白的方法。所述方法适用范围广，能够快速、准确地筛选出新的抗生素结合蛋白，对抗生素的检测和耐药菌的防治具有重要的意义。
[0004]本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0005]一种筛选抗生素结合蛋白的方法，包括如下步骤:
51.用抗生素应激生物体，提取生物体全部细胞蛋白进行电泳分离分析，得到应激蛋白质组，比对得到差异蛋白点；
52.回收差异蛋白点，分别进行抗生素检测，根据差异蛋白点中抗生素的含量，筛选并鉴定抗生素结合蛋白；
其中，S2所述抗生素检测采用间接竞争法，使差异蛋白点中的抗生素和偶联抗原竞争抗生素抗体，以生理盐水处理时对应蛋白点作为阴性对照，并进行吸光值检测；筛选所述吸光值< 100%，且显著性差异P < 0.01的蛋白点为抗生素结合蛋白；
或者，S2所述抗生素检测采用直接测定法，筛选抗生素含量> 5倍阴性对照，且显著性差异P < 0.01的蛋白点为抗生素结合蛋白；所述阴性对照为生理盐水处理时对应蛋白点；SI所述抗生素的浓度> 4倍的最小抑制浓度，且抗生素的浓度<杀死所述所有生物体的浓度。所述最小抑制浓度指在特定环境下孵育24小时，可抑制某种生物体出现明显增长的最低药物浓度；当生物体为细菌时，最小抑制浓度即为最小抑菌浓度(MIC)，用于定量测定体外抗菌活性。
[0006]本发明发现高剂量的抗生素应激会直接影响生物体抗生素结合蛋白的丰度，然后基于电泳分离的蛋白质组学技术，将采用生理盐水处理生物体时蛋白电泳图谱与应激蛋白质组进行比对，发现了相关差异蛋白，继而结合特异性的抗生素检测方法对抗生素结合蛋白进行筛选和鉴定。本发明所述方法适用于各种抗生素，且所述生物体包括微生物、植物和动物细胞，适用范围广，可以快速、准确地筛选出新的抗生素结合蛋白。
[0007]优选地，SI所述电泳分离分析所用的细胞蛋白为50 yg~2mg。
[0008]优选地，SI所述抗生素的浓度为8~100倍的最小抑制浓度。
[0009]优选地，S2所述抗生素检测采用间接竞争法，筛选所述吸光值0~90%，且显著性差异P < 0.01的蛋白点为抗生素结合蛋白。
[0010]优选地，S2所述抗生素检测采用直接测定法，筛选抗生素含量为5~100倍阴性对照的蛋白点为抗生素结合蛋白；所述阴性对照为生理盐水处理时对应蛋白点。
[0011]本发明所述方法可以适合于所有类型的抗生素，因为利用不同种类的抗生素对生物体(包括微生物、植物和动物细胞)进行应激处理时,均可以获得相应的处理蛋白质,进行蛋白质组学分析，发现和鉴定抗生素应激差异蛋白。再采用抗生素检测方法，检测其中是否含有处理所用的抗生素，由此鉴定相应的抗生素结合蛋白。因此，该原理可以适应所有类型的抗生素。
[0012]优选地，SI所述抗生素为新氟喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、β -内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、酰胺醇类抗生素、四环素类抗生素、林可酰胺类抗生素、多肽类抗生素、抗真菌抗生素抗生素、多磷类抗生素。
[0013]更优选地，SI所述抗生素为青霉素、新氟喹诺酮类抗生素。
[0014]本发明所述方法中的生物体是抗生素的作用对象，由于所有类型的生物体都可对抗生素的作用产生应激反应，因此包括微生物、植物和动物细胞在内的所有生物体都适用于本发明所述的方法。
[0015]优选地，SI所述生物体为细菌，所述最小抑制浓度指最小抑菌浓度。细菌易于培养及提取蛋白，以细菌为对象便于实验研究。
[0016]优选地，SI所述细菌为大肠杆菌和迟缓爱德华菌。
[0017]优选地，SI所述电泳分离分析为双向电泳分析。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:本发明适用范围广，能够快速、准确地筛选出新的抗生素结合蛋白，对抗生素的检测和耐药菌的防治具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为实施例1氨苄青霉素应激迟缓爱德华氏菌的IEF/SDS-PAGE双向电泳分离的结果；Α为对照组，B为抗生素应激组。
[0020]图2为实施例1氨苄青霉素应激迟缓爱德华氏菌的IEF/SDS-PAGE图谱差异蛋白点。
[0021]图3为实施例1氨苄青霉素含量与百分吸光度标准曲线。
[0022]图4为实施例1蛋白点ΕΤΑΕ_0175、ΕΤΑΕ_3367与对照组的百分吸光度。
[0023]图5为实施例2巴洛沙星应激大肠埃希菌Κ12 BW25113的IEF/SDS-PAGE双向电泳分离的结果；Α为对照组，B为抗生素应激组。
[0024]图6为实施例2巴洛沙星应激大肠埃希菌Κ12 BW25113的IEF/SDS-PAGE图谱差异蛋白点。
[0025]图7为实施例2巴洛沙星含量与荧光强度标准曲线。
[0026]图8为实施例2蛋白点AceF的巴洛沙星浓度。
【具体实施方式】
[0027]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0028]本实施方式分别以氨苄青霉素应激迟缓爱德华氏菌、巴洛沙星应激大肠埃希菌为例，但所述氨苄青霉素、巴洛沙星并不作为对本发明所用抗生素的限定，所述迟缓爱德华氏菌、大肠埃希菌也不作为对本发明所用生物体的限定。本发明方法适用于各类抗生素应激各类生物体。
[0029]实施例1迟缓爱德华氏菌氨苄青霉素结合蛋白的筛选及鉴定
S1.1EF/SDS-PAGE分析氨苄青霉素应激迟缓爱德华氏菌差异蛋白质组:
用浓度为20倍最小抑菌浓度的氨苄青霉素应激迟缓爱德华氏菌EIB202，提取迟缓爱德华氏菌全部细胞蛋白，并取500 μ g进行IEF/SDS-PAGE双向电泳分析，获得氨苄青霉素应激蛋白质组，实验结果见图1。将采用生理盐水处理迟缓爱德华氏菌时的蛋白电泳图谱与应激蛋白质组进行比对，对图谱进行比较分析后，共发现差异蛋白点总数为59个，对比结果见图2，这些差异蛋白与氨苄青霉素应激迟缓爱德华氏菌EIB202相关。
[0030]S2.迟缓爱德华氏菌氨苄青霉素结合蛋白的筛选:回收上述59个差异蛋白点，分别进行氨苄青霉素检测，根据差异蛋白点中氨苄青霉素含量，筛选出候选的迟缓爱德华氏菌氨苄青霉素结合蛋白。
[0031]氨苄青霉素含量标准曲线绘制:使用氨苄青霉素快速检测试剂盒对差异蛋白点的氨苄青霉素含量进行检测。试剂盒原理是利用间接竞争ELISA的方法，在板孔中包被有偶联抗原，当样品液差异蛋白点中的氨苄青霉素和氨苄青霉素抗体加入到板孔后，样品中的氨苄青霉素将会和偶联抗原竞争抗体，样品的吸光值与其所含有氨苄青霉素的含量成负相关。对0.1,0.3,0.9,2.7,8.1 bbp的氨苄青霉素标准品进行吸光度检测，根据吸光度绘制标准曲线，结果见图3。随着氨苄青霉素浓度的上升，样品的百分吸光度也随之下降。该标准曲线可用于氨苄青霉素含量的定性分析。
[0032]样品的制备:加入酶解液对差异蛋白点进行酶解后，加入试剂盒中样品稀释液，超声2分钟分钟使得抗生素从胶粒中释放。对样品液进行离心后，吸取上清液用于抗生素含量检测。
[0033]差异蛋白点的氨苄青霉素含量测定:利用上述间接竞争ELISA的方法对59个差异点进行测定，发现I号差异点百分吸光值为67.1%、19号差异点为78.7%，结果见图4，均明显低于对照值(100%)，由此确定为候选的氨苄青霉素结合蛋白。根据质谱鉴定结果，可以确定I号差异点为蛋白质ETAE_0175，ETAE_0175 (RpoB)是RNA聚合酶的β亚基，含有核苷三磷酸的结合位点，与初始RNA链产生相关；19号蛋白点为ΕΤΑΕ_3367，ΕΤΑΕ_3367是谷胱甘肽二硫键还原酶(谷胱甘肽还原酶)，其作用是将体内重要的还原性物质——谷胱甘肽，从氧化态还原为还原态。
[0034]实施例2大肠埃希菌巴洛沙星结合蛋白的筛选及鉴定
S1.1EF/SDS-PAGE分析巴洛沙星应激大肠埃希菌差异蛋白质组: 用浓度为50倍最小抑菌浓度巴洛沙星应激大肠埃希菌K12 BW25113，提取大肠埃希菌K12 BW25113全部细胞蛋白，并取I mg进行IEF/SDS-PAGE双向电泳分析，获得其应激蛋白质组，实验结果见图5。将采用生理盐水处理大肠埃希菌时的蛋白电泳图谱与应激蛋白质组进行比对，对图谱进行比较分析后，共发现差异蛋白点总数为24个，对比结果见图6，这些差异蛋白的产生都与巴洛沙星应激大肠埃希菌K12 BW25113相关。
[0035]S2.大肠埃希菌巴洛沙星结合蛋白质的筛选:回收上述24个差异蛋白点，这些巴洛沙星应激菌种后产生的差异蛋白质组中，有些蛋白质可与巴洛沙星直接结合，这些结合在蛋白质上的巴洛沙星可以采用巴洛沙星检测试剂盒检测其含量，并进一步通过差异蛋白点的巴洛沙星含量比较，筛选出巴洛沙星结合蛋白。
[0036]巴洛沙星含量标准曲线绘制:巴洛沙星属于喹诺酮类抗生素，由于其具有的特殊化学结构，可在特定条件下激发出荧光，因而可使用荧光分光光度计进行定量分析。先建立巴洛沙星浓度与荧光强度之间的标准曲线，巴洛沙星溶液采用1、2、4、8、16和32ng/3mL，根据测定的荧光强度绘制出标准曲线，结果见图7。
[0037]样品的制备:加入酶解液对差异蛋白点进行酶解后，加入样品稀释液(0.2mol/LKH2PO4)，超声2分钟使得抗生素从胶粒中释放。对样品液进行离心后，吸取上清液用于抗生素含量检测。
[0038]差异蛋白点的巴洛沙星含量测定:利用上述相同方法测定所有差异蛋白点的荧光强度，通过标准曲线得出的公式，计数出每一个差异蛋白点的巴洛沙星含量。通过减去对照组中蛋白点荧光值以消去蛋白质的影响，结果发现，8号差异点的巴洛沙星含量为12.130ng/3mL，见图8。由此确定8号蛋白点为巴洛沙星结合蛋白。经质谱鉴定确定8号差异蛋白点为AceF蛋白，是丙酮酸脱氢酶多酶复合物的E2亚基，即二氢硫辛酰转乙酰基酶，其作用是催化羟乙基-TPP与硫辛酰胺产生乙酰二氢硫辛酰胺，再通过分解产生乙酰辅酶A分子。
【权利要求】
1.一种筛选抗生素结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.用抗生素应激生物体，提取生物体全部细胞蛋白进行电泳分离分析，得到应激蛋白质组，比对得到差异蛋白点； 52.回收差异蛋白点，分别进行抗生素检测，根据差异蛋白点中抗生素的含量，筛选并鉴定抗生素结合蛋白； 其中，32所述抗生素检测采用间接竞争法，使差异蛋白点中的抗生素和偶联抗原竞争抗生素抗体，以生理盐水处理时对应蛋白点作为阴性对照，并进行吸光值检测；筛选所述吸光值? 100%，且显著性差异？ ? 0.01的蛋白点为抗生素结合蛋白； 或者，82所述抗生素检测采用直接测定法，筛选抗生素含量? 5倍阴性对照，且显著性差异？ ? 0.01的蛋白点为抗生素结合蛋白；所述阴性对照为生理盐水处理时对应蛋白点；51所述抗生素的浓度? 4倍的最小抑制浓度，且抗生素的浓度?杀死所述所有生物体的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，51所述电泳分离分析所用的细胞蛋白为50 口尽?2爪呂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，51所述抗生素的浓度为8~100倍的最小抑制浓度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，32所述抗生素检测采用间接竞争法，筛选所述吸光值0~90%，且显著性差异？ ? 0.01的蛋白点为抗生素结合蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，32所述抗生素检测采用直接测定法，筛选抗生素含量为5~100倍阴性对照的蛋白点为抗生素结合蛋白；所述阴性对照为生理盐水处理时对应蛋白点。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，51所述生物体为细菌。
【文档编号】G01N33/68GK104502610SQ201410821597
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】彭宣宪, 李惠, 朱伟聪 申请人:中山大学