专利名称：蛋白筛选方法
蛋白筛选方法相关申请本申请要求2008年7月25日提交的美国临时申请第61/083813号、2008年8 月19日提交的美国临时申请第61/090111号和2009年4月16日提交的美国临时申请第 61/170029号的优先权，所述临时申请的内容通过引用并入本文。背景充分了解的是，在展示和选择技术的应用中，较高的多样性的获得容许更有效地选择具有最高亲和力、特异性、稳定性和/或其他期望特征的分子。过去已开发的方法包括噬菌体展示、核糖体展示、CIS展示和mRNA展示。最近，在使用体内筛选鉴定分子方面存在增加的兴趣(J Control Release. 2003 Aug 28 ；91 (1-2) 183-6)。使用噬菌体展示已使这种方法成为可能，但是这种方法具有噬菌体展示技术所提供的有限的多样性。由于RNA物质的不稳定性，核糖体展示或mRNA展示将无法用于这种应用。因此，DNA-蛋白融合体的开发由于该物质的增加的稳定性而将是高度期望的。已经描述了三种类型的DNA-蛋白融合体。CIS展示是一种使用偶联的体外转录/翻译来在DNA被转录和翻译时产生与DNA共价结合的dsDNA结合蛋白的方法(PNAS， 101 (9) =2806-2810) 0然而，该技术的主要局限之一是在转录/翻译过程中合成的蛋白可以与附近任何邻近的DNA结合，从而导致错误标记的融合体。第二种方法是Kurz和Lohse 的方法(Chembiochem. 2001年9月3日；2(9) :666-72)。此方法涉及使用多官能物质形成与mRNA的共价加成物，该多官能物质可以与翻译的蛋白共价键合，而在共价加成物处产生 RNA上的核糖体停顿，并充当反转录的引物。这种方法的局限是使用补骨脂素与RNA的共价交联步骤是低效的。第三种方法是^nezawa等人的方法(Nucleic Acids Res. 2003年10 月1日；31 (19) :ell8.)。在此方法中，将编码链霉抗生物素和多种肽的区域的DNA生物素化，置于具有翻译机制的合成微球中并进行翻译使得链霉抗生物素(四聚体)结合在生物素化的DNA上。这种方法的局限是所得物质是四聚体，这对于亲和力选择可能是麻烦的，因为在一个粒子上会有多种结合物质(再结合作用)。本文描述一种用于产生需要的核酸蛋白融合体的简单有效的方法，该方法可以采用核酸与蛋白之间的非共价连接并且将容许DNA-蛋白融合体形成。发明概述本发明提供了选择和进化蛋白和核酸的期望特性的组合物和方法。在多个实施方案中，本发明包括与核酸或修饰的核酸连接的小分子。其他实施方案包括制备多肽的方法，所述多肽包括具有修饰的氨基酸的肽；实现选择群体中具有期望特性的个别成员的测定；和用于产生具有改良特性的多肽的新变异的方法。在一个方面，本发明提供异双功能复合体，所述异双功能复合体包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽编码序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子编码；和(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列，
其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，并且其中所述第二核酸分子与所述多肽非共价结合。在一些实施方案中，这种异双功能复合体还包含(a)高亲和力配体，所述高亲和力配体与第二核酸分子共价结合；和(b)配体受体，所述配体受体与肽受体结合，其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与多肽共价结合。在一些实施方案中，这种异双功能复合体还包含第二高亲和力配体，其中所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合，并且其中所述第二高亲和力配体与配体受体结合。在一些实施方案中，这种异双功能复合体中的肽受体通过连接物与第二高亲和力配体结合。在一个优选的实施方案中，连接物包括聚乙二醇。在另一优选的实施方案中，连接物还包括多聚唾液酸连接物。在一些实施方案中，这种异双功能复合体中的配体受体与肽受体共价结合。在一些实施方案中，这种异双功能复合体还包含(a)配体受体，所述配体受体与第二核酸分子共价结合；和(b)高亲和力配体，所述高亲和力配体与肽受体结合，其中所述配体受体与所述高亲和力配体结合并且所述肽受体与多肽的C端共价
纟口口。在其他实施方案中，这种异双功能复合体还包含第三核酸分子，所述第三核酸分子包含与第二核酸分子的部分互补的核酸序列，其中所述第三核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，其中所述第三核酸分子与肽受体共价结合，并且其中所述肽受体与多肽共价结合。在一些实施方案中，上述复合体中的第二核酸分子是分支的核酸分子。在一些实施方案中，上述复合体中的第二核酸分子能够充当第一核酸分子反转录的引物。在另一方面，本发明提供X-展示复合体(例如，核酸多肽复合体)，该X-展示复合体包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽编码序列，该核酸分子与第一高亲和力配体共价结合；(b)多肽，所述多肽由所述核酸分子编码；(c)配体受体，所述配体受体与肽受体结合，其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与所述多肽的C端共价结合。在一些实施方案中，这种X-展示复合体中的配体受体与肽受体共价结合。在一些实施方案中，这种X-展示复合体还包含第二高亲和力配体，其中所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合，并且其中所述第二高亲和力配体与配体受体结合。在另一方面，本发明提供X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽编码序列，该核酸分子与第一高亲和力配体共价结合；(b)第一配体受体，所述第一配体受体与第二高亲和力配体共价结合；和(c)多肽，所述多肽由第一核酸分子编码，其中所述多肽包含第二配体受体，其中所述第一高亲和力配体与所述第一配体受体结合，并且所述第二高亲和力配体与所述第二配体受体结合。在一些实施方案中，与上述复合体结合的第一高亲和力配体或第二高亲和力配体是生物素。在一些实施方案中，与上述复合体结合的第一高亲和力配体或第二高亲和力配体选自包括下列的组^(506、氨甲喋呤、？ 1-2458、生物素、蛭素、2 ￥ (0汗、荧光素-生物素、 ABD (白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白Α。在一些实施方案中，上述复合体中的第一配体受体或第二配体受体选自包括下列的组FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI (RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag和分选酶。在一些实施方案中，上述复合体中的第一配体受体或第二配体受体是链霉抗生物
ο在一些实施方案中，上述多肽选自包括下列的组抗体、VH结构域、VL结构域、Fab 片段、单链抗体、纳米抗体(nanobody)、unibody、adnectin、亲和体(affibody)、DARPin、 anticalin、avimer、10Fn3 结构域禾口 versabody。在另一方面，本发明提供X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽编码序列，该核酸分子与配体共价连接；和(b)多肽，所述多肽由第一核酸分子编码，其中所述多肽包含配体受体，其中所述配体与所述配体受体结合。在一些实施方案中，与X-展示复合体结合的配体是Π(506并且核酸-多肽复合体中的配体受体是FKBP的Π(506-结合结构域。在一些实施方案中，与上述复合体结合的第一核酸分子选自由下列组成的组 ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNA 杂交 dsDNA 和 dsDNA/RNA 杂交体。在一些实施方案中，与上述复合体结合的第一核酸分子的多肽编码序列不含有框内终止密码子。在一些实施方案中，上述多肽是结合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述结合蛋白是抗体的VH结构域或VL结构域。在一些实施方案中，上述核酸-多肽复合体不含有核糖体。在另一方面，本发明还提供包含多种上述X-展示复合体的文库，其中所述复合体的至少一部分含有不同的多肽编码序列。在另一方面，本发明还提供制备核酸-多肽复合体的文库的方法，所述方法包括下列步骤-提供mRNA序列的文库，所述mRNA序列包含与第一核酸连接物互补的序列元件；-提供第一核酸连接物，所述第一核酸连接物与第一高亲和力配体可操作地连接以便使所述第一核酸连接物通过互补的核酸碱基配对与mRNA结合；-提供第二高亲和力配体，所述第二高亲和力配体与肽受体可操作地连接；-提供具有至少两个结合位点的配体受体或提供至少以便使所述配体受体与所述第一高亲和力配体和所述第二高亲和力配体结合；-容许mRNA翻译进行以便使肽受体与翻译的蛋白结合，从而形成连接mRNA与蛋白的核酸-多肽复合体。在一些实施方案中，所述方法还包括-容许使用X-展示复合体中的第一核酸连接物作为引物进行mRNA反转录以便形成DNA/RNA杂交体。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括-降解mRNA并合成互补的DNA链，从而形成核酸-多肽复合体中的DNA/DNA杂交体。在一些实施方案中，文库中的mRNA还包含TMV增强子。在一些实施方案中，文库中的mRNA还包含C μ序列。在一些实施方案中，文库中的mRNA还包含FLAG标签。在一些实施方案中，文库中的mRNA还包含SA展示序列。在一些实施方案中，文库中的mRNA还包含A20尾。在另一方面，本发明还提供由本发明中所描述的方法制备的核酸-多肽复合体的文库。在另一方面，本发明还提供选择分离的核酸分子的方法，所述分离的核酸分子编码能够与感兴趣的抗原结合的多肽，所述方法包括下列步骤(a)提供本发明中所述的X-展示复合体的文库；(b)使所述文库接触感兴趣的抗原；(c)从所述文库中选择与感兴趣的抗原结合的至少一种X-展示复合体；和(d)分离所选择的X-展示复合体的多肽编码序列。在另一方面，本发明还提供制备多肽的方法，所述多肽能够结合感兴趣的抗原，所述方法包括将通过本发明中所述的方法鉴定的多肽编码序列引入表达环境中以便产生所编码的多肽。在另一方面，本发明还提供编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽能够与感兴趣的抗原结合，所述分离的核酸分子通过本发明所述的方法选择。在另一方面，本发明还提供X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽编码序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子编码；(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列；(d)第一高亲和力配体，所述第一高亲和力配体与所述第二核酸分子共价结合；(e)第一配体受体；禾口(f)第二高亲和力配体，所述第二高亲和力配体经由一个或多个连接分子与肽受体共价结合，其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，其中所述第一高亲和力配体与所述配体受体在第一结合位点非共价结合，其中所述第二配体与所述配体受体在第二结合位点非共价结合，并且其中所述一种或多种连接分子是聚乙二醇分子。在一些实施方案中，这种复合体中的第一高亲和力配体是生物素并且配体受体选自包括下列的组链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。在一些实施方案中，这种复合体中的第二高亲和力配体是生物素并且配体受体选自包括下列的组链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。在一些实施方案中，这种复合体中的第一高亲和力配体或第二高亲和力配体选自包括下列的组Π(506、氨甲喋呤、ΡΡΙ-2458、生物素、蛭素、ZFVp (0) F、荧光素-生物素、 ABD (白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白Α。在一些实施方案中，这种复合体还包含第二配体受体。在一些实施方案中，上述复合体中的第二配体受体选自包括下列的组FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI (RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag 和分选酶。在一些实施方案中，这种复合体中的肽受体是嘌呤霉素。在一些实施方案中，这种复合体中的第一核酸分子或第二核酸分子还包括补骨脂
ο在一些实施方案中，多肽选自包括下列的组抗体、VH结构域、VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体、unibody、adnectin、亲和体、DARPin, anticalin、avimer,10Fn3 结构域禾口 versabody。在另一方面，本发明提供异双功能复合体，所述异双功能复合体包含(a)第一高亲和力配体，所述第一高亲和力配体与核酸分子共价结合；(b)第二高亲和力配体，所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合；和(c)配体受体，所述配体受体包含两个或更多个配体结合位点；其中所述第一高亲和力配体和第二高亲和力配体在不同的配体结合位点与配体受体结合。在一些实施方案中，这种复合体中的第一高亲和力配体和第二高亲和力配体是相同的。在一些实施方案中，这种复合体中的第一高亲和力配体和第二高亲和力配体是生物素。在一些实施方案中，这种复合体中的核酸分子包含补骨脂素部分。在一些实施方案中，这种复合体中的肽受体是嘌呤霉素。在一些实施方案中，这种复合体中的配体受体是多聚蛋白。在一些实施方案中，这种复合体中的配体受体是链霉抗生物素。附图简述
图1图解了本文所述方法的一个实施方案。图2图解了使用先进引物的这种实施方案，所述先进引物是具有两个3’末端的倒转极性引物(inverted polarity primer)，该引物可以方便地引发cDNA并且在相对的末端携带嘌呤霉素或衍生物或小分子。图3图解使用先进引物的这种实施方案，所述先进引物是茎环变体并且可以回折且方便地引发cDNA。图4图解用于改善或进化抗体重链可变区的结构/功能的方法的一个实施方案，其中多肽与Πα2ΒΡ蛋白融合，Π(12ΒΡ蛋白可以与核酸连接的Π(506小分子非共价结合，从而连接改善的(进化的)表型(多肽)与其编码基因型(核酸)。图5图解体外展示方法的一个实施方案，该实施方案使用分支的寡核苷酸连接物和互补的寡核苷酸，该互补的寡核苷酸包含共价连接的肽受体。图6图解体外展示方法的一个实施方案，该体外展示方法使用与肽受体共价连接的分支的寡核苷酸连接物。图7图解体外展示方法的一个实施方案，该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体。图8图解体外展示方法的一个实施方案，该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体，其中所述配体受体与肽受体共价连接。图9图解体外展示方法的一个实施方案，该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体，其中所述配体受体与肽受体非共价连接。图10图解体外展示方法的一个实施方案，该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体，其中第一配体受体分子与第二(非关联的)高亲和力配体共价连接，其中所述第一配体受体分子可以与共价连接至核酸的关联的第一高亲和力配体结合，并且其中所述第二高亲和力配体可以与关联的第二配体受体结合，所述关联的第二配体受体与所述核酸所编码的多肽融合。图11图解用于使用高亲和力配体和配体受体的体外展示方法的一个实施方案中的单独组分的非限制性实例。图12图解用于使用高亲和力配体和配体受体的体外展示方法的一个实施方案的核酸/蛋白复合体的非限制性装配顺序。图13图解优选的X-展示复合体的设计。图14图解制备VH文库、装配展示复合体、选择和纯化所述展示复合体的示例性方案。图15图解VH文库的样品单克隆。图例显示了转录和翻译起始序列、VH序列、Cu 序列、FLAG标签序列、与连接物(例如，NA连接物)互补的DNA区段。图16图解展示方法的优选实施方案的步骤。图16A首先描绘包含mRNA分子(含有适当的连接物、标签、互补区和多聚A尾)的X-展示复合体，所述mRNA分子经由互补的链配对和补骨脂素连接而与连接物/RT引物(NA连接物)连接。NA连接物还与生物素(B) 分子共价结合，生物素分子与链霉抗生物素分子缔合。链霉抗生物素与第二生物素分子缔合，该第二生物素分子本身与被连接至翻译的蛋白的嘌呤霉素共价结合。图16A描绘反转录(步骤1)和RNA降解(步骤2)。图16B描绘产生DNA/RNA杂交体的第二链合成(步骤 4)。16B最后描绘的是最终的dsDNAX-展示复合体(即，X-展示复合体)。图17描绘潜在的文库成员以及在一些实施方案中引物如何用于4M测序。图18描绘VH文库成员的示例性区段。图19描绘展示文库成员的实例性区段并且还展示远离引物的末端序列(参见图 17)。图20描绘展示文库成员的示例性区段并且还提供远离引物的TMVUTR和C-mu区的示例性序列。
图21描绘用于扩增被选择用于测序的克隆的引物的可能排列。图22图解从文库中选择的本发明的一个实施方案的过程，说明该方法可能是迭代的以便使在第一轮中所选择的核酸/蛋白可用于产生用于后续轮的X-展示复合体形成和选择的文库。图23图解本发明的一个实施方案，其中采用几轮的选择而不再生文库或扩增选择产物。图M图解由mRNA设计VH和VL文库的一种方法。图25图解选择方法的一个示例性实施方案，其中将用于亲和力选择的靶分子固定在固体支撑物上。图沈图解选择方法的一个示例性实施方案，其中在细胞表面上表达用于亲和力选择的靶分子。在这种实施方案中，对不表达展示复合体的细胞选择所述复合体(例如，为了移除与细胞结合但是不与感兴趣的靶结合的复合体)并且然后对表达感兴趣的靶的细胞选择所述复合体(即，鉴定特异性结合物)。图27图解DNA X-展示复合体(即，DNA-蛋白融合体)，其中来源标签已被掺入到核酸中(例如，以鉴定编码DNA的来源)并且使用恒定来源编码来标签自不同轮选择的核酸(例如，在从一次测序运行的不同轮选择汇集核酸时是有用的)。图观图解DNA X-展示复合体(即，DNA-蛋白融合体)和N6引物的添加。图四描绘显示序列分析方案的一个实施方案的流程图。图30图解mRNA转录、纯化和交联过程的示例性结果。图31图解mRNA转录、纯化和链霉抗生物素加载过程的示例性结果。图32图解在RNA酶H处理和洗脱过程之后的示例性结果。图33图解在RNA酶H处理和洗脱过程之后的示例性结果。图34图解在RT-PCR和第二链合成过程之后的示例性结果。图35图解可用于文库设计以容许将多轮选择汇集为一次测序运行的汇集物标记 (pool tagging)。图36图解用于制备VH文库的示例性供体细胞。发明详述本发明提供了选择和进化蛋白和核酸的期望特性的组合物和方法。所述方法在本文中可以称为“X-展示”或者在采用链霉抗生物素的一些实施方案中称为“SA展示”。在多个实施方案中，本发明包括与核酸或修饰的核酸连接的小分子。其他实施方案包括制备多肽的方法，所述多肽包括具有修饰的氨基酸的肽；实现选择群体中具有期望特性的个别成员的测定；和用于产生具有改良特性的多肽的新变异的方法。“选择”意指基本上将群体中的一种分子与其他分子分开。如本文所用的“选择” 步骤在选择步骤之后提供与群体中不期望的分子相比至少2-倍，在一些实施方案中3-倍、 5-倍、10-倍、20-倍、优选30-倍、更优选100-倍并且最优选1000-倍富集的期望分子。可以重复任何次数的选择步骤并且可以在给定的方法中组合不同类型的选择步骤。“蛋白”意指通过一个或多个肽键连接的任何两种或多种天然存在的或修饰的氨基酸。“蛋白”和“肽”在本文中可互换使用。“RNA”意指两种或更多种共价键合的天然存在的或修饰的核糖核苷酸的序列。此术语中所包括的修饰的RNA的一个实例是硫代磷酸RNA。“DNA”意指两种或更多种共价键合的天然存在的或修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。“核酸”意指任何两种或更多种共价键合的核苷酸或核苷酸类似物或衍生物。如本文所用的这个术语包括但不限于DNA、RNA和PNA。术语“核酸”可以包括修饰的核酸并且因此核酸和修饰的核酸可以互换使用。如本文所用的术语“核苷酸类似物”或“核苷酸衍生物”或“修饰的核酸”是指修饰的或非天然存在的核苷酸，例如5-丙炔基嘧啶(即，5-丙炔基-dTTP和5-丙炔基-dTCP)、 7-脱氮嘌呤(即，7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)。核苷酸类似物包括碱基类似物并且包括修饰形式的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。“肽受体”意指能够通过核糖体肽基转移酶功能的催化活性被添加到生长的蛋白链的C端的任何分子。通常，这种分子含有(i)核苷酸或核苷酸样部分(例如，腺苷或腺苷类似物(在N-6氨基位置的二甲基化是可接受的))、(ii)氨基酸或氨基酸样部分(例如， 20种D-氨基酸或L-氨基酸的任一种或它们的任何氨基酸类似物(例如0-甲基酪氨酸或 Ellman等人，Meth. Enzymol. 202 :301，1991所述的任何类似物)、和(iii)这两者之间的连接(例如，在3’位置的酯、酰胺或酮连接，不太优选的是在2’位置)；优选地，这种连接不显著地打乱来自天然核糖核苷酸构象的环褶皱。肽受体还可以具有亲核体，该亲核体可以是但不限于氨基、羟基或巯基。此外，肽受体可以由核苷酸模拟物、氨基酸模拟物或组合的核苷酸-氨基酸结构的模拟物构成。如本文所用术语“X-展示复合体”、“核酸-多肽复合体”和“核酸-蛋白融合体” 是可互换的，并且意思是指由核酸和该核酸所编码的蛋白(或肽或其片段)的直接或间接相互作用形成的复合体。在一些情况下，X-展示复合体可以称为“展示复合体”或“展示融合体”，并且本领域技术人员将通过这种用途的内容理解它不应与本文可能引用的其他类型的展示系统混淆。在一些实施方案中，核酸是RNA，例如，mRNA。在其他优选的实施方案中，核酸是DNA或cDNA。因此，在目标是展示含有DNA的复合体的一些实施方案中，X-展示复合体可以称为“DNA-蛋白融合体”或“DNA-展示融合体”。重要的是注意术语“融合”的使用不暗示或表示核酸与肽或蛋白共价连接。在一些实施方案中，RNA或DNA可以是修饰的或改变的。在优选的实施方案中，核酸与蛋白之间的相互作用是非共价的(例如，相互作用可以通过生物素/链霉抗生物素相互作用、连接物分子和本文所述的类似物介导)。在优选的实施方案中，核酸是mRNA或修饰的mRNA。“改变的功能”意指分子功能方面的任何质的或量的改变。如本文所用的“结合配偶体”意指对期望的DNA-蛋白融合体的部分具有特异性的共价或非共价亲和力的任何分子。结合配偶体的实例包括但不限于下列的成员抗原/抗体对、蛋白/抑制剂对、受体/配体对(例如细胞表面受体/配体对，如激素受体/肽激素对)、酶/底物对(例如，激酶/底物对)、凝集素/碳水化合物对、寡聚或异源寡聚蛋白聚集体、DNA结合蛋白/DNA结合位点对、RNA/蛋白对和核酸双链体、异源双链体或连接的链以及能够与X-展示复合体的任一部分形成一种或多种共价或非共价键(例如，二硫键)的任何分子。“固体支撑物”意指但不限于亲和复合体可以直接或间接结合(例如，通过其他结合配偶中间物，如其他抗体或蛋白A)或亲和复合体可以包埋于其中(例如，通过受体或通道)的任何柱(或柱材料)、珠子、试管、微量滴定皿、固体粒子(例如，琼脂糖(agarose或 s印harose))、微芯片(例如，硅、硅-玻璃或金芯片)或膜(例如，脂质体或囊泡的膜)。介导X-廳始侧_连擁___连擁在本发明的一个方面，核酸(天然mRNA或修饰的mRNA)可以通过使用在核酸3’ 端杂交的核酸连接物或修饰的核酸连接物(“NA连接物”)与其编码的蛋白在翻译结尾时连接。在这种实施方案中，NA连接物在连接物中具有倒转的极性使得它有效地具有两个3’ 端，这两个3’末端的非杂交化末端将其连接至能够与多肽蛋白以高亲和力共价或非共价结合的嘌呤霉素或相关类似物或小分子。因此，在一些实施方案中，χ-展示复合体是通过蛋白和核酸与NA连接物的相互作用形成的。在一些实施方案中，NA连接物是补骨脂素连接物。在一些优选的实施方案中，连接物是XB-PBI。在一些实施方案中，可以使用XB-DDB。在一些优选的实施方案中，连接物 (例如，PBI连接物或DDB连接物)与高亲和力配体(例如，生物素)连接，即，连接物包括高亲和力配体。在一些实施方案中，核酸(例如，天然mRNA或修饰的mRNA)可以与NA连接物交联， 该NA连接物还与肽受体或高亲和力配体连接。这种交联可以通过本领域已知的任何方法来完成。例如，通过整体引用并入本文的美国专利第6416950号描述了进行这种交联的方法(参见，例如，美国专利第6416950号的图9-13)。在又一实施方案中，本发明包括在连接物中具有倒转的5’ -3’极性的双功能NA 连接物以便使其能够与核酸如mRNA或修饰的mRNA模板杂交，其中所述杂交在编码区外的 mRNA的3’端发生，并且其中所述核酸/修饰的连接物在其另一 3’端携带肽受体，如嘌呤霉素或其功能类似物(例如，但不限于吡唑嘧啶)或能够与多肽蛋白共价结合或高亲和力地结合的小分子。在几个实施方案中，核酸，优选mRNA或修饰的mRNA在3’端与NA连接物杂交，该 NA连接物本身通过共价键或通过高亲和力非共价键与多肽(或修饰的多肽)共价结合或高亲和力地结合。在其他实施方案中，NA连接物能够充当反转录mRNA的引物。另一实施方案包括与NA连接物可操作地连接的编码核酸，该编码核酸在其“5’ 端”携带反转极性的核酸部分(在引号中，如同有效地具有指导聚合的3’极性一样)，使得其除了经由茎环结构结合在NA连接物上的能力之外可以充当编码核酸模板聚合的引物， 该NA连接物在其3’端携带嘌呤霉素或相关类似物或小分子(参见图2和3)。在一些实施方案中，编码核酸与分支的NA连接物可操作地连接，其中NA连接物的部分与编码核酸的3’端互补(参见图幻。设想产生分支的NA连接物的任何本领域公认的手段。分支点可以在NA连接物内的任何位置出现。这种分支的NA连接物还可以充当它们所结合的编码核酸如mRNA反转录的引物。在一些实施方案中，编码核酸与分支的NA连接物可操作地连接，其中所述连接物与肽受体共价连接(参见图6)。在一些实施方案中，NA连接物包含锁核酸(LNA)，例如，二环核酸，其中核糖核苷在2’ -氧和4’ -碳原子之间由亚甲基单元连接。在具体的实施方案中，NA连接物与编码核酸互补的区域包含至少一部分LNA以增加核酸双链体的稳定性(参见Kaur等人(2006). Biochemistry 45(23) :7347_55。配体/警体连接在另一方面，X-展示复合体(例如，编码核酸和编码的多肽)通过高亲和力配体与其关联结合配偶体(配体受体)之间的高亲和力结合或共价结合而形成。在这种实施方案中，核酸可以与高亲和力配体共价或非共价连接，所述高亲和力配体继而与配体受体非共价或共价结合。在优选的实施方案中，相互作用是非共价的。在一些实施方案中，配体受体还与第二高亲和力配体缔合，所述第二高亲和力配体继而与肽受体连接。高亲和力配体/配体受体对的非限制性实例包括但不限于H(506/FKBP12、氨甲喋呤/ 二氢叶酸还原酶、和PPI-M58/甲硫氨酸氨基肽酶2。配体/配体受体对的其他非限制性实例示于表1中。在一些实施方案中，配体/配体受体对是生物素/链霉抗生物素。被考虑用于本发明方法的任何形式的链霉抗生物素包括但不限于单体链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素、四聚链霉抗生物素和它们的化学修饰的或遗传修饰的变体。在一些实施方案中，配体受体是四聚链霉抗生物素。在具体的实施方案中，四聚链霉抗生物素被化学交联以增加稳定性。表1.高亲和力配体/配体受体对的非限制性实例
高亲和力配体配体大小配体受体受体大小Kd 或 Ki参考文献生物素小分子链霉抗生物素四聚体53kDa1-20 fM蛭素65aa的肽凝血醇36kDa20 fMZFVp(O)F三肽羧肽酶10-27 fMBiochemistry 1991， 30:8165-70荧光素-生物素单价抗体48 fMPNAS 2000, 97:10701-5ABD (白蛋白结合结构域)46 aaHSA (白蛋白)50-500 fMProt. Eng. Des. Select. 2008, 21:515-2718 bp DNA辞指6个锌指2fMPNAS 1998’
权利要求
1.一种X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽编码序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子编码；和(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列，其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，并且其中所述第二核酸分子与所述多肽非共价结合。
2.如权利要求1所述的复合体，所述复合体还包含(a)高亲和力配体，所述高亲和力配体与所述第二核酸分子共价结合；和(b)配体受体，所述配体受体与肽受体结合，其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与所述多肽共价结合。
3.如权利要求2所述的复合体，所述复合体还包含第二高亲和力配体，其中所述第二高亲和力配体与所述肽受体共价结合，并且其中所述第二高亲和力配体与所述配体受体结合。
4.如权利要求3所述的复合体，其中所述肽受体通过连接物与所述第二高亲和力配体
5.如权利要求4所述的复合体，其中所述连接物包括聚乙二醇。
6.如权利要求4所述的复合体，其中所述连接物包括多聚唾液酸连接物。
7.如权利要求2所述的复合体，其中所述配体受体与所述肽受体共价结合。
8.如权利要求1所述的复合体，所述复合体还包含(a)配体受体，所述配体受体与所述第二核酸分子共价结合；和(b)高亲和力配体，所述高亲和力配体与肽受体结合，其中所述配体受体与所述高亲和力配体结合并且所述肽受体与所述多肽的C端共价纟口口。
9.如权利要求1所述的复合体，所述复合体还包含第三核酸分子，所述第三核酸分子包含与所述第二核酸分子的部分互补的核酸序列，其中所述第三核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，其中所述第三核酸分子与肽受体共价结合，并且其中所述肽受体与所述多肽共价结合。
10.如权利要求1-9任一项所述的复合体，其中所述第二核酸分子是分支的核酸分子。
11.如权利要求1-9任一项所述的复合体，其中所述第二核酸分子能够充当所述第一核酸分子反转录的引物。
12.—种X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽编码序列，所述核酸分子与第一高亲和力配体共价结合；(b)多肽，所述多肽由所述核酸分子编码；(c)配体受体，所述配体受体与肽受体结合，其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与所述多肽的C端共价
13.如权利要求12所述的复合体，其中所述配体受体与所述肽受体共价结合。
14.如权利要求12所述的复合体，所述复合体还包含第二高亲和力配体，其中所述第二高亲和力配体与所述肽受体共价结合，并且其中所述第二高亲和力配体与所述配体受体纟口口。
15.一种X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽编码序列，所述核酸分子与第一高亲和力配体共价结合；(b)第一配体受体，所述第一配体受体与第二高亲和力配体共价结合；和(c)多肽，所述多肽由第一核酸分子编码，其中所述多肽包含第二配体受体，其中所述第一高亲和力配体与所述第一配体受体结合，并且所述第二高亲和力配体与所述第二配体受体结合。
16.如前述权利要求任一项所述的复合体，其中所述第一高亲和力配体或所述第二高亲和力配体是生物素。
17.如前述权利要求任一项所述的复合体，其中所述第一高亲和力配体或所述第二高亲和力配体选自包括下列的组Π(506、氨甲喋呤、ΡΡΙ-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、荧光素-生物素、ABD(白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基) 酮和蛋白Α。
18.如前述权利要求任一项所述的复合体，其中所述第一配体受体或所述第二配体受体选自包括下列的组FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI (RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag和分选酶。
19.如前述权利要求任一项所述的复合体，其中所述第一配体受体或所述第二配体受体是链霉抗生物素。
20.如前述权利要求任一项所述的复合体，其中所述多肽选自包括下列的组抗体、VH 结构域、VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体、unibody、adnectin、亲和体、DARPin, anticalin、avimer、10Fn3 结构域禾口 versabody。
21.一种X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽编码序列，所述核酸分子与高亲和力配体共价连接；和(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子编码，其中所述多肽包含配体受体，其中所述配体与所述配体受体结合。
22.如权利要求21所述的复合体，其中所述配体是Π(506并且所述配体受体是FKBP的 FK506结合结构域。
23.如权利要求1-22任一项所述的复合体，其中所述第一核酸分子选自由下列组成的组ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNA 杂交 dsDNA 和 dsDNA/RNA 杂交体。
24.如权利要求1-22任一项所述的复合体，其中所述第一核酸分子的所述多肽编码序列不含有框内终止密码子。
25.如权利要求1-22任一项所述的复合体，其中所述多肽是结合蛋白。
26.如权利要求1-25任一项所述的复合体，其中所述结合蛋白是抗体的VH结构域或 VL结构域。
27.如权利要求1-22任一项所述的复合体，其中所述复合体不含有核糖体。
28.一种文库，所述文库包含多种前述权利要求任一项所述的X-展示复合体，其中所述复合体的至少一部分含有不同的多肽编码序列。
29.一种制备X-展示复合体的文库的方法，所述方法包括下列步骤(a)提供mRNA序列的文库，所述mRNA序列包含与第一核酸连接物互补的序列元件；(b)提供第一核酸连接物，所述第一核酸连接物与第一高亲和力配体可操作地连接以便使所述第一核酸连接物通过互补的核酸碱基配对与所述mRNA结合；(c)提供第二高亲和力配体，所述第二高亲和力配体与肽受体可操作地连接；(d)提供具有至少两个结合位点的配体受体或提供至少以便使所述配体受体与所述第一高亲和力配体和所述第二高亲和力配体结合；(e)容许mRNA翻译进行以便使所述肽受体与翻译的蛋白结合，从而形成连接所述mRNA 与所述蛋白的核酸-多肽复合体。
30.如权利要求四所述的方法，所述方法还包括容许使用所述核酸-多肽复合体中的所述第一核酸连接物作为引物进行mRNA反转录以便形成DNA/RNA杂交体。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法还包括降解所述mRNA并合成互补的DNA链， 从而形成所述核酸-多肽复合体中的DNA/DNA杂交体。
32.如权利要求四所述的方法，其中所述mRNA还包含TMV增强子。
33.如权利要求四所述的方法，其中所述mRNA还包含Cμ序列。
34.如权利要求四所述的方法，其中所述mRNA还包含FLAG标签。
35.如权利要求四所述的方法，其中所述mRNA还包含SA展示序列。
36.如权利要求四所述的方法，其中所述mRNA还包含A20尾。
37.一种核酸-多肽复合体的文库，所述核酸-多肽复合体的文库通过权利要求四-35 任一项所述的方法制备。
38.一种选择分离的核酸分子的方法，所述分离的核酸分子编码能够与感兴趣的抗原结合的多肽，所述方法包括下列步骤(a)提供权利要求四所述的核酸-多肽复合体的文库；(b)使所述文库与感兴趣的抗原接触；(c)从所述文库中选择与所述感兴趣的抗原结合的至少一种核酸-多肽复合体；和(d)分离所选择的核酸-多肽复合体的多肽编码序列。
39.一种制备能够与感兴趣的抗原结合的多肽的方法，所述方法包括(a)提供使用权利要求38所述的方法选择的多肽编码序列；和(b)表达所述多肽编码序列所编码的多肽。
40.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码通过权利要求四所述的方法选择的能够与感兴趣的抗原结合的多肽。
41.一种X-展示复合体，所述X-展示复合体包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽编码序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子编码；和(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列；(d)第一高亲和力配体，所述第一高亲和力配体与所述第二核酸分子共价结合；(e)第一配体受体；(f)第二高亲和力配体，所述第二高亲和力配体经由一个或多个连接分子与肽受体共价结合，其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，其中所述第一高亲和力配体与所述配体受体在第一结合位点非共价结合，其中所述第二配体与所述配体受体在第二结合位点非共价结合，并且其中所述一个或多个连接分子是聚乙二醇分子。
42.如权利要求41所述的复合体，其中所述第一高亲和力配体是生物素并且所述配体受体选自包括下列的组链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。
43.如权利要求41所述的复合体，其中所述第二高亲和力配体是生物素并且所述配体受体选自包括下列的组链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。
44.如权利要求41所述的复合体，其中所述第一高亲和力配体或所述第二高亲和力配体选自包括下列的组Π(506、氨甲喋呤、ΡΡΙ-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、荧光素-生物素、ABD(白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白 A0
45.如权利要求41所述的复合体，所述复合体还包含第二配体受体。
46.如权利要求45所述的复合体，其中所述第二配体受体选自包括下列的组FKBP12、 二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、 羧肽酶、单价抗体、HSA (白蛋白)、锌指、hRI (RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、 haloTag和分选酶。
47.如权利要求41所述的复合体，其中所述肽受体是嘌呤霉素。
48.如权利要求41所述的复合体，其中所述第一核酸分子或所述第二核酸分子还包括补骨脂素。
49.如权利要求41所述的复合体，其中所述多肽选自包括下列的组抗体、VH结构域、 VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体、unibody、adnectin、亲和体、DARPin、anticalin、 avimer、10Fn3 结构域禾口 versabody。
50.一种异双功能复合体，所述异双功能复合体包含(a)第一高亲和力配体，所述第一高亲和力配体与核酸分子共价结合；(b)第二高亲和力配体，所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合；和(c)配体受体，所述配体受体包含两个或更多个配体结合位点；其中所述第一高亲和力配体和所述第二高亲和力配体在不同的配体结合位点与所述配体受体结合。
51.如权利要求50所述的复合体，其中所述第一高亲和力配体与所述第二高亲和力配体是相同的。
52.如权利要求50所述的复合体，其中所述第一高亲和力配体与所述第二高亲和力配体是生物素。
53.如权利要求50所述的复合体，其中所述核酸分子包含补骨脂素部分。
54.如权利要求50所述的复合体，其中所述肽受体是嘌呤霉素。
55.如权利要求50所述的复合体，其中所述配体受体是多聚蛋白。
56.如权利要求50所述的复合体，其中所述配体受体是链霉抗生物素。
全文摘要
本发明提供可用于在体外鉴定具有期望特征的多肽的方法和组合物。
文档编号G01N33/50GK102177438SQ200980137939
公开日2011年9月7日 申请日期2009年7月24日 优先权日2008年7月25日
发明者亚历山大·利托维奇克, 理查德·W·瓦格纳 申请人:X博迪生物科学公司, 理查德·W·瓦格纳