针对编码功能蛋白的变体筛选多核苷酸文库的制作方法
【专利说明】针对编码功能蛋白的变体筛选多核巧酸文库 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求于2012年9月20日提交的美国临时申请号61/703, 566的权益，将其 通过引用W其全部内容而特此结合。 关于在联邦政府资助的研究与开发下完成的发明的权利声明
[0002] 不适用。 发明领域
[0003] 本发明设及微生物学、分子生物学和蛋白质生物化学领域。更具体而言，本发明设 及用于对多核巧酸文库分析和富集编码功能蛋白的变体的组合物和方法。 发明背景
[0004] 对多核巧酸文库筛选编码优选蛋白活性的变体在生物技术中是一项中屯、事 业（参见例如，雅克尔（化ckel)和希尔韦特化ilved)，生物技术当前述评（化rr化in Biotechnol) 21，753-759 (2010))。遗憾地，随着文库多样性增加，在文库中活性变体的数目 呈指数下降（参见例如，郭佑UO)等人，PNAS(2004);布洛姆炬loom)等人，PNAS(2005))。 该种相反的关系导致多核巧酸文库的筛选无效且昂贵。由于仅仅文库的一小部分编码功能 蛋白，因此通常必须筛选数千、数百万或甚至数十亿的变体，W便鉴定所希望的克隆。筛选 通常是缓慢且昂贵的，因为它典型地需要自定义的宿主细胞转化、蛋白质表达和频繁纯化 与定量、与底物或配体进行特异反应、信号检测与定量。
[0005] 为有助于文库筛选尝试，已经研发了许多方法和大量的机器人自动化（参见例 如，迈尔克（Maerkl)，生物技术当前述评（QirrOpinBiotechnol)22,59-65(2011);戈达德 (Goddard)和雷蒙德巧eymond)，生物技术当前述评15,314-322(2004);瓦勒尔（W址ler) 和雷蒙德，生物技术当前述评12,535-544(2001))。尽管如此，但是筛选通量是不足的且 仍是昂贵的，因为必须从庞大的可能性中鉴定有希望的变体。例如，在一个100-氨基酸 蛋白中突变两个随机氨基酸形成包含1.98X106个独特成员的文库（参见例如，迪特里希 值ietrich)等人，生物化学年鉴（AnnRevBiochem)79,563-590(2010))。所有筛选途径的 中屯、局限在于，它们必须针对祀蛋白与特异反应物的活性或相互作用并且针对检测与分离 阳性变体的手段两者进行自定义。 发明概述
[0006] 在不同方面中，在此考虑的本发明或多个发明可W包括但无需局限于W下实施例 中的任何一个或多个。
[0007] 实施例1 ; 一种针对可能编码功能多肤的多核巧酸而对多个多核巧酸进行富集并 对该富集的多个多核巧酸进行筛选的方法，该方法包括；(a)提供编码一种多肤的变体的 多个多核巧酸，其中该些多核巧酸中的至少一些编码一种具有至少一种活性的多肤；化） 从该些多核巧酸产生多肤；（C)确定该些多肤是否可溶；（d)选择编码可溶性多肤的多核巧 酸，W形成富集的多个多核巧酸；并且（e)针对编码具有该活性的多肤的多核巧酸筛选该 富集的多个多核巧酸。
[000引实施例2 ;如实施例1所述的方法，其中所述选择产生编码一种具有该活性的多肤 的多核巧酸的至少2倍富集。
[0009] 实施例3 ;如实施例2所述的方法，其中所述选择产生编码一种具有该活性的多肤 的多核巧酸的至少选自下组的富集程度的富集，该组由W下各项组成；5倍、10倍、15倍、20 倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90 倍、95 倍、100 倍、1〇3倍、10 4倍、10 5倍、10 6倍、10 8倍W及 10 9倍。
[0010] 实施例4 ;一种关于可能编码功能多肤的多核巧酸的水平来比较至少两个多核巧 酸文库的方法，该方法包括；(a)提供编码相同多肤的变体的多核巧酸的至少两个不同文 库；化）针对每一多个多核巧酸；（i)从该些多核巧酸产生多肤；并且（ii)确定该些多肤是 否可溶；并且（C)将具有最高水平的可溶性多肤的多个多核巧酸鉴定为包含最高水平的可 能编码功能多肤的多核巧酸的多个多核巧酸。
[0011] 实施例5 ;如实施例4所述的方法，其中每一多个多核巧酸都包括至少一些编码一 种具有至少一种活性的多肤的多核巧酸，并且该方法另外包括针对编码具有该活性的多肤 的多核巧酸筛选该鉴定的多个多核巧酸。
[0012] 实施例6 ;如任何W上实施例所述的方法，其中该方法另外包括针对编码具有高 于预定水平的活性的多肤的多核巧酸筛选该富集或鉴定的多个多核巧酸。
[0013] 实施例7 ;如任何W上实施例所述的方法，其中化）的产生包括在宿主细胞中表达 该些多肤。
[0014] 实施例8 ;如实施例7所述的方法，其中将该些多肤在宿主细胞中表达为融合蛋 白，其中该融合蛋白还包括一个溶解度报告部分。
[0015] 实施例9 ;如实施例8所述的方法，其中该宿主细胞表达一种互补多肤，该互补多 肤能够结合至融合蛋白的溶解度报告部分，W产生一种可检测的蛋白质复合物。
[0016] 实施例10 ;如实施例9所述的方法，其中化）的产生包括；在该宿主细胞中从一种 表达载体表达该些融合蛋白，该表达载体包括诱导型或阻抑型启动子；终止该些融合蛋白 的表达并且允许该些宿主细胞休眠一段时间足W允许降解或加工错误折叠的融合蛋白；所 述休眠期后，从诱导型或阻抑型启动子表达该互补多肤。
[0017] 实施例11 ;如实施例10所述的方法，其中确定该些多肤是否可溶包括针对该可检 测的蛋白质复合物筛选该些宿主细胞。
[0018] 实施例12 ;如实施例11所述的方法，其中选择该些编码可溶性多肤的多核巧酸W 形成富集的多个多核巧酸包括：裂解包括该可检测的蛋白质复合物的任何一个或多个宿主 细胞；并且回收编码该融合蛋白的该多核巧酸。
[0019] 实施例13 ;如实施例12所述的方法，其中通过核酸扩增回收编码该融合蛋白的该 多核巧酸。
[0020] 实施例14 ;如实施例1-6中任一项所述的方法，其中化）的产生包括在一种反应 混合物中表达该些多肤，该反应混合物包括用于体外转录/翻译的组分。
[0021] 实施例15 ;如实施例14所述的方法，其中在分开的反应混合物中表达不同多肤， 该些分开的反应混合物包括用于体外转录/翻译的组分，其中至少约20%的该些反应混合 物中每反应混合物表达一种或更少的所述多肤（即，一种多肤或没有多肤）。
[0022] 实施例16 ;如实施例15所述的方法，其中该些分开的反应混合物包括油包水乳液 中的水相液滴。
[0023] 实施例17 ;如实施例16所述的方法，其中将该些多肤表达为融合蛋白，其中每种 融合蛋白都包括一个或多个溶解度报告部分，该一个或多个溶解度报告部分包括；多肤附 接标签，该标签能够与该多个多核巧酸中的多核巧酸形成共价键，或W其他方式结合至其 上；W及多肤亲和标签。
[0024] 实施例18 ;如实施例17所述的方法，其中化）的产生包括；在该些水相液滴中表 达该些融合蛋白；并且允许每种融合蛋白都被表达，该每种融合蛋白都能够与多核巧酸在 该水相液滴中形成共价键，或W其他方式结合至其上。
[0025] 实施例19 ;如实施例18所述的方法，其中确定该些多肤是否可溶，并且选择该些 编码可溶性多肤的多核巧酸W形成富集的多个多核巧酸包括通过亲和捕获而回收结合至 融合蛋白的多核巧酸。
[0026] 实施例20 ;如任何W上实施例所述的方法，其中该多个多核巧酸包括来源于来自 植物或动物的样品或来源于环境样品的多核巧酸集。
[0027] 实施例21 ;-种筛选有助于蛋白质折叠的分子伴侣的方法，该方法包括；(a)在宿 主细胞中或在体外反应混合物中表达一种融合蛋白，其中该融合蛋白包括一个趋于错误折 叠或凝集的部分，其中该部分被连接至一个或多个溶解度报告部分，并且其中该宿主细胞 或体外反应混合物还包括或产生一种潜在的分子伴侣；化）确定该融合蛋白是否可溶；（C) 如果该融合蛋白是可溶的，则将该潜在的分子伴侣鉴定为有助于该融合蛋白的折叠的分子 伴侣。
[002引实施例22 ;如实施例21所述的方法，其中在多个宿主细胞或体外反应混合物中表 达该融合蛋白，并且不同宿主细胞或反应混合物分别包括或产生不同的潜在的分子伴侣， 并且其中，当在体外反应混合物中表达该融合蛋白时，至少约20%的该些反应混合物中每 反应混合物包括或产生一种或更少的所述潜在的分子伴侣。
[0029] 实施例23;如实施例22所述的方法，其中该些潜在的分子伴侣表达自选自W下各 项的多核巧酸集：编码已知的分子伴侣多肤的集，编码一种或多种已知的分子伴侣多肤的 变体的集，编码肤的集，来源于来自植物或动物的样品或来源于环境样品的集，或者该些潜 在的分子伴侣包括选自W下各项的小分子集；多个已知的小分子分子伴侣，一种或多种已 知的小分子分子伴侣的多个变体，和多个小分子，其中在该小分子集中的每个小分子都被 连接至独特的多核巧酸条码。
[0030] 实施例24 ;如实施例23所述的方法，其中一种给定的潜在的分子伴侣是一种通过 表达编码该潜在的分子伴侣的多核巧酸而产生于该宿主细胞或体外反应混合物中的多肤 或肤。
[0031] 实施例25 ;如实施例22-24中任一项所述的方法，其中在表达一种互补多肤的宿 主细胞中表达该融合蛋白，该互补多肤能够结合至融合蛋白的溶解度报告部分，W产生一 种可检测的蛋白质复合物。
[0032] 实施例26 ;如实施例25所述的方法，其中确定该些融合蛋白是否可溶包括针对该 可检测的蛋白质复合物筛选该些宿主细胞。
[003引实施例27 ;如实施例24所述的方法，其中鉴定该潜在的分子伴侣包括：裂解包括 该可检测的蛋白质复合物的任何一个或多个宿主细胞；并且回收编码该潜在的分子伴侣的 多核巧酸。
[0034] 实施例28 ;如实施例27所述的方法，其中通过核酸扩增回收编码该潜在的分子伴 侣的该多核巧酸。
[003引实施例29 ;如实施例22-24中任一项所述的方法，其中在分开的反应混合物中表 达该些融合蛋白，该些分开的反应混合物包括油包水乳液中的水相液滴。
[0036] 实施例30 ;如实施例29所述的方法，其中每种融合蛋白都包括一个或多个溶解度 报告部分，该一个或多个溶解度报告部分包括；多肤附接标签，该标签能够与多核巧酸形成 共价键，或W其他方式结合至其上；W及多肤亲和标签。
[0037] 实施例31 ;如实施例30所述的方法，其中该方法包括允许每种融合蛋白都该样， 该每种融合蛋白都能够与多核巧酸在该水相液滴中形成共价键，或W其他方式结合至其 上，该多核巧酸编码潜在的分子伴侣，或结合至其上。
[003引实施例32 ;如实施例31所述的方法，其中确定该融合蛋白是否可溶包括通过亲和 捕获而回收结合至融合蛋白的多核巧酸。
[0039] 实施例33 ;-种用于鉴定一个或多个可溶和/或功能结构域的蛋白质结构域作 图方法，该方法包括；(a)在宿主细胞中或在体外反应混合物中表达一种融合蛋白，其中该 融合蛋白包括有待作图的蛋白质的一部分，其中该部分被连接至一个或多个溶解度报告部 分；化）确定该融合蛋白是否可溶；（C)如果该融合蛋白是可溶的，则将该部分鉴定为作为 可溶和/或功能结构域的部分。
[0040] 实施例34 ;如实施例33所述的方法，其中在多个宿主细胞或体外反应混合物中表 达多个不同的融合蛋白，并且其中，当在体外反应混合物中表达该融合蛋白时，至少约20% 的该些反应混合物中每反应混合物包括或产生一种或更少的所述潜在的分子伴侣。
[0041] 实施例35 ;如实施例34所述的方法，其中该多个不同的融合蛋白包括有待被作图 绘的蛋白质的多个不同部分，每个部分都被连接至一个或多个溶