用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统的制作方法
【专利说明】用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系 统
[0001] 本申请是国际申请日为2011年6月21日、国际申请号PCT/EP2011/060280于2012 年12月24日进入中国国家阶段、申请号201180031310. 4、发明名称"用于核酸结合物的具 有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统"申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及药物领域，具体为肿瘤学领域。
【背景技术】
[0003] 癌症的治疗主要由只要有可能的手术、细胞毒剂例如化学疗法以及放射疗法构 成。在过去十年中，已出现了用于癌症治疗的分子疗法，例如：靶向细胞膜受体的单克隆抗 体、酪氨酸激酶受体的抑制剂或靶向参与细胞增殖、死亡和存活的信号转导的其他激酶。作 为细胞生长抑制剂，它们的单独治疗方案往往缺乏足够的临床效益。通过与细胞毒剂组合， 往往获得协同性结果，但该结果受到它们累积的副作用的限制。
[0004] 大多数癌症治疗直接或间接地在所治疗的增殖性肿瘤细胞中造成DNA损伤，这最 终导致所述细胞的死亡。然而，肿瘤对这些治疗的几种固有和获得的耐受性至少部分是由 于肿瘤细胞的有效DNA修复活性引起的。目前众所周知的是，DNA修复是癌症治疗的重要靶 标（Helleday等?Nat.Rev.Cancer, 2008, 8:193-204)。该领域中最先进的药物开发是PARP 抑制剂。
[0005] 由于DNA修复在所有生命界中都是必不可少的存活过程，因此，它具有多种特化 的修复途径，并具有一定的冗余度，使得当一种途径缺陷或被治疗剂例如DNA修复抑制剂 阻断时，该过程仍然是健全的。因此，不是靶向参与DNA修复过程的关键基因/蛋白质，而 是，不论其生物重要性和临床相关性如何，创新性的分子疗法必须将一种或数种关键途径 作为整体性靶标并结合常规疗法来对待，从而达到最有效的癌症治疗。
[0006] 为了使癌不能防御现有的治疗，设想了整体性靶向DNA损伤感应、信号转导和修 复途径。一种策略由下面的方式构成：将模拟双链断裂（DSB)的、名为Dbait的修饰的 短DNA分子导入到在那时之前可以有效地修复DSB并因此存活的细胞中。下面这一事 实解释了Dbait联合放射疗法（RT)或化学疗法（CT)的抗肿瘤功效：Dbait分子捕获初 始DSB感应复合物、干扰下游的修复信号转导，随后瓦解所有DSB修复系统（非同源末 端连接和同源重组途径两种），并最终抑制DSB修复（W02005/040378 ;W02008/034866 ; Quanz等，2009,ClinicalCancerResearch15:1308;Quanz等，2009,PLoSONE 4:e6298;Dutreix等，2010,Mut.Res. 704:182)。最终，癌细胞不再能够逃脱死亡。还发 现，在不与放射疗法（RT)或化学疗法（CT)组合的情况下，Dbait分子单独也是有效的 (W02008/084087)。
[0007] 然而，一旦鉴定到了有临床用途的活性剂后，经常出现的问题是要找到最佳的方 式来递送活性剂，特别是核酸剂。有效的非病毒DNA/RNA递送系统的发展和优化必须解决 毒性问题，《组织和全身性屏障》例如降解，带电的血清成分对粒子的调理作用，快速清除和 在非靶组织的蓄积；当通过全身性途径施用活性物质时，对其递送而言的"细胞屏障"，例如 低摄取跨越细胞质膜，DNA分子在活性细胞室中的释放不充分，以及缺乏细胞核靶向（基因 治疗所需要的）。
[0008] 事实上，大多数这些活性剂必须被细胞摄取并到达细胞质和/或细胞核，才能有 效。具体地，当将包括核酸的活性剂以其"游离"或裸露形式施用时，它们常常在被靶细胞 摄取之前和之后受到降解。在细胞内，这种降解主要是由于下面这一事实引起的：核酸通过 内吞进入细胞，被隔离在细胞的内涵体中，内涵体最终发展成溶酶体，在溶酶体中，化学降 解和酶降解是非常有效的。
[0009] 在现有技术中，已将活性剂与多种载体结合并囊封到脂质体、胶束和纳米粒子中， 它们在其中受到保护而免于在血清中降解。现有技术还采用了多种化学方法来将核酸和其 他活性剂共价偶联至分子载体，所述分子载体包括聚合物例如葡聚糖或PEG，或旨在降低清 除率的分子，包括转铁蛋白的载体，亲脂性分子例如与SiRNA连接以增强细胞摄取的胆固 醇（Chen等，2010,J.ControlledRelease144:227)。这样的载体可以包括革巴向部分例如 抗体、多肽、核酸和其他物质，以将活性剂导向所选择的靶细胞中。现有技术还公开了用于 药物组合物的改善内吞的分子（US2008/0194540)。
[0010] 然而，当活性DNA/RNA剂被细胞通过内吞过程摄取时，它们常常最终成为被隔离 在它们无法逃脱的内涵体中，由此极大地降低了它们的治疗潜力。例如，Zimmermann等 表明，胆固醇-SiRNA(ApoB-I)结合物在小鼠中的效力比其脂质体制剂（SNALP载体）小 约 1000 倍：100mg/kgchol-siApoB-l相当于 0?lmg/kgSNALP-ApoB-l(Zimmermann等 Nature, 2006, 441:111-114,补充图 1)。
[0011] 对于核酸，现有技术已尝试通过使用阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺（PEI) (W096/02655)或具有膜融合脂质或肽例如SNALP载体的脂质体来解决这个问题。PEI能够 通过明确描述的质子海绵效应来使内涵体不稳定化，并由此促进核酸的释放。然而，PEI的 使用往往受到其细胞毒性的限制，并且到目前为止还没有被批准用于人类。脂质体制剂也 表现出毒性和受限的核酸囊封（通常在l_2mg/mL的范围内），所述受限的核酸囊封可能不 适合于需要核酸剂的高有效荷载的应用。
[0012] 已知，"内涵体溶解（Endosomolytic) "剂例如氯喹在培养的细胞中通过促进核酸 从内涵体逃脱进入细胞质来增强核酸的转染。然而，氯喹的应用仅限于体外应用，并且仅很 少被评估用于辅助核酸的体内递送。其原因可能是，由于氯喹的毒性，现有技术中关于核酸 的报道的教导与其体内应用相背离。
[0013] Benns等（2000,Bioconj.Chem. 11:637)报道了"尽管氯喹已被证明有助于质粒 DNA释放进入细胞质中，但据发现，氯喹是有毒的，因此不能在体内使用"。该问题的部分原 因是下面这一事实：需要相对高浓度的游离氯喹来到达内涵体中核酸（即质粒DNA)的相同 部位。类似地，Zhang等（2003,JGeneMed5:209)研宄了氯喹用于基因递送至肝脏的体内 应用。在这篇文章中，他们将质粒与作为DNA载体的肽（聚赖氨酸/molossin) -起使用。 他们的结论是，尽管氯喹可有效促进基因递送至肝脏，但需要多次给药，并且它的应用受到 了全身性毒性的限制。事实上，他们证实了，氯喹的急性全身性毒性将体内应用水平限制到 大大低于最佳基因递送所需要的水平。氯喹的局部递送也受到氯喹的局部毒性以及它们从 递送部位向外扩散的限制。最后，当使用裸DNA时，他们没有观察到基因递送或观察到非常 低的水平。
[0014] 在这方面，W02007/040469公开了如下解决方案：通过将氯喹与活性剂共价偶联， 从而降低所需要的总剂量，可以克服必需的高浓度氯喹的问题。W02009/126933提出将待递 送的核酸与内涵体溶解剂和靶向配体两者共价连接。
[0015]氯喹及其衍生物例如羟氯喹被用于疟疾的治疗性和预防性治疗。还研宄了 它与癌症的放射疗法和/或化学疗法的组合使用（Sotelo等，2006,AnnInternMed 144:337-342 ;NCT01023477和NCT00969306)。其假设是，氯喹/羟氯喹抑制自噬，自噬是通 过将治疗剂输出到溶酶体中使它们在其中被降解的正常细胞防御过程。
[0016]总之，基于核酸的疗法的优化需要进一步解决合成DNA递送系统的效率和细胞毒 性。
【发明内容】
[0017]本发明提供了用于体内递送有治疗用途的核酸的新型有效方法，所述方法是基于 有治疗用途的核酸与促进内吞的分子的共价结合、以及结合的有治疗用途的核酸与内涵体 溶解剂的组合使用。具体地，该体内递送系统被用于Dbait分子。
[0018] 因此，本发明涉及包含结合的核酸分子和喹啉内涵体溶解剂的药物组合物，所述 结合的核酸分子具有至少一个游离末端和与人类基因组中的任何基因具有小于60%序列 同一性的20-200bp的DNA双链部分，所述核酸分子与促进内吞的分子共价连接，所述促进 内吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的内吞的配体。所述药物组合 物还可以包含DNA损伤性抗肿瘤剂。
[0019] 本发明还涉及产品，所述产品包含结合的核酸分子和喹啉内涵体溶解剂作为同 时、分开或顺序使用的组合制剂，所述结合的核酸分子具有至少一个游离末端和与人类基 因组中的任何基因具有小于60 %序列同一性的20-200bp的DNA双链部分，所述核酸分子与 促进内吞的分子共价连接，所述促进内吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受 体介导的内吞的配体。所述产品还可以包含DNA损伤性抗肿瘤剂。优选地，在结合的核酸 分子之前和/或同时施用喹啉内涵体溶解剂。具体地，将喹啉内涵体溶解剂作为预处理通 过口服途径施用至少一周，然后将结合的核酸分子和喹啉内涵体溶解剂作为同时、分开或 顺序使用的组合制剂来施用。
[0020] 本发明涉及如本文所公开的药物组合物或产品，所述药物组合物或产品用于治疗 癌症。优选地，所述治疗还包含放射疗法或化学疗法，优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂。任选 地，DNA损伤性抗肿瘤剂选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢 剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。
[0021] 在优选实施方式中，喹啉内涵体溶解剂是氯喹或羟氯喹，优选为氯喹。
[0022] 在优选实施方式中，促进内吞的分子选自单或双链脂肪酸例如十八烷基和二油酰 基，生育酚，叶酸盐或叶酸，胆固醇，糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和 铃蟾肽，以及蛋白质例如整合素，优选为单或双链脂肪酸、叶酸盐和胆固醇，更优选为二油 酰基、十八烷基、叶酸和胆固醇，还更优选为胆固醇。
[0023] 在优选实施方式中，结合的核酸分子具有下式之一：
[0024]
【主权项】
1. 结合的核酸分子，其具有下式之一：
其中带下划线的核巧酸是指有或没有硫代磯酸醋或甲基麟酸醋骨架的核巧酸，连接的 1'选自六己二醇、四脱氧胸巧订4)和2，19-双（磯）-8-117化323-1-哲基-4-氧杂-9-氧 代-十九烧；m是1并且L是甲酯胺基低聚己二醇，C选自二油酷基，十八烷基，叶酸，生育酪 和胆固醇。
2. 权利要求1的结合的核酸分子，其中促进内吞的分子选自生育酪和胆固醇。
3. 权利要求1的结合的核酸分子，其中所述分子是
其中带下划线的核巧酸是指具有硫代磯酸醋骨架的核巧酸。
4. 药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的结合的核酸分子。
【专利摘要】本发明涉及药物领域，具体为肿瘤学领域。本发明公开了用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统。具体地，本发明涉及用于与促进内吞的分子结合的有治疗用途的核酸的、具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统，尤其是用于治疗癌症。
【IPC分类】A61P35-00, A61K31-7088, C07H21-00, A61K47-48
【公开号】CN104788523
【申请号】CN201510086529
【发明人】孙建生, 马里·杜特雷克斯, 马里亚·宽茨
【申请人】Dna医疗公司, 法国居里学院, 法国国家科学研究中心
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2011年6月21日
【公告号】CA2802463A1, CN103025356A, CN103025356B, EP2585113A1, US20130131155, WO2011161075A1