一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法及应用与流程

本发明涉及一种基于crispr/cas9技术制备水稻ospil15突变体的方法及应用，属于植物基因工程
技术领域：
。
背景技术：
：基因编辑技术指能够对目标基因进行“编辑”，实现对特定dna片段的敲除、插入等。近年来，一种名为crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatednuclease9，cas9)的基因组定向编辑技术备受瞩目。2013年初，《science》两篇文章首次报道了cas9核酸酶用于人类和小鼠细胞基因组编辑(malietal.,2013；congetal.,2013)，其作为第三代基因编辑技术受到人们广泛关注。crispr/cas9技术是利用核酸酶cas9蛋白与单导向rna(singleguiderna,sgrna)形成复合体，sgrna通过碱基互补配对决定靶序列特异性，cas9蛋白作为核酸酶切割与sgrna上的间隔序列(spacers)互补的基因组dna，造成双链dna损伤，随后通过体内的nhej(non-homologousendjoining)修复机制引入基因突变(wiedenheftetal.,2012)。随着crispr/cas9系统在人类和动物细胞中建立与应用，crispr/cas9系统在拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米、高粱、番茄和甜橙等植物中均实现了基因组的定向编辑(belhajetal.,2015；doudnaetal.,2014)。水稻是世界上最主要的粮食作物之一，为全球半数以上人口提供食物来源。水稻的稳产和增产对保障我国粮食安全具有重要的战略意义。水稻产量主要由产量构成三要素穗数、每穗粒数和千粒重所决定，而粒重是决定产量三要素中遗传力最高的因素。粒重主要由籽粒大小和籽粒充实度所决定，而籽粒大小又主要由粒长、粒宽和粒厚所控制(xingetal.,2015)。目前，随着突变体研究加速以及图位克隆和qtl等生物技术手段的运用，许多粒长、粒宽和粒重相关性状基因(gs3、gs5、gw2、gw5、gw7和gw8)相继被克隆(songetal.,2007；jianfengetal.,2008；maoetal.,2010；lietal.,2011；wangetal.,2012；wangetal.,2015)。其中gs3是控制水稻粒重和粒长的主效qtl，在调节籽粒和器官大小中发挥负调节子的功能；gs5编码一个丝氨酸羧肽酶，是一个控制水稻粒宽、充实度和千粒重的数量性状基因；gw2编码一个环型e3泛素连接酶，负调控籽粒粒宽和粒重；gw5可通过影响泛素化降解途径控制籽粒粒宽和粒重；gw7可通过改变细胞分裂模式控制水稻粒形和提升稻米品质；gw8是一个包含sbp结构域的转录因子，能够直接与gw7启动子结合并抑制其表达，从而控制籽粒大小和品质。对这些基因的研究为水稻育种提供了重要理论依据，部分产量相关基因已被广泛应用于水稻高产稳产品种培育中。光敏色素互作因子pifs(phytochrome-interactingfactors)或称pils(phytochromeinteractingfactor-like)是bhlh转录因子家族中的一类转录因子，其主要特性是能与光敏色素互作直接或间接调控光响应基因。作为bhlh蛋白的一种，所有pifs家族的蛋白都包含在n端与光敏色素互作的apb(activephytochromeb-binding)或apa(activephytochromea-binding)结构域和c端bhlh-dna结合结构域及核定位结构域(shenetal.,2008；khannaetal.,2004)。在水稻中，通过同源性分析在水稻基因组中鉴定了6个pif转录因子(ospil11-ospil16)(nakamuraetal.,2007)。ospil13在水稻中超表达后能够促进水稻节间的伸长，反之低表达则抑制其节间伸长(todakaetal.,2012)，超表达ospil15的水稻种子在黑暗环境中的萌发受到抑制(zhouetal.,2014)，ospil16能够负调控pgl1进而调控籽粒大小(heangetal.,2012)。因此，构建光敏色素互作因子ospil15突变体对于水稻种子增重、增产等育种领域具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于crispr/cas9技术制备水稻ospil15突变体的方法。本发明还提供了上述方法制得的突变体在水稻育种中的应用。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于crispr/cas9技术制备水稻ospil15突变体的方法，包括如下步骤：1)grna靶点序列的选择：序列为5′-gacttcttctccgagctccagg-3′，所述序列3′端的pam序列为agg，限制性内切酶sacⅰ识别序列为5′-gagctc-3′；2)grna寡核苷酸链上下游引物的设计：上游引物为sgrna-f：5′-ggcggacttcttctccgagctcc-3′，下游引物为sgrna-r：5′-aaacggagctcggagaagaagtc-3′；3)grna表达载体构建：将所述上下游引物混合、退火，得寡核苷酸双链dna；用内切酶bsaⅰ酶切pbun411质粒，得线性质粒；用t4连接酶将所述线性质粒和寡核苷酸双链dna连接，得连接产物；将连接产物转化、筛选、验证，即得pbun411-grna表达载体；4)将pbun411-grna表达载体导入农杆菌中，得crispr/cas9-grna农杆菌；用crispr/cas9-grna农杆菌侵染水稻愈伤组织；5)将步骤4)获得的愈伤组织诱导得到再生苗，筛选得到转基因阳性植株，鉴定即得水稻ospil15突变体。步骤3)中所述退火为在65℃退火5min。步骤3)中所述酶切的体系为：pbun411质粒2μg，10×cutsmartbuffer5μl，bsaⅰ10u，加ddh2o至50μl。步骤3)中所述酶切的条件为：37℃酶切4h。步骤3)中t4连接酶连接的体系为：线性质粒6μl，寡核苷酸双链dna2μl，10×buffer5μl，t4dna连接酶1μl。步骤3)中t4连接酶连接的条件为：4℃连接12h。步骤3)中将连接产物转化、筛选、验证的具体操作为：将连接产物用热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，菌液涂布于含50mg/l的卡那霉素lb培养基平板，过夜培养后挑取单克隆摇菌扩繁；使用引物pbun411-vf和pbun411-vr(引物序列见表1)进行菌落pcr验证，扩增片段为336bp的为正确的pbun411-grna表达载体。所述lb培养基的配方为(1l)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g。步骤4)中采用热激法将pbun411-grna表达载体导入土壤农杆菌eha105。步骤5)为在除草剂的条件下筛选得到再生苗。步骤5)为采用抗除草剂基因引物进行筛选；所用引物为：bar-f：aagcacggtcaacttccgta；bar-r：gaagtccagctgccagaaac。步骤5)中筛选出bar-f和bar-r扩增产物为412bp的植株，进行进一步鉴定。步骤5)为采用grna靶点序列两侧引物进行鉴定；两侧引物为ospil15-test-f：5′-tgttttgtgtgtgcaggtcc-3′；ospil15-test-r：5′-cgggagaagagcgagaagtt-3′。步骤5)中所述鉴定包括：a：以转基因阳性植株dna为模板，ospil15-test-f和ospil15-test-r为检测引物，进行pcr扩增；b：用sacⅰ酶酶切pcr扩增产物；c：用电泳分离酶切产物，若电泳结果仅为400bp和273bp两条带，为未突变株；否则，为突变株。步骤a中pcr扩增体系为：2×taqmastermix25μl，ospil15-test-f2μl，ospil15-test-r2μl，dna模板1μg，加ddh2o至50μl。步骤a中pcr扩增条件为：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，终延伸72℃10min，其中变性，退火和延伸为30个循环。步骤b中酶切体系为：pcr产物1μg，10×lbuffer2μl，sacⅰ1u，加ddh2o至20μl。步骤b中酶切条件为：37℃酶切过夜。步骤c中采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离。将所述转基因阳性植株的pcr扩增产物测序，确定是一条同源染色体突变的杂合体，或者两个等位基因发生不同突变的双等位突变体，亦或是两个等位基因发生相同突变的纯合突变体，亦或是未发生突变单株。由上述制备水稻ospil15突变体的方法制得的水稻ospil15突变体在水稻育种中的应用。具体的，选择所述水稻ospil15突变体的自交后代中的纯合突变体用于水稻种子粒长育种。例如，选择t0代双等位突变体自交得t1代，从t1代等后继世代中选择纯合突变体用于水稻育种。本发明的有益效果是：本发明依据crispr/cas9技术原理对水稻光敏色素互作因子ospil15进行定向编辑。设计ospil15突变靶点，构建crispr/cas9-grna(pbun411-grna)表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株，利用酶切法和测序法分析鉴定突变单株。通过该方法获得了一套具有重要应用价值的水稻ospil15突变体新种质，与野生型日本晴相比，制备的ospil15突变体新种质籽粒粒长极显著增加。本发明针对当前人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，探讨了光敏色素互作因子ospil15在水稻品种改良中的功能，为通过调控ospil15基因表达来控制水稻籽粒粒长提供了试验依据。本发明基于crispr/cas9技术对水稻ospil15突变体创制的成功实施，为快速创建籽粒增大等生产上具有重要应用价值的水稻新品系提供一种简单有效的技术手段，在提高水稻籽粒大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的应用价值，对水稻高产和稳产育种具有重要的实践意义。附图说明图1为grna靶位点及crispr/cas9-grna表达载体的组装示意图；图2为pcr产物和酶切pcr产物鉴定基因编辑植株的琼脂糖凝胶结果图；图3为不同ospil15突变体突变序列与野生型日本晴序列分析比对图；图4为ospil15突变体与野生型日本晴籽粒粒长比较图；图5为ospil15突变体与野生型日本晴籽粒粒长差异分析图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例及对比例中的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实施例11、ospil15基因grna靶点序列的选择及grna寡核苷酸链的上下游引物的设计根据水稻ospil15基因(genbank登录号ak102252.1)的外显子序列设计grna靶点序列5′-gacttcttctccgagctccagg-3′，该序列3′端pam序列为agg，cas9蛋白将在agg序列上游第3-4bp处剪切dna形成平滑末端，该剪切处有一段限制性内切酶sacⅰ识别序列(5′-gagct▼c-3′)，靶位点、pam序列及酶切位点如图1-a：sgrna与cas9蛋白靶向ospil15基因示意图所示。根据sgrna序列设计grna寡核苷酸链的上下游引物，引物序列见表1中sgrna-f和sgrna-r；其中sgrna-f和sgrna-r中前四位碱基为bsaⅰ限制性内切酶的黏性末端接头。2、crispr/cas9-grna(pbun411-grna)表达载体的构建1)取等量的grna寡核苷酸链上下游引物(终浓度10μm)混合，经65℃退火5min后逐渐冷却至室温形成互补双链dna，用于后续载体的构建；2)使用限制性内切酶bsaⅰ酶切crispr/cas9载体pbun411，crispr/cas9载体pbun411由中国农业大学陈其军教授惠赠(xingetal.,2014)，使其线性化，50μl酶切体系如下：pbun411质粒2μg，10×cutsmartbuffer5μl，bsaⅰ10u(1μl)，加ddh2o至50μl，37℃酶切4h后65℃热处理20min使酶失活；纯化后加入如下连接体系：线性质粒6μl，寡核苷酸双链2μl，10×buffer5μl，t4dna连接酶1μl；连接的条件为：4℃连接12h。3)连接产物用热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，菌液涂布于含50mg/l的卡那霉素lb培养基平板，过夜培养后挑取单克隆摇菌扩繁。使用引物pbun411-vf和pbun411-vr(引物序列见表1)进行菌落pcr验证。pcr体系为：2×taqmastermix5μl；pbun411-vf(10μm)0.4μl；pbun411-vr(10μm)0.4μl；单克隆模板1μl；ddh2o3.2μl。pcr条件为：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，终延伸72℃10min，其中变性，退火和延伸为35个循环。pbun411空载体扩增片段长度为1538bp，经bsaⅰ酶切后连接，靶序列插入扩增片段大小应为336bp(如seqidno.17所示)，选取pcr片段大小正确的菌落，提取质粒，表明pbun411-grna表达载体构建成功。该靶序列由osu3基因启动子驱动，编码cas9蛋白的基因由玉米泛素基因(ubi)启动子驱动(如图1-b：crispr/cas9-grna表达载体lb和rb之间线性结构所示)。实施例2农杆菌介导水稻愈伤遗传转化和阳性转基因植株检测采用热激法，参照hood等报道方法(hoodetal.,1993)将pbun411-grna表达载体导入土壤农杆菌eha105，使用含有crispr/cas9-grna质粒的农杆菌侵染水稻品种日本晴(oryzasativassp.japonicacv.nipponbare)的愈伤组织，参照nishimura等(nishimuraetal.,2006)报道方法进行水稻转基因，用除草剂(basta)筛选获得再生苗。采用sls法提取转基因植株基因组dna，使用抗除草剂基因(bar)引物bar-f和bar-r(引物序列见表1)进行转基因植株阳性筛选(该除草剂基因位于pbun411-grna表达载体上)。pcr体系为：2×taqmastermix5μl；bar-f(10μm)0.4μl；bar-r(10μm)0.4μl；dna模板1μl；ddh2o3.2μl。pcr条件为：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃30s，终延伸72℃10min，其中变性，退火和延伸为35个循环。pcr扩增产物长度为412bp，即为阳性转基因植株。实施例3ospil15基因t0代突变体筛选鉴定1)为了检测获得t0代阳性转基因植株靶位点的突变情况，根据水稻光敏色素互作因子ospil15基因全长序列(如seqidno.18所示)在靶位点两侧设计引物ospil15-test-f和ospil15-test-r(引物序列见表1)，以转基因阳性单株dna为模板扩增靶位点序列，50μl扩增体系如下：2×taqmastermix25μl，ospil15-test-f2μl，ospil15-test-r2μl，dna模板1μg，加ddh2o至50μl；pcr条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，终延伸72℃10min，其中变性，退火和延伸为35个循环。将一部分扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图2-a所示，野生型扩增片段大小为673bp，单株1、2、23和24均扩增出片段明显小于野生型的条带，初步表明这4个单株可能发生较大片段缺失，其中单株1和24的pcr产物出现两条带，只有其中一条带明显小于野生型条带，因此二者可能只有一条同源染色体有较大片段缺失；单株2和23的pcr产物只有一条带且明显小于673bp，可初步判断二者两条同源染色体都发生较大片段缺失。将一部分扩增产物使用sacⅰ限制性内切酶进行酶切，20μl体系如下：pcr产物1μg，10×lbuffer2μl，sacⅰ1u(1μl)，加ddh2o至20μl，37℃酶切过夜。使用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，若pcr产物能被完全切开，仅得到400bp和273bp的两条带，表明靶位点未发生突变，为未突变单株；否则为突变植株。若pcr产物被部分切开，得到三条带，其中两条为400bp和273bp，另一条带在673bp附近，则表明一条同源染色体突变，为杂合体；若pcr产物完全不能切开，表明两条同源染色体均发生突变，则可能为两个等位基因发生不同突变的双等位突变体或两个等位基因发生相同突变的纯合体。检测结果如图2-b所示，结果表明单株4、5、6、7、10、12、15、16、18和25未发生突变；单株8、9、11和17的pcr产物被部分酶切，形成三条带，为一条同源染色体突变的杂合体；单株1、2、3、13、14、19、20、21、22、23和24的pcr产物完全不能切开，则可能为双等位突变或纯合突变体。将突变单株1、2、3、8、9、11、13、14、17、19、20、21、22、23和24的pcr产物送出测序，测序结果与野生型序列比对分析突变株基因型。综合分析测序结果得到株系突变情况，如图3所示，共得到5株纯合突变(单株2、3、13、14和23)、6株双等位突变(单株1、19、20、21、22和24)和4株杂合突变体(单株8、9、11和17)，包含10种不同突变基因型。实施例4t1代ospil15纯合突变体籽粒表型分析水稻光敏色素互作因子ospil15氨基酸序列如seqidno.1所示，该蛋白编码序列如seqidno.2所示。将实施例3中获得t0代突变体经1代自交后选择得到t1代ospil15纯合突变体，选取突变株系1、21和22进行籽粒表型分析。突变体ospil15-1中，突变的水稻光敏色素互作因子ospil15的编码序列如seqidno.3所示；突变的水稻光敏色素互作因子ospil15氨基酸序列如seqidno.4所示。突变体ospil15-21中，突变的水稻光敏色素互作因子ospil15的编码序列如seqidno.5所示；突变的水稻光敏色素互作因子ospil15氨基酸序列如seqidno.6所示。突变体ospil15-22中，突变的水稻光敏色素互作因子ospil15的编码序列如seqidno.7所示；突变的水稻光敏色素互作因子ospil15氨基酸序列如seqidno.8所示。选取上述三个纯合突变株系，随机选取30粒成熟收获后的籽粒，使用大米外观品质检测仪(jmwt12，东孚久恒，北京)对籽粒粒长进行测定，5次重复取平均值。结果如图4和图5所示，三组ospil15突变体籽粒粒长极显著增加，其中突变体ospil15-22增加最高，增幅达5.69％，增幅最小的突变体ospil15-21也达3.88％。以上对本发明的具体实施例进行了描述，但本发明的实施方式不受上述特定实施例的限制。本领域技术人员在权利要求的范围内做所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。表1引物序列表引物名称引物序列(5'-3')sgrna-fggcggacttcttctccgagctccsgrna-raaacggagctcggagaagaagtcpbun411-vfccatgaagcctttcaggacatgtapbun411-vracgctgcaaacatgagacggagaabar-faagcacggtcaacttccgtabar-rgaagtccagctgccagaaacospil15-test-ftgttttgtgtgtgcaggtccospil15-test-rcgggagaagagcgagaagtt<110>河南农业大学<120>一种基于crispr/cas9技术制备水稻ospil15突变体的方法及应用<160>18<170>patentinversion3.5<211>637<212>prt<213>序列<221>水稻光敏色素互作因子ospil15氨基酸序列<400>1metseraspglyasnaspphealagluleuleutrpgluasngly151015glnalavalvalhisglyarglyslyshisproglnproalaphe202530propropheglyphepheglyglythrglyglyglyglyglygly354045serserserargalaglngluargglnproglyglyileaspala505560phealalysvalglyglyglypheglyalaleuglymetalapro657075alavalhisaspphealaserglypheglyalathrthrglnasp808590asnglyaspaspaspthrvalprotrpilehistyrproileile95100105aspaspgluaspalaalaalaproalaalaleualaalaalaasp110115120tyrglyseraspphephesergluleuglnalaalaalaalaala125130135alaalaalaalaalaproprothraspleualaserleuproala140145150serasnhisasnglyalathrasnasnargasnalaprovalala155160165thrthrthrthrarggluproserlysgluserhisglyglyleu170175180servalprothrthrargalagluproglnproglnproglnleu185190195alaalaalalysleuproargserserglyserglyglyglyglu200205210glyvalmetasnpheserleupheserargproalavalleuala215220225argalathrleugluseralaglnargthrglnglythraspasn230235240lysalaserasnvalthralaserasnargvalgluserthrval245250255valglnthralaserglyproargseralaproalaphealaasp260265270glnargalaalaalatrpproproglnprolysglumetprophe275280285alaserthralaalaalaprometalaproalavalasnleuhis290295300hisglumetglyargaspargalaglyargthrmetprovalhis305310315lysthrglualaarglysalaproglualathrvalalathrser320325330servalcysserglyasnglyalaglyseraspgluleutrparg335340345glnglnlysarglyscysglnalaglnalaglucysseralaser350355360glnaspaspaspleuaspaspgluproglyvalleuarglysser365370375glythrargserthrlysargserargthralagluvalhisasn380385390leusergluargargargargaspargileasnglulysmetarg395400405alaleuglngluleuileproasncysasnlysileasplysala410415420sermetleuaspglualaileglutyrleulysthrleuglnleu425430435glnvalglnmetmetsermetglythrglyleucysilepropro440445450metleuleuprothralametglnhisleuglnilepropromet455460465alahispheprohisleuglymetglyleuglytyrglymet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