一种磷脂酶D的基因挖掘及其应用方法与流程

本发明提供了一种基于数据库基因挖掘方法获得的磷脂酶d及其应用方法，属于工业生物
技术领域：
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背景技术：
：磷脂酶d(pld)是一类催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的酶的总称，主要底物是磷脂酰胆碱(pc)，pld可以将pc水解生成磷脂酸(pa)和胆碱，而利用其转磷脂酰活力可制备许多功能良好的稀有磷脂和磷脂衍生物，在食品、医药及保健品领域应用广泛。磷脂酶d来源广泛，最早报道其来源于白菜叶中，随后在其他动、植物及微生物中发现，酵母、细菌中等克隆获得pld也有相关报道。植物中磷脂酶d主要存在于种子、根和叶中；动物来源主要分布在脑、肝脏中。与其他来源的磷脂酶d相比，微生物磷脂酶d具有较强的底物耐受性，较宽的底物专一性和较高的碱基交换反应催化活性，更适合于工业应用。至今已报导的产磷脂酶d的微生物主要有链霉菌、棒状杆菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌以及假单孢菌等。其中，磷脂酶d在链霉菌中分布最为广泛，报导也最多。国外对pld的研究一直处于领先水平，国外成功筛选并利用基因重组等方法改造出高产pld的生物菌株，利于工业生产，少数酶制剂公司已开发出具有较高酶活力的pld，国内对微生物发酵产pld的研究起步较晚，酶活较低，目前主要依赖进口，但价格非常昂贵。研究具有自主知识产权的pld酶制剂具有现实意义，菌株筛选是其中的一个重要环节。磷脂酰丝氨酸(ps)是磷脂的一种，天然含量较少，但它是大脑中主要的酸性磷脂，能控制和调节细胞膜关键蛋白的功能状态。ps占细胞膜双分子层磷脂的10％-20％，对中枢神经作用显著，能提高脑细胞的活力，改善大脑功能、修复大脑损伤，成为“脑专一性营养物质”，逐渐引起人们广泛关注。磷脂酰丝氨酸制备方法主要包括提取法，化学合成法和生物酶转化法。提取法主要指从植物细胞、动物的大脑和内脏中直接提取磷脂酰丝氨酸。相关研究显示植物组织中磷脂酰丝氨酸的含量非常少，提取法主要以动物组织如大脑和内脏等为主。提取法利用有机溶剂进行萃取，操作简单，但是纯度和产率低，污染大，且由于疯牛病的原因，提取的ps还有一定的安全性问题；化学合成法主要指通过以甘油为主要原料经过一系列化学反应合成ps，此方法得到的产品纯度高，安全性好，但是合成步骤繁琐且副产物较多。近年来，生物酶转化法逐渐受到大家的重视。酶转化法是指在磷脂酶d的催化作用下，底物卵磷脂和丝氨酸进行转酰基反应，生成磷脂酰丝氨酸。该方法具有条件温和，生产成本低，副产物少，低碳环保，产率高等优点，是制备大量磷脂酰丝氨酸的理想方法。虽然，国内外报道了酶催化合成磷脂酰丝氨酸的方法，但是大多为野生菌，发酵时间长，且对酶的性质不够了解，从而影响了酶催化合成磷脂酰丝氨酸的效率，因此磷脂酶d基因的克隆表达及其在大肠杆菌中的高效表达，对其实际应用及作用机理研究显得非常重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于基因挖掘获得的磷脂酶d及其基因编码序列与应用方法。提供包括本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，以及利用该重组菌株表达生产磷脂酶d的方法。通过数据库基因挖掘技术筛选获得磷脂酶d基因。以具有较高转磷脂酰活力磷脂酶d的氨基酸序列为模板，在ncbi数据库中进行blast比对分析，根据设定的筛选标准，获得目的磷脂酶d基因，根据基因序列设计引物通过pcr技术扩增获得编码基因序列，电泳鉴定后回收纯化pcr产物并克隆至pmd19-t载体构建重组质粒，将重组质粒转化至e.colijm109，挑取多个阳性转化子至lb液体培养基中(ampr)37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行双酶切、pcr验证。将验证正确的重组质粒经bamhi和hindiii双酶切后与经同样双酶切的载体质粒进行连接，选择的载体质粒包括pet系列，pma5，pwb系列，ppiczα，pic9k，pdw系列等。连接产物转化至宿主菌大肠感受态细胞中，但不局限于大肠杆菌，还包括丝状真菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，钝齿棒杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母等，经培养后实现磷脂酶d的高效表达。(1)数据库基因挖掘技术筛选磷脂酶d基因根据已报道磷脂酶d外源表达文献，选择转磷脂酰活力较高的磷脂酶d的氨基酸序列作为模板，在ncbi数据库中blast，根据设定的筛选标准获得一系列磷脂酶d氨基酸序列，再通过构建进化树分析筛选获得目的磷脂酶d的氨基酸序列，从而得到其编码基因序列。(2)pcr扩增磷脂酶d基因以经合成的核苷酸序列设计引物(p1、p2)，通过pcr扩增磷脂酶d的编码基因：引物p1：5’-cgggatccatgctgcgtcgcctgcat引物p2：5’-cccaagcttttacagactacacacaccpcr扩增反应在50μl体系中进行，反应体系中加入25μlextaq(premix)，20μlddh2o，2μl模板dna，上下游引物各1.5μl。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。pcr产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至pmd19-t载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至e.colijm109，挑取多个阳性转化子至lb液体培养基中(ampr)37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行双酶切、pcr验证，验证正确的进行序列测定。(3)重组表达质粒的构建本研究以pet-28a(+)为例开展重组表达质粒的构建，该质粒带有t7启动子和6×his-tag标签，将pet-28a(+)质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用bamhi和hindiii进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用t4dna连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至e.colijm109感受态细胞中，涂布在含卡那霉素抗性(50mg/ml)的lb固体培养中培养8～10h，挑取多个阳性转化子至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液体培养基中培养，在37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒并命名为pet-28a(+)-pld。(4)重组表达菌株的构建与筛选本研究以大肠杆菌为例，研究将重组质粒pet-28a(+)-pld经42℃热击90s转化至大肠杆菌宿主e.colibl21(de3)感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素(50mg/ml)的lb固体培养基上培养8～10h，通过pcr验证筛选阳性转化子e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld，接种至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液体培养基中培养过夜。次日按1％接种量接种于含卡那霉素(50mg/ml)的50ml新鲜lb液体培养基中，37℃培养约3h，od600为1.0时加入iptg进行诱导，使其终浓度为0.5mm，25℃诱导12h后，重组菌表现出磷脂酶d活性。(5)重组磷脂酶d的westernblot分析将上述获得的重组菌发酵液在4℃，8,000rpm条件下离心20min，去掉上清收集菌体沉淀，菌体用5mltris-hcl(ph7.5)缓冲液清洗一遍去除杂质，8,000rpm离心10min，再次去掉上清收集菌体沉淀，用5mltris-hcl(ph7.5)缓冲液悬浮，制备成菌悬液。将菌悬液在置于冰水浴中利用细胞超声破碎仪进行超声破碎，条件为：200w功率下工作200个循环，每个循环工作4s停6s。破碎完全后在4℃，12,000rpm条件下离心20min，所得上清即为粗酶液。通过bca蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶后，取80μl样品加入20μl5xloadingbuffer，充分混匀后于沸水浴中放置5min使蛋白变性。根据测定蛋白的浓度进行上样，并加入marker。上层浓缩胶用80v电压，当样品至分离胶时(约30min)，用100v电压，当样品至分离胶底部约1cm处关闭电源，电泳结束。结束后用蒸馏水冲洗干净，在电流作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。转移完毕后进行封闭，孵育一抗和二抗，最后进行显色拍照以确认目的蛋白的表达情况。(6)重组磷脂酶d的酶学性质研究a.重组磷脂酶d最适ph及ph稳定性研究取适量酶液，分别在40mmph4.0-6.0的乙酸钠缓冲液，ph6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，ph8.0-10的tris-hcl缓冲液中(ph间隔0.5单位)进行反应，测定不同ph下的酶活力，以最大酶活为100％，以确定该酶的最适作用ph。另取新鲜酶液分别在40mmph4.0-6.0的乙酸钠缓冲液，ph6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，ph8.0-10的tris-hcl缓冲液中(ph间隔0.5单位)放置60min，回调至ph8.0后，再按照标准测定酶活的方式测定残余酶活，以确定该酶的ph稳定性，以未经处理的酶液作为100％。b.重组磷脂酶d最适温度及温度稳定性研究取适量酶液，分别在20℃至80℃范围内选择温度点(间隔5℃)，测定其在不同温度下的酶活力，以最大酶活为100％，以确定该酶的最适作用温度。另取新的酶液，分别保温于上述不同温度中60min后立即冷却，按照标准测定酶活的方式测定残存酶活，以确定该酶的温度稳定性，以未经处理的酶液作为100％。c.金属离子对重组磷脂酶d酶活的影响取kcl、mgcl2、bacl2、cacl2、cocl2、nacl、cucl2、mncl2、licl、fecl3、fecl2、agno3、znso4、al2(so4)3等配制成50mm母液，在适当稀释的酶液中分别加入配好的母液，终浓度为5mm。37℃保温30min后，按照酶活测定方法测定残余酶活，以未添加金属离子的酶液活力作为100％。d.蛋白抑制剂对重组磷脂酶d酶活的影响取蛋白抑制剂：β-巯基乙醇、dtt、pmsf、edta、sds等配制成50mm母液，在适当稀释的酶液中分别加入配好的母液，终浓度为5mm。37℃保温30min后，按照酶活测定方法测定残余酶活，以未处理的酶液活力为100％。(7)重组磷脂酶d在催化合成磷脂酰丝氨酸中的应用利用重组磷脂酶的催化合成磷脂酰丝氨酸的反应体系包括有机相和水相两部分，有机相：8ml溶有10mg/mlpc60的乙酸乙酯；水相：4ml溶有30mg/mll-丝氨酸、15mmcacl2的粗酶液，将有机相和水相充分混合均匀后于40℃，180rpm条件下反应10h。通过hplc检测产物中的磷脂酰丝氨酸的合成。本发明的优点和有益效果本发明提供了一种磷脂酶d基因及其高效表达，它具有seqidno:1所示的核苷酸序列和seqidno：2所示的氨基酸序列，全长1,614bp，编码538个氨基酸，以质粒pet28a(+)为表达载体，以大肠杆菌e.colibl21(de3)为表达宿主，实现了磷脂酶d基因的高效表达，重组菌株e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld表现出磷脂酶d活性，能催化底物磷脂酰胆碱和l-丝氨酸合成磷脂酰丝氨酸，在食品、医药和保健行业具有较大的应用前景，且重组菌发酵周期短，适合于工业化大规模的生产。附图说明图1pcr扩增磷脂酶d编码基因核酸电泳图谱m：5,000bpdnamarker；泳道1：扩增得到的磷脂酶d基因。图2重组磷脂酶d的westernblot分析m：标准蛋白分子量；图示smpld为目的蛋白磷脂酶d。图3磷脂酶d的最适ph及ph稳定性图4磷脂酶d的最适温度及温度稳定性图5磷脂酶d催化合成磷脂酰丝氨酸的hplc检测结果a：ps标样；b：ps样品。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受这些实施例的限制。实施例1本实例说明基于数据库基因挖掘技术筛选磷脂酶d的方法。根据已报道磷脂酶d外源表达文献，选择经实验验证过的转磷脂酰活力较高的磷脂酶d的氨基酸序列作为模板，在ncbi数据库中进行blast，根据已设定的筛选标准进行筛选，获得一系列磷脂酶d氨基酸序列，再通过构建进化树分析筛选获得目的磷脂酶d的氨基酸序列，从而得到其编码基因序列。实施例2本实施例说明磷脂酶d编码基因的克隆方法。以经合成的核苷酸序列设计引物(p1、p2)，通过pcr扩增磷脂酶d的编码基因：引物p1：5’-cgggatccatgctgcgtcgcctgcat引物p2：5’-cccaagcttttacagactacacacaccpcr扩增反应在50μl体系中进行，反应体系中加入25μlextaq(premix)，20μlddh2o，2μl模板dna，上下游引物各1.5μl。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。pcr产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至pmd19-t载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至e.colijm109，挑取多个阳性转化子至lb液体培养基中(ampr)37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行双酶切、pcr验证，验证正确的进行序列测定。核酸电泳结果显示磷脂酶d基因序列得到有效扩增(图1)。实施例3本实施例以pet-28a(+)为例说明重组表达质粒的构建过程。pet-28a(+)带有t7启动子和6×his-tag标签，将pet-28a(+)质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用bamhi和hindiii进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用t4dna连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至e.colijm109感受态细胞中，涂布在含卡那霉素抗性(50mg/ml)的lb固体培养中培养8～10h，挑取多个阳性转化子至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液体培养基中培养，在37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒并命名为pet-28a(+)-pld。实施例4本实施例以大肠杆菌为例说明重组表达菌株的构建与筛选方法。将重组质粒pet-28a(+)-pld经42℃热击90s转化至大肠杆菌宿主e.colibl21(de3)感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素(50mg/ml)的lb固体培养基上培养8～10h，通过pcr验证筛选阳性转化子e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld，接种至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液体培养基中培养过夜。次日按1％接种量接种于含卡那霉素(50mg/ml)的50ml新鲜lb液体培养基中，37℃培养约3h，od600为1.0时加入iptg进行诱导，使其终浓度为0.5mm，25℃诱导12h后，重组菌表现出磷脂酶d活性。实施例5本实施例说明磷脂酶d的westernblot分析过程。将上述获得的重组菌发酵液在4℃，8,000rpm条件下离心20min，去掉上清收集菌体沉淀，菌体用5mltris-hcl(ph7.5)缓冲液清洗一遍去除杂质，8,000rpm离心10min，再次去掉上清收集菌体沉淀，用5mltris-hcl(ph7.5)缓冲液悬浮，制备成菌悬液。将菌悬液在置于冰水浴中利用细胞超声破碎仪进行超声破碎，条件为：200w功率下工作200个循环，每个循环工作4s停6s。破碎完全后在4℃，12,000rpm条件下离心20min，所得上清即为粗酶液。通过bca蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶后，取80μl样品加入20μl5xloadingbuffer，充分混匀后于沸水浴中放置5min使蛋白变性。根据测定蛋白的浓度进行上样，并加入marker。上层浓缩胶用80v电压，当样品至分离胶时(约30min)，用100v电压，当样品至分离胶底部约1cm处关闭电源，电泳结束。结束后用蒸馏水冲洗干净，在电流作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。转移完毕后进行封闭，孵育一抗和二抗，最后进行显色拍照以确认目的蛋白的表达情况，结果显示磷脂酶d能够清晰表达，且分子量大小约为60kda(图2)。实施例6本实施例说明磷脂酶d的催化特征。(1)分别在40mmph4.0-6.0的乙酸钠缓冲液，ph6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，ph8.0-10的tris-hcl缓冲液中(ph间隔0.5单位)进行反应，测定不同ph下的酶活力，该酶的最适反应ph为7.5，在ph6.5～8.5范围内能达到最高酶活的75％～100％。另取新鲜酶液分别在上述缓冲液中放置60min，回调至ph8.0后，按照标准测定酶活的方式测定残存酶活，该重组磷脂酶d在ph6.5～8.5的条件下表较稳定，可以保持70％左右的相对酶活(图3)。(2)取适量酶液，分别在20℃至80℃范围内选择温度点(间隔5℃)，测定其在不同温度下的酶活力，该酶的最适反应温度为60℃。另取新鲜酶液分别保温于上述不同温度中60min后立即冷却，按照标准测定酶活的方式测定残存酶活，该酶在20～55℃条件下酶活相对稳定，可以维持65％以上的相对酶活(图4)。(3)取kcl、mgcl2、bacl2、cacl2、cocl2、nacl、cucl2、mncl2、licl、fecl3、fecl2、agno3、znso4、al2(so4)3等配制成50mm母液，在适当稀释的酶液中分别加入配好的母液，终浓度为5mm。37℃保温30min后，按照酶活测定方法测定残余酶活，结果如表1所示，与未添加任何金属离子的空白对照组相比，na+、mn2+和mg2+并未表现出明显促进作用；ba2+，co2+和ca2+对酶活有着明显的促进作用，其中ca2+促进作用最明显，相对酶活达到134.1％；另外，k+、cu2+、li+、fe3+、al3+和zn2+有着较小的促进作用；而fe2+和ag+对磷脂酶d酶活有着明显的抑制作用。表1金属离子对酶活的影响试剂相对酶活(％)试剂相对酶活(％)对照组100±0.6mn2+101.7±1.5k+105.2±1.5li+107.6±0.8mg2+101.1±0.3fe3+105.9±2.1ba2+118.2±1.5fe2+56.0±2.2ca2+134.1±0.2ag+27.0±1.2co2+117.8±1.8zn2+109.7±0.6na+101.5±1.2al3+109.3±2.4cu2+108.2±0.6(4)取蛋白抑制剂：β-巯基乙醇、dtt、pmsf、edta、sds等配制成50mm母液，在适当稀释的酶液中分别加入配好的母液，终浓度为5mm。37℃保温30min后，按照酶活测定方法测定残余酶活，结果如表2所示，2-me、dtt、sds和pmsf对磷脂酶d有着一定的抑制作用，而edta对该酶表现出较强的抑制作用。表2蛋白抑制剂对酶活的影响试剂浓度(mm)相对酶活(％)none0100±0.32-me575±0.9dtt580±1.1sds550±2.1pmsf540±0.3edta56±0.6实施例7本实施例说明重组磷脂酶d进行磷脂酰丝氨酸合成试验。称取80mgpc60溶解于8ml乙酸乙酯中，称取120mgl-丝氨酸和6.66mgcacl2溶解于4ml磷脂酶d粗酶液中，将有机相和水相充分混合均匀后于40℃，180rpm条件下反应10h。结果如图5所示，在重组磷脂酶d催化作用下，在14.2min可以看到有磷脂酰丝氨酸生成，经计算磷脂酰丝氨酸的产量为0.2g/l，而在空白对照组中并没有看到有磷脂酰丝氨酸的生成，说明该重组磷脂酶d具有催化底物磷脂酰胆碱和l-丝氨酸合成磷脂酰丝氨酸的能力，在食品、医药和保健行业具有较大的应用前景，且重组菌发酵周期短，适合于工业化大规模的生产。本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。seqidno：1seqdnaman1:1614bp;composition347a;435c;484g;348t;0otherpercentage:21.5%a;27.0%c;30.0%g;21.6%t;0.0%othermolecularweight(kda):ssdna:499.35dsdna:995.14origin1ctgctgcgtcgcctgcatcgtctgacccgtcgcgcaacggtgtccgcagttctgctggca61ctgctgccggcaggtccggctctggcagcaggtgacgcaccgggtgccccgcacctggat121gcggttgaacgtaccctgcgtcaggtctcaccgggtctggaaggtgacgtttggcaacgt181acggagggtaacaaactggatgccagcgcagctgacccgtctgattggctgctgcagacc241ccgggttgctggggtgatgcacattgtgctgaacgtccgggcaccaaacgcctgctggct301aaaatgacggaaaatatttctcgcgcacgtcgcaccgtggatatcagtacgctggcgccg361tttccggacggtgctttccaggatgcgattgcggccggcctgaaagcgagtgttgcctcc421ggtaacaaaccgcgtgtgcgtgttctggtcggcgcagctccgctgtatcacctgaatgtg481cgtccgagcgcctacctggatgacctgcgtgcacgtctgggtaccgcagcagatgcagtt541acgctgaacgtcgcatctatgaccacgagtaaaaccgcgttttcctggaatcattcaaaa601ctgctggttgtggacggcgaaagcgccattacgggcggtatcaacgattggaaaaatgac661tatgttgataccgcacacccggtcacggatgtggacctggcactgaccggtccggcagct721tcgacggcaggtcgctatctggataccctgtggggctggacgtgcggcaacaaaggtaat781atcgcgagcgtgtggtacgcagcatcggcaggtgcaagctgtatggccgatctggaaaaa841gaagccaacccgaaaccggcaggtccgaccggtaatgtgccggttattgcggtgggcggt901ctgggcgttggtatcaaagataaagacgcaagctctgcttatcgtccggaactgccgtct961gcaccggacaccaaatgcgtcgtgggcctgcatgataacaccaatgccgatcgtgactac1021gatacggtgaacccggaagaatcagcactgcgtgccctggtgggttcggcagaaaaacat1081gttgaaattagccagcaagatctgcacgctacctgtccgccgatcgcgaaatatgacgtt1141cgcctgtacgatacgctggcgaagaaaattgcatccggtgtcaaagtgcgtatcgttgtc1201tcagatccggcaaaccgtggtaccgtgggttctggcggttatagtcagattaaatccctg1261acggaaatctctgacgtcctgcgtaatcgtctggcactggtgaccggcggtcaggatcaa1321gcaaaaaacgctctgtgcagtaatgtgcagctggcttcattccgctcggcaaaaagcccg1381acctgggctgacggtcacgcatatccgctgcatcacaaactggtttcagtcgatggctcg1441gcgttttatgttggtagtaaaaatctgtacccgtcctggctgcaggacttcggctacatt1501gtcgaagatcgtaccgcagctggtcaactggatgccaaactgctggcaccggaatgggaa1561tatgctcaggacaccgcgatcgtcgattaccaacgcggtgtgtgtagtctgtaaseqidno：2universalcodetotalaminoacidnumbe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