活性的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及磷脂酶A2活性的检测，具体而言是一种检测磷脂酶A2活性的囊泡及其制备方法和应用该囊泡的荧光探针检测磷脂酶A2活性的方法。
【背景技术】
[0002]磷脂广泛存在于自然界所有动植物机体中，是生物膜的主要组成部分。而对磷脂的代谢过程研究，例如磷脂酶的水解，在生物化学领域中有着重要作用。
[0003]磷脂酶A2(PLA2)是一类催化磷脂二位酰基(Sn2)水解的酶族，其广泛存在于细菌、植物、哺乳动物的组织、细胞和分泌物中，具有产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建、肺泡表面活性物质代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进血液凝固等作用。研究证明，磷脂酶A2在肺脏、心血管、胃肠道、皮肤、骨骼等系统的急、慢性炎症性疾病中，磷脂酶A2活性均有增高并介导一系列病理生理过程。因此，磷脂酶A2活性的检测可作为早期预报病理进程及诊断性指标。
[0004]目前，磷脂酶A2活性的检测法主要有:滴定法、放射标记法、分光光度法以及荧光分析法。滴定法是保持体系PH值稳定条件下，采用碱滴定磷脂酶A2水解卵磷脂生成的自由脂肪酸浓度，通过消耗的碱的量来确定磷脂酶A2的活性。作为滴定标准液的碱可用溶有咪唑.502和I2的甘油-甲酯，这是一种连续检测方法，它可以探测自然底物卵磷脂的水解。放射性检测需要合成被放射性元素标记的卵磷脂，这些卵磷脂都可以买到，但通常十分昂贵，且灵敏度依赖于标记底物的特定的放射性。分光光度法与荧光分析法使用最为广泛，通常选择体系灵敏的探针或标记物，对其光谱性质进行检测。
[0005]上述各方法均存在不同的问题:滴定法灵敏度不高；放射标记法灵敏度非常高，但是需要有放射性元素标志的磷脂，通常十分昂贵；分光光度法与荧光分析法使用最为广泛，但是通常情况下使用的标记物、探针比较昂贵或者灵敏度不够。
[0006]因此，我们需要一种新的磷脂酶A2活性的检测法，灵敏度高且易于操作又经济实惠。
【发明内容】
[0007]为解决现有技术的不足，本发明提出一种检测磷脂酶A2活性的囊泡及其制备方法和应用该囊泡中的荧光探针检测磷脂酶A2活性的方法。
[0008]为实现上述目的，所采取的技术方案是:一种检测磷脂酶A2活性的囊泡，具有由卵磷脂和胆固醇分子构成的双分子层，在所述双分子层中包封有荧光探针分子。
[0009]在本发明一实施例中，所述荧光探针为1-萘酚。
[0010]在本发明一实施例中，所述卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1。
[0011]本发明还提供一种上述检测磷脂酶A2活性的囊泡的制备方法，所述方法是将卵磷月旨、胆固醇按质量比溶解于氯仿-甲醇的混合液中，40°C恒温旋转蒸发，使溶剂完全蒸发；然后加入溶解有1-萘酚的TriS-HCl缓冲液，使总脂浓度为3%，然后搅拌使膜脱落，60°C孵化0.5?1.5小时。
[0012]在本发明一实施例中，所述卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，所述氯仿-甲醇的混合液中，氯仿、甲醇的体积比为2:1。
[0013]在本发明一实施例中，所述Tris-HCl缓冲液中1_萘酚的浓度为4 μ mol/L。
[0014]在本发明一较优实施例中，提供一种上述检测磷脂酶A2活性的囊泡的制备方法，所述方法是将卵磷脂、胆固醇按质量比为3:1溶解于氯仿-甲醇的混合液中，40°C恒温旋转蒸发，使溶剂完全蒸发；然后加入溶解有1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度为3%，然后搅拌使膜脱落，60°C孵化0.5?1.5小时。
[0015]本发明还提供一种检测磷脂酶A2活性的方法，所述方法是将待测样品滴加入上述囊泡的溶液中，将其荧光光谱在360nm处归一化，获得450nm处荧光强度或荧光寿命，在归一化后450nm荧光强度与磷脂酶A2活性标准曲线或者450nm荧光寿命与磷脂酶A2活性标准曲线中读取相应的酶活性度数即可。
[0016]在本发明一实施例中，所述的归一化后450nm荧光强度与磷脂酶A2活性标准曲线为yi=-8.93+9.27Xl，其中，Xl为归一化后450nm处荧光强度，yi为磷脂酶A2活性；所述的归一化后450nm荧光寿命与磷脂酶A2活性标准曲线为y2=_34.84+2.178?，其中，X2为归一化后450nm处荧光寿命，y2为磷脂酶A2活性。
[0017]在本发明中，采用荧光稳态光谱，在特定波长下测定荧光探针在不同条件下的荧光寿命。选择1-萘酚作为银光探针是因为:萘酚分子最令人关注的特点之一就是该分子在电子激发态时有很高的一个质子从OH基转移到分子周围的其他溶剂分子的几率，而在电子基态时这种转移的几率却很低，因而萘酚分子成为研究质子转移机理及其应用方面典型的分子。1-萘酚的两个发光状态分别是中性状态(NpOH*)与阴离子状态(NpO—*)。在水相时，萘酚的主要存在形式为阴离子状态的NpO+* ( λ激发=290nm，λ发射=450nm)，而没有被水解的NpOH * ( λ激发=290nm, λ发射=365nm)则被淬灭不发光。在疏水相，介质接受质子能力弱，激发单线态NpOH *不离解，只能观察到NpOH *的荧光。在囊泡体系中，由于对探针的包埋作用，则既可看到萘酚分子型体的受激发光，也能观察到离子型体所发的光。
[0018]在本发明中，囊泡中的磷脂在磷脂酶A2的水解作用下，一方面囊泡结构被破坏，导致包埋在内水相中的萘酚分子部分释放到水相之中，增加了离子态的比例及荧光强度；一方面水解产物自由脂肪酸导致了溶液偏酸性，分子态的NpOH *更易被酸式离解。这两方面原因都将导致450nm处的突光增强。因此450nm处的归一化强度与寿命两方面都可以对磷脂酶A2的反应速率进行表征，进而计算磷脂酶活性。
[0019]与现有技术相比，由于1-萘酚分子比较常见，且自身的化学性质非常适合表征酶催化反应，因而克服了常用的荧光探针价格昂贵的技术缺陷；同时本发明的检测非常灵敏，结果也准确。本发明提供了一种荧光的、可连续的酶催化动力学的测定法，它可以随着时间测定反应底物的水解进程。本发明使用的探针分子简单且价格便宜，其特殊的性质非常适合与磷脂参与的囊泡类型的底物结构和酶催化反应的测定。同时，本发明的检测方法稳态光谱、寿命与酶活性相关性良好，两种方法所得结果比较匹配。
【附图说明】
[0020]图1是归一化后450nm荧光强度与酶活性标准曲线；
图2是归一化后450nm荧光寿命与酶活性标准曲线；
图3是实施例一的荧光光谱图；
图4是无离子、Ca2+离子和Zn2+离子状态下的荧光衰减图；
图5是应用实施例一的荧光光谱图；
图6是应用实施例二的荧光光谱图；
图7是以荧光强度和荧光寿命两种方法获得的磷脂酶A2活性的对比图。
【具体实施方式】
[0021]以下结合实施例对本发明做详细的说明，实施例旨在解释而非限定本发明的技术方案。
[0022]实施例1标准曲线的绘制
将精确称取计算好重量的卵磷脂、胆固醇以3:1的质量比混合溶于氯仿-甲醇的混合溶液(所述氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后用旋转蒸发仪在40°C恒温水浴中旋转蒸发。等溶剂完全蒸发后，取出并放入真空干燥器中抽