一种磷脂酶c的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶脱胶领域，具体的，涉及一种磯脂酶C。
【背景技术】
[0002] 催化水解磯脂的酶都可W称为磯脂酶，它们广泛分布与自然界中，发挥了多种多 样的功能，从蛇毒的毒性（Janssen et al. 1999)到信号传导（Singer et al. 1997)到人 类消化，都是磯脂酶参与的生物学特性和过程值e Maria et al. 2007)。虽然磯脂酶的底 物都是磯脂，但是它们可W作用于磯脂分子上的不同位点，根据水解位点不同，磯脂酶被 分为五种；phospholipase Al(PLAl),地OS地olipase A2(PLA2),地OS地olipase B(PLB), phospholipase C任LC)和地os地olipase D(PLD)。比如，PLAl和PLA2可分别水解甘油 基sn-1，sn-2位置上的脂肪酸醜基醋键。PLA1和化A2可W相应的催化产生游离脂肪酸和 2-ac}dlyso地OS地olipid或者l-ac}d lysophospholipid。溶血磯脂上的脂肪酸再继续被 phospholipase B(PLB)水解而游离出来。PLC被定义为一种磯酸二醋酶，可W水解甘油磯酸 键，产生甘二醋。PLD可作用于磯脂产生磯脂酸（Ramra化iani and化and2011)。磯脂酶是一 类很重要的可水解磯脂的酶，因为水解位置不同，可释放出多种不同的底物，比如溶血磯脂 (lysophospholipids),游离脂肪酸（free fatty acids, FFAs),甘二醋（dia巧Iglycerols, DGs)，磯酸胆碱（choline地os地ate)和磯脂酸盐（phosphatidates)。现今，磯脂酶已经被 应用于面包制造，蛋黄工业和植物油脱胶（Clausen2001)。
[0003] 磯脂广泛存在于所有的生物体内，它们和糖脂、胆固醇一起，是生物膜结构的 重要组成部分值e Maria et al.2007)。磯脂主要在H个方面发挥了重要的作用；保 持了生物膜结构的完整性（White et al.2001)，参与了许多代谢有关和神经系统的 疾病（Leel998)，W及作为信号物质调控了许多生物过程（Hannun et al.2001)。磯 脂分子通常由非极性的二醜基部分和极性的含磯部分组成，醜基部分的特性和含磯部 分的构成决定了该个磯脂的分类，特点W及生物学功能。植物油中的磯脂主要包括 phosphatidylcholine (lecithin, PC,磯月旨酉先胆碱），phosphatidylethanolamine 牌， 磯脂醜己醇胺），地OS地atid}dinositol (PI,磯脂醜肌醇），地OS地atidic acid(PA, 磯脂酸），地os地atid}dse;rine(PS，磯脂醜丝氨酸），地os地atid}dglyce;rol(PG， 磯脂醜甘油），di地os地atid}dglyce;rol值PG,二磯脂醜甘油）及N-ac}d phosphatidylethanolamine (NAPE,己醜基磯脂醜己醇胺）等。植物油中的磯脂包括水化磯 脂和非水化磯脂。水化磯脂和非水化磯脂的不同主要在于和磯脂酸的羟基相连的官能团不 同。水化磯脂包括PC、PE、PI，都含有极性较强的基团，例如胆碱、己醇胺、肌醇等，因此具有 比较强的亲水性。非水化磯脂包括具有非脂类性质的含磯物质，W酸的形式存在的磯脂酸 和聚磯脂酸，还包括溶血磯脂（Padley et al. 1994)。
[0004] 植物油，比如豆油，菜巧油，葵花巧油和玉米油，是一种重要的营养来源。从油料种 子中提取的毛油需要进一步提纯，W去除会影响油品稳定性，颜色和风味的杂质。磯脂是一 类主要的杂质，在传统精炼工艺中，需要W很高的成本进行脱胶来去除。油中的磯脂会导致 油品在后续脱色、氨化和脱莫的过程中颜色变深。此外，磯脂会降低精炼油的氧化稳定性并 抑制脱氨催化剂的表现。磯脂的总量和种类与油料种子的生长，储藏，处理条件和萃取方式 有关，一般来说，不超过毛油重量的3%。在传统精炼过程中，通过加水来脱除磯脂。磯脂由 DAG和一个极性磯酸醋组成，加水可引起磯酸醋的水化，将磯脂吸附于油水界面。水化的磯 脂可吸附中性油，因此形成了含有磯脂和中性油的乳状液或者胶。该种粘性的胶可通过离 也从油中分离，该个过程称为水化脱胶。但是该一步精炼的步骤会导致与杂质正比例相关 的TAG和DAG得率损失。磯脂的强乳化性质，会导致吸附油品，从而造成得率损失。另一部 分的得率损失来自于，离也后油胶界面上，油的不完全回收。残留在油中的磯脂，还会在接 下来的精炼步骤中导致进一步的得率损失。比如脱酸时，又产生乳状液。因此，传统的油脂 精炼中，主要的得率损失都是源于磯脂产生的乳状液，而该种损失是和磯脂的存在总量成 正比的。
[0005] 酶法脱胶，已经发展到工业化规模，对传统的水法脱胶是一种补充和替代。与化学 催化不同的是，酶是高度专一并且只作用于目标分子，而那些与目标分子相似的分子却不 会受到影响。许多商业化的用于酶法脱胶的酶，已经在市场上推出，大部分都是属于PLA。 PLA将磯脂杂质上的脂肪酸脱除，形成在少水环境中乳化效果差的溶血磯脂，来起到脱胶的 目的，但是该个过程中，产生的游离脂肪酸会残留在油中，需要在后期通过皂化来脱除，而 该一步又会产生乳化剂带来油损。
[000引而PLC只与油中的磯脂杂质反应，而并不攻击油体本身。PLC可将磯脂水解为水溶 性的磯酸基，W及油溶性的甘二醋，因此减少了磯脂杂质的乳化能力，也就降低了后续的油 损。与PLA不同的是，PLC不会产生额外的游离脂肪酸。值得指出的是，用PC-PLC脱胶，又 可W产生DAG，该对得率又是一个提高。而提高的DAG含量没有超出油品中DAG天然含量的 范围（10%)(Yas址awa and Katsuragi，2004)，并且不会影响油品质量的指标，例如烟点。
[0007] 现在已知的 PC-PLC,主要来源于 Bacillus sp.和 Pseudomonas sp.。
[0008] 根据对底物分子的特异性，PLC可分为phosphatidylinosito；L-specific phospholipase C(PI-PLC，EC numberS. 1.4. 11)和 phosphatidylcholine-specific phospholipase C(PC-PLC，EC numbers. 1.4. 3)。PI-PLC可特异性水解磯脂醜肌醇（PI),而 PC-PLC可水解磯脂醜胆碱（PC)和磯脂醜己醇胺（P巧。毛油中各个磯脂的含量并不是恒定 的，会因为物种来源、压棒或浸出工艺不同，而发生变化。W大豆油为例，PC含量为47%，PI 含量为24%，阳含量为20%，PA含量为9%。但现已成功商品化开发的化rifine值SM公司） 的工作抑范围为6-7,是一种中性PC-PLC，可水解PE和PC，但不能水解PI，因此无法实现 磯脂的完全去除。此外，在深度酶法脱胶中，要共同添加PC-PLC和PLA1来实现对磯的完全 脱除，PLA1的工作抑为4-5,因此当化rifine和PLA1混合使用时，无法找到一个合适的抑 范围，使两种酶同时W较高酶活工作。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种磯脂酶C，该磯脂酶C可水解磯脂醜胆碱和磯脂醜己醇胺，具有 于酸性抑区域或中性抑区域或碱性抑区域附近有效水解磯脂的能力，具有广泛的抑区 域的耐受性（PH4-11)，并且具有一定程度的热稳定性可大量节省在生产中对抑和温度调 节和调控花费的成本，在与PLA1联合使用是，该2种酶能同时W较高酶活工作。具有广泛 pH区域的耐受性，对于酶的发酵生产W及工业化应用都有很重要的意义。另外，该磯脂酶C 对锋离子敏感，不依赖锋发挥水解能力。本发明还提供了该磯脂酶C的融合蛋白，该融合蛋 白不仅能同时水解磯脂底物中的主要磯脂；磯脂醜己醇胺（P巧，磯脂醜肌醇（PI)和磯脂醜 胆碱（PC)，具有更广泛的水解底物特性，且其酶活比亲本酶混合液酶活高出20%。
[0010] 因此，本发明的一个目的在于，提供一种磯脂酶C。
[0011] 本发明提供的所述磯脂酶C选自；（1)氨基酸序列如SEQ ID N0:1或7所示的多 肤，或（2)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或7所示的多肤的保守性变体。
[0012] 在本发明的一个优选实施例中，所述的保守性变体是：将SEQ ID NO: 1或7氨基酸 序列经过一个或多个（如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个）氨基酸 残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO: 1或7所示的氨基酸序列相同功能 的多肤变体。
[0013] 在本发明的一个优选实施例中，所述磯脂酶C由SEQ ID N0:2或6所示多核巧酸 编码。
[0014] 本发明还有一个目的在于，提供一种分离的多核巧酸，所述多核巧酸编码所述的 磯脂酶C。较佳地，所述多核巧酸的核巧酸序列如SEQ ID N0:2或6所示。
[0015] 本发明还提供了一种包含前述多核巧酸的重组表达载体。
[0016] 本发明还提供了一种包含前述多核巧酸或重组表达载体的重组菌株。
[0017] 本发明还提供了一种生产磯脂酶C的方法。
[0018] 本发明提供的方法包括；培养本发明提供的重组菌株W表达所述磯脂酶C，收获 磯脂酶C。在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括破碎细胞来收集含有表达在胞内的 磯脂酶C上清液，由此获得含有磯脂酶C的磯脂酶C酶液。优选地，所述方法还包括对所述 磯脂酶C酶液进行浓缩或纯化。
[0019] 本发明还提供了一种生产磯脂酶C酶液的方法。本发明提供的方法包括；培养本 发明提供的重组菌株W表达所述磯脂酶C，分离和收集含有表达在胞内的磯脂酶C的上清 液，由此获得含有磯脂酶C的磯脂酶C酶液。