专利名称：磷脂酶、编码其的核酸以及制备和使用它们的方法
磷脂酶、编码其的核酸以及制备和使用它们的方法
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权利要求
1.分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)，所述核酸(多核苷酸)包含以下的核酸序列或由以下的核酸序列组成 (a)编码具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性的多肽，且 (i)与SEQ ID NO :5 具有至少约 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更多、或100%的序列同一性，并且编码多肽，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所述的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸取代或突变、或其任意组合， 以及任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性， 以及任选地，序列比对算法是BLAST 2. 2. 2版算法，其中过滤设置被设定为blastall-p blastp-d" nr pataa" -F F,且所有其他选项均设置为缺省； (ii)编码多肽，所述多肽具有SEQID NO :6所示的氨基酸序列，并且具有表12、表13、表14和/或表15中所述的氨基酸改变或取代(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或 30 个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合；或 (iii)在严格条件下与包含SEQID NO :5并编码多肽的核酸杂交，所述多肽具有表12、表13、表14和/或表15中所述的氨基酸改变(突变)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或 30 个或更多、或全部氨基酸改变(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合， 其中所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65°C的温度下在0. 2X SSC中洗涤约15分钟； (iv)包含序列SEQID NO :7、SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10或由其组成的核酸；或 (V)与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10具有至少约75%、76%、77%、78%、79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多、或 100%的序列同一性； (b)(a)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然信号序列或前蛋白氨基酸序列的多肽； (c)(a)或(b)的核酸序列，其编码具有PI-PLC酶活性但缺少天然启动子序列的多肽； (d)(C)的核酸，还包括异源启动子序列或其他转录调控序列； (e)(a) (d)中任一个的核酸序列，还包括编码异源氨基酸序列的核酸，或还包括异源核苷酸序列； (f)(e)的核酸，其中所述编码异源氨基酸序列的核酸包含编码异源(前导)信号序列、或标签或表位的序列，或由其组成，或所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列； (g)(d)、(e)或⑴的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸或由其组成，或所述异源序列编码限制位点； (h)(d)、(e)或(f)的核酸，其中所述异源启动子序列包含组成型或诱导型启动子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子，或由其组成；(i)(a) (h)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是热稳定的； (j) (a) (h)中任一个的核酸，其中所述PI-PLC活性是耐热的； (k)与(a) (j)中任一个的核苷酸序列完全互补的核酸序列。
2.用于分离、制造和/或鉴定核酸的核酸探针或扩增引物，所述核酸编码具有PI-PLC活性的多肽，其中所述探针包含权利要求I的核酸或由其组成。
3.载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体a)包含权利要求I的核酸序列；或幻3)的载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体，其含有或包含在病毒载体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、F黏粒、细菌噬菌体、人工染色体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关的病毒载体中；或，细菌人工染色体(BAC)、细菌噬菌体Pl-衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
4.宿主细胞或转化的细胞 a)包含权利要求I的核酸序列,或权利要求3的载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体；或 b)a)的宿主细胞或转化的细胞，其中所述细胞是是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
5.转基因非人动物(a)包含权利要求I的核酸序列；权利要求3的载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体；或权利要求4的宿主细胞或转化的细胞；或(b) (a)的转基因非人动物，其中所述动物是小鼠、大鼠、山羊、兔、绵羊、猪或牛。
6.转基因植物或种子 (a)包含权利要求I的核酸序列；权利要求3的载体、表达框、表达载体、质粒或克隆载体；或权利要求4的宿主细胞或转化的细胞； (b)(a)的转基因植物，其中所述植物是玉米植物、高粱植物、马铃薯植物、西红柿植物、小麦植物、油籽植物、油菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物、草、棉籽、棕榈、芝麻种子植物、花生植物、向日葵植物或烟草植物；(a)的转基因种子，其中所述种子是玉米种子、小麦仁、油籽、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵籽、芝麻种子、水稻、大麦、花生、棉籽、棕榈、花生、芝麻种子、向日葵籽或烟草植物种子。
7.包含权利要求I的核酸序列或由权利要求I的核酸序列组成的反义寡核苷酸或抑制性 RNA。
8.抑制细胞中磷脂酶信使(转录，mRNA)转移的方法，所述方法包括给予所述细胞或在所述细胞中表达包含权利要求I的核酸序列或由其组成的反义寡核苷酸或抑制性RNA。
9.分离的、合成的或重组的多肽，其具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶活性，并且 (a)包含氨基酸序列 (i)与 SEQ ID NO :6 具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更多或100%的序列同一性，并具有表12、表13、表14和/或表15中所述的氨基酸改变或取代(突变)中的至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、·21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多、或全部氨基酸改变或取代(突变)、或等同氨基酸改变或取代(突变)、或其任意组合，其中任选地，用序列比对算法或通过目视检查来分析确定序列同一性， (ii)由权利要求I(a)至权利要求1(0)的任一个的核酸编码； (iii)与SEQ ID NO :8 具有至少约 75 %、76 %、77 %、78 %、79 %、80 %、81 %、82 %、83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%、99%或更多或100%序列同一性； (b)(a)的多肽，但缺少天然信号序列和/或前蛋白序列； (c)(a)或(b)的多肽，还包括异源氨基酸序列或异源部分； (d)(C)的多肽，其中所述异源氨基酸序列或异源部分包含异源(前导)信号序列、标签、可检测标记或表位，或由其组成； (e)(d)的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包含靶向内质网(ER)或内膜、或者靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N-端和/或C-端延伸，或由其组成； (f)(a) (e)中任一个的多肽，其中PI-PLC催化反应，所述反应包括I-磷脂酰-lD-myo-肌醇4,5-二磷酸(也称作PIP2,嶙脂酰肌醇二磷酸)+H2O ^ lD-myo-肌醇1，4，5-三磷酸(也称作IP3,肌醇三磷酸)+ 二酰基甘油； (g)(a) (f)的多肽，其中所述PI-PLC活性是热稳定的； (h)(a) (f)的多肽，其中所述PI-PLC活性是耐热的； ⑴(a) (h)中任一个的多肽，其中(i)所述多肽被糖基化，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，的多肽，其中所述糖基化是N-连接的糖基化或0-连接的糖基化；(iii)⑴或(ii)的多肽，其中所述多肽在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv) (iii)的多肽，其中所述酵母细胞是毕赤酵母或裂殖酵母； (j) (a) (i)中任一个的多肽，还包含含有至少一个第二种酶或至少一个第二种磷脂酶的组合物，或包含在所述组合物中；或 (k) (j)的多肽，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括具有SEQ ID N0:2和/或SEQ IDNO 4中所示的序列的多肽，或表8和9中所述的至少一个它们的变体PLC酶。
10.包含权利要求9的多肽的蛋白制剂，其中所述蛋白制剂包括液体、固体或凝胶。
11.异二聚体(a)包含权利要求9的多肽和第二结构域；或(b)(a)的异二聚体，其中所述第二结构域是多肽且所述异二聚体是融合蛋白，或所述第二结构域是表位或标签。
12.包含权利要求9的多肽的异二聚体。
13.固定化多肽(a)其中所述多肽包含权利要求9的多肽；或(b)(a)的固定化多肽，其中所述多肽被固定在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、平板、阵列或毛细管上。
14.分离的、合成的或重组的抗体(a)其与权利要求9的多肽特异性结合；或(b)(a)分离的、合成的或重组的抗体，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体，或是其抗原结合片段。
15.包含权利要求14的抗体的杂交瘤。
16.包含权利要求9的固定化多肽、或如I中所示的固定化核酸；或权利要求14的抗体，或其组合的阵列。
17.分离或鉴定具有磷脂酶活性的多肽的方法，其包括下述步骤(a)提供权利要求14的抗体； (b)提供包含多肽的样品；并 (C)使步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体在其中抗体可与多肽特异性结合的条件下接触，从而分离或鉴定出具有磷脂酶活性的多肽。
18.制造抗磷脂酶抗体的方法，其包括将权利要求I的编码磷脂酶的核酸序列以足够的量给予非人动物以产生体液的免疫应答，从而制造抗磷脂酶抗体。
19.制造抗磷脂酶抗体的方法，其包括将权利要求9的抗体以足够的量给予非人动物以产生体液的免疫应答，从而制造抗磷脂酶抗体。
20.生产重组多肽的方法，其包括 A (a)提供与启动子可操作地连接的核酸，其中所述核酸包括权利要求I的核酸序列；和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，从而生产重组多肽；或 (B)(A)的方法，还包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，然后表达步骤(a)的核酸，从而在转化细胞中生产重组多肽。
21.鉴定具有磷脂酶活性的多肽的方法，其包括 (a)提供权利要求9的多肽； (b)提供磷脂酶底物；和 (C)将所述多肽与步骤(b)的底物接触，并检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加检测出具有磷脂酶活性的多肽。
22.鉴定磷脂酶底物的方法，其包括 (a)提供权利要求9的多肽； (b)提供待测底物；和 (C)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的待测底物接触，并检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加鉴定出待测底物为磷脂酶底物。
23.测定待测化合物是否特异性结合多肽的方法，其包括 (a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包含核酸的载体，其中所述核酸包含权利要求I的核酸序列； (b)提供待测化合物； (C)将所述多肽与所述待测化合物接触；和 (d)测定是否步骤(b)的待测化合物特异性结合多肽。
24.测定待测化合物是否特异性结合多肽的方法，其包括 (a)提供权利要求9的多肽； (b)提供待测化合物； (C)将所述多肽与所述待测化合物接触；和 (d)测定是否步骤(b)的待测化合物特异性结合多肽。
25.鉴定磷脂酶活性的调节物的方法，其包括 (A)(a)提供权利要求9的多肽； (b)提供待测化合物； (C)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的待测化合物接触并测量磷脂酶的活性，其中将在所述待测化合物存在下测量到的磷脂酶活性变化与在所述待测化合物不存在下的活性进行比较，从而提供所述待测化合物调节磷脂酶活性的检测结果； (B)(A)的方法，磷脂酶活性可以通过提供磷脂酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加或者底物量的增加或反应产物量的减少来进行测量； (C)(B)的方法，其中与没有所述待测化合物的底物或反应产物的量相比，有所述待测化合物的底物量减少或反应产物量增加鉴定出所述待测化合物为磷脂酶活性的活化剂；或， (D)(B)的方法，其中与没有所述待测化合物的底物或反应产物的量相比，有所述待测化合物的底物量增加或反应产物量减少鉴定出所述待测化合物为磷脂酶活性的抑制剂。
26.从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸的方法，其包括 (A)(a)提供包含权利要求I的核酸序列的多核苷酸探针； (b)从样品中分离核酸或处理样品，使得样品中的核酸能够与步骤(a)的多核苷酸探针杂交； (C)将步骤(b)的分离的核酸或处理的样品与步骤(a)的多核苷酸探针组合；和 (d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特异性杂交的核酸，从而从样品中分离或回收编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸； (B)(A)的方法，其中所述样品是或包括环境样品； (C)(B)的方法，其中所述环境样品是或包括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品；或 (D)(C)的方法，其中所述生物样品衍生于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
27.生产编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸变体的方法，其包括 (A)(a)提供包含权利要求I的核酸序列的模板核酸；和 (b)修饰、缺失或添加模板序列中的一种或多种核苷酸或其组合，以产生所述模板核酸变体； (B)(A)的方法，还包括表达所述变体核酸以产生变体磷脂酶多肽； (C)(A)或(B)的方法，其中所述修饰、添加或缺失可以通过以下方法进行引入，包括易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)和其组合； (D)(A) (C)中任一个的方法，其中所述修饰、添加或缺失可以通过以下方法进行引入，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、尿喃唳-含有模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立和其组合； (E)(A) (D)中任一个的方法，其中所述方法迭代重复，直到产生与所述模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的(变体)活性或改变的或不同的(变体)稳定性的(变体)磷脂酶，或产生与所述模板核酸编码的多肽相比改变的或不同的(变体)二级结构，或产生与所述模板核酸编码的多肽相比改变的或不同的(变体)转录后修饰； (F)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽是耐热的，且在暴露于高温后仍保留一些活性；(G)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽与所述模板核酸编码的磷脂酶相比具有增强的糖基化； (H)(E)的方法，其中所述变体磷脂酶多肽在高温下具有磷脂酶活性，其中由所述模板核酸编码的磷脂酶在高温下没有活性； (I)(A) (H)中任一个的方法，其中所述方法迭代重复，直到产生与所述模板核酸相比具有改变的密码子应用的磷脂酶编码序列；或 (J) (A) (H)中任一个的方法，其中所述方法迭代重复，直到产生与所述模板核酸相比具有更高或更低信息表达或稳定性水平的磷脂酶基因。
28.修饰在编码磷脂酶多肽的核酸中的密码子的方法，所述方法包括 (a)提供编码具有磷脂酶活性的多肽的核酸，所述核酸包含权利要求I的核酸序列；和， (b)鉴定在步骤(a)的核酸中的密码子并用编码相同氨基酸的不同密码子作为替换密码子进行替换，从而修饰在编码磷脂酶的核酸中的密码子。
29.产生编码多个修饰的磷脂酶活性位点或底物结合位点的核酸的文库的方法，其中所述修饰的活性位点或底物结合位点衍生于第一核酸，其包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列，所述方法包括 (A)(a)提供编码第一活性位点或第一底物结合位点的第一核酸，其中所述第一核酸序列包含权利要求I的序列，并且所述核酸编码磷脂酶活性位点或磷脂酶底物结合位点； (b)提供一套诱变的寡核苷酸，其编码在所述第一核酸中多个目标密码子处的天然发生的氨基酸变体；和， (C)使用该套诱变的寡核苷酸，产生一套编码活性位点或编码底物结合位点的变体核酸，其在诱变处理的每个氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变化，从而产生编码多个修饰的磷脂酶活性位点或底物结合位点的核酸文库； (B)(A)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一核酸，包括最优化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)或合成连接再组装(SLR)； (C)(A)或(B)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一核酸或变体，包括易错PCR、重排、寡核苷酸-定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归全体诱变、指数全体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接再组装(SLR)和其组合；或 (D)(A)或(B)的方法，包括通过以下方法诱变处理步骤(a)的第一核酸或变体，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、尿嘧啶-含有模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、全体诱变、嵌合核酸多体建立和其组合。
30.制造小分子的方法，其包括 (a)提供能够合成或修饰小分子的多种生物合成酶，其中酶中的一种包括由权利要求I的核酸序列编码的磷脂酶； (b)提供步骤(a)的至少一种酶的底物；和 (C)在促进多种生物催化反应以通过一系列生物催化反应产生小分子的条件下使步骤(b)的底物与所述酶反应。
31.修饰小分子的方法，其包括 (A)(a)提供磷脂酶，其中所述酶包含权利要求9的多肽，或由权利要求I的核酸编码的多肽； (b)提供小分子；和 (C)在促进磷脂酶催化的酶反应的条件下使步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子反应，从而通过磷脂酶反应修饰小分子； (B)(A)的方法，包括步骤(a)的酶的多种小分子底物，从而生产通过磷脂酶催化的至少一个酶反应产生的修饰的小分子的文库； (C)(A)或(B)的方法，还包括在促进酶的多个生物催化反应的条件下多种额外的酶，形成通过多个酶反应产生的修饰的小分子的文库； (D)(C)的方法，还包括检测文库以确定表现出目标活性的特定修饰的小分子是否在文库内的步骤；或 (E)(D)的方法，其中所述测试文库的步骤还包括以下步骤系统地消除除了用于在文库内产生多种修饰的小分子一部分的生物催化反应外的全部生物催化反应，其通过对于有或没有具有目标活性的特定修饰的小分子检测修饰的小分子的一部分，并鉴定产生具有目标活性的特定修饰的小分子的至少一个特异性生物催化反应来实现。
32.测定磷脂酶的功能片段的方法，其包括 (A)(a)提供磷脂酶，其中所述酶包含权利要求9的多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的多肽；和 (b)从步骤(a)的序列删除多个氨基酸残基并测试其余子序列的磷脂酶活性，从而测定磷脂酶的功能片段；或， (B)(A)的方法，其中通过提供磷脂酶底物并且检测底物量减少或反应产物量增加来测量磷脂酶活性。
33.通过使用实时代谢通量分析进行新或修饰的表型的整个细胞工程化的方法，所述方法包括 (a)通过修饰细胞的遗传组合物制备修饰的细胞，其中所述遗传组合物通过向细胞中加入权利要求I的核酸序列而修饰； (b)培养所述修饰的细胞以生产多种修饰的细胞； (C)通过实时监测步骤(b)的细胞培养物测量细胞的至少一个代谢参数；和， (d)分析步骤(C)的数据，以确定测得的参数是否不同于在相似条件下在未修饰的细胞中的可比测量，从而使用实时代谢通量分析鉴定细胞中的工程化的表型； (B)(A)的方法，其中所述细胞的遗传组合物通过以下方法修饰，包括细胞中的序列的缺失或序列的修饰，或者，敲除基因表达； (C)(A)或(B)的方法，还包括选择包含新工程化的表型的细胞；或 (D)(C)的方法，还包括培养所述选择的细胞，从而生产包含新工程化的表型的新细胞菌株。
34.增强磷脂酶多肽耐热性或热稳定性的方法，所述方法包括糖基化磷脂酶，其中所述多肽包括权利要求9的多肽的至少30个连续氨基酸，或由权利要求I的核酸序列编码的多肽，从而增强磷脂酶的耐热性或热稳定性。
35.在细胞中过表达重组磷脂酶的方法，其包括表达包含权利要求I的核酸序列的载体，其中过表达受使用的高活性启动子、双顺反子载体或受载体的基因扩增影响。
36.转基因植物的制备方法，其包括 (A)(a)在细胞中引入异源核酸序列，其中所述异源核酸序列包括权利要求I的核酸序列，从而生产转化的植物细胞；和(b)从所述转化细胞生产转基因植物； (B)步骤(A)的方法，其中步骤(A)(a)还可以包括通过植物细胞原生质体的电穿孔或微注射引入异源核酸序列；或 (C)(C)的方法，其中步骤(A) (a)包括通过DNA颗粒轰击或通过使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主直接向植物组织引入所述异源核酸序列。
37.在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，其包括以下步骤 (a)使用可操作地连接到启动子的异源核酸序列转化植物细胞，其中所述异源核酸序列包括权利要求I的核酸序列；和 (b)在所述异源核酸序列在植物细胞中表达的条件下生长植物。
38.洗涤剂组合物(a)含有权利要求9的磷脂酶多肽或由权利要求I的核酸序列编码的磷脂酶多肽；(b) (a)的洗涤剂组合物，其中所述磷脂酶是非表面活性的磷脂酶或表面活性的磷脂酶；或，(c) (a)或(b)的洗涤剂组合物，其中所述磷脂酶配制成非水性液体组合物、流延固体、冻干粉末、颗粒形式、微粒形式、压片、小球、凝胶形式、糊剂、气雾剂或衆剂。
39.用于洗涤目标物的方法，其包括 (a)提供含有权利要求9的磷脂酶多肽或由权利要求I的核酸序列编码的多肽的组合物； (b)提供目标物；和 (C)在所述组合物能够洗涤所述目标物的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的目标物接触。
40.含有权利要求9的磷脂酶多肽或由权利要求I的核酸序列编码的多肽的组合物。
41.改善、处理或预防脂多糖(LPS)介导的毒性的方法，其包括给予患者含有权利要求9的多肽或由权利要求I的核酸序列编码的多肽的药物组合物。
42.权利要求9的多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的多肽用来制造药物组合物的用途。
43.权利要求9的多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的多肽用来制造药物组合物用于预防、治疗或改善脂多糖(LPS)介导的毒性或用于内毒素解毒或从脂质A去酰基化2’或3’脂肪酸链的用途。
44.内毒素解毒的方法，其包括将内毒素与权利要求9的多肽或由权利要求I的核酸序列编码的多肽接触。
45.制备在宿主细胞表达增加的变体磷脂酶编码序列的方法，其包括修饰权利要求I的核酸序列，使得一个、几个或全部N-连接的糖基化位点编码基序被修饰成非糖基化基序。
46.含有磷脂酶混合物的组合物，包括 (a)(i)权利要求9的至少一种磷脂酶多肽或由权利要求I的核酸序列编码的多肽；和(ii)至少一个第二种酶；(b)(a)的组合物，其中所述至少一种酶是磷脂酶；或 (c)(b)的组合物，其中所述至少一个第二种磷脂酶包括SEQ ID N0:2和/或SEQ IDNO 4所示的多肽，或表8和9所述的至少一个变体PLC酶。
47.包含权利要求9的具有磷脂酶活性的至少一种多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的至少一种磷脂酶，或权利要求40或权利要求46的组合物的燃料。
48.可溶干酒糟(DDS)、干酒糟(DDG)、酒糟残液(CDS)、湿酒糟(DWG)或含可溶物的蒸馏干燥颗粒(DDGS)，其包含权利要求9的具有磷脂酶活性的至少一种多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的至少一种多肽，或权利要求40或权利要求46的组合物。
49.生物质，其包含 (a)权利要求9的具有磷脂酶活性的至少一种多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的至少一种磷脂酶，或权利要求40或权利要求46的组合物；或 (b)(a)的生物质，其中所述生物质是或包含动物、藻类和/或植物生物质、或含脂质的或木质纤维素生物质、或废料。
50.石油基广品 (a)包含权利要求9的具有磷脂酶活性的至少一种的多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的至少一种磷脂酶，或权利要求40或权利要求46的组合物；或 (b)通过包括使用权利要求9的具有磷脂酶活性的至少一种的多肽，或由权利要求I的核酸序列编码的至少一种磷脂酶，或权利要求40或权利要求46的组合物的方法制备；或 (c)(a)或(b)的石油基产品，包括油、生物柴油或汽油，或生物乙醇、生物丁醇、生物丙醇或生物甲醇；或者生物乙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇和/或生物柴油和汽油的混合物。
全文摘要
本发明公开了磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶、编码它们的核酸、与其特异性结合的抗体以及制备和使用它们的方法。还提供了包括使用这些磷脂酶的工业方法和产品。本发明还提供了使脂质基质内的非水化磷脂(NHP)水合的方法，该方法能够使NHP迁移到油-水界面，从而允许NHP反应和/或从脂质除去。还提供了从植物油中除去NHP、水化磷脂和卵磷脂以制造可用于食物生产和/或非食物应用的脱胶油或脂肪产品的方法。
文档编号C07H21/00GK102712671SQ201080057899
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月8日 优先权日2009年10月16日
发明者乔纳森·D·里昂, 提姆·S·海克曼, 纳尔逊·R·巴顿, 艾琳·O＇多诺古, 马克·A·沃尔 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司