具有磷脂酶c活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法
【专利说明】具有磷脂酶C活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有磷脂酶C活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及 包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。
[0005] 另外，本发明涉及通过利用具有磷脂酶C活性的酶来降低包括高量的非水合磷的 食用油中的含磷组分的含量的方法。
[0006] 相关技术说明
[0007] 己知几种类型的磷脂酶，根据磷脂分子中受到攻击的键的位置，这些磷脂酶在其 特异性方面存在不同。磷脂酶Al(PLAl)去除1-位的脂肪酸而产生游离的脂肪酸和1-溶 血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)去除2-位的脂肪酸而产生游离的脂肪酸和1-酰 基-2-溶血磷脂。将术语磷脂酶B(PLB)用于具有A1和A2两者活性的磷脂酶。磷脂酶C(PLC) 去除磷酸部分而产生1，2二酰甘油和磷酸脂。磷脂酶D(PLD)产生1，2-二酰甘油-磷酸和 喊性基团。
[0008] 具有磷脂酶C活性的多肽可应用于工业方法，例如用于精炼植物油。在消费之前， 将植物油脱胶以提供精炼的储藏稳定性植物油，其具有中性味道和浅颜色。该脱胶方法包 括从富含甘油三酯的油级分去除磷脂组分（胶）。
[0009] 传统上，该脱胶方法已基于水提取、酸亦或碱处理，随后是分离方法。由于磷脂组 分的乳化特性，该脱胶过程已导致油（即甘油三酯）的损失。
[0010] 由于磷脂的有效水解（其减少了乳化特性），酶促脱胶降低了油损失。对于具有磷 脂酶C活性且适用于在食用油的酶促脱胶中应用的另外的酶存在着需要。
[0011] 一种具有磷脂酶C活性且与本发明的酶有88 %序列一致性的酶从W02012062817 中已知。
[0012] 发明概述
[0013] 诸位发明人已经从青霉属菌株或更具体地从2007年发现于中国的埃默森青霉菌 的菌株中分离一种具有磷脂酶C活性的新酶。因此，本发明提供了具有磷脂酶C活性的新 颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
[0014] 本发明涉及具有磷脂酶C活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由 以下各项组成：
[0015] (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%的序列一致性；
[0016] (b) -种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在非常高严格条件下与（i)SEQ IDNO: 1的成熟多肽编码序列、或（ii) (i)的全长互补体杂交；
[0017] (c) -种多肽，该多肽由与SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列具有至少90%序列 一致性的多核苷酸编码；
[0018] (d)SEQIDNO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如，若干个）位 置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0019] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有磷脂酶C活性。
[0020] 本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体； 包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0021] 本发明还涉及包含本发明的这些多肽的组合物。
[0022] 本发明还涉及上述多肽或上述组合物在磷脂水解的方法中，诸如在降低食用油中 的磷脂含量的方法中的用途。
[0023] 本发明还涉及用一种编码本发明的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物 部分或植物细胞。
[0024] 定义
[0025] 磷脂酶C活性：术语"磷脂酶C活性"意指催化以下反应的活性:A磷脂酰胆碱+H20 =1，2-sn-二酰甘油+磷酸胆碱。根据"材料与方法"中所描述的程序来确定磷脂酶C活 性。一种具有"磷脂酶C活性"的酶可以属于EC3. 1. 4. 3。
[0026]本发明的这些多肽具有SEQIDNO: 2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至 少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、以及至少100 %的磷脂酶C 活性。
[0027]术语"磷脂酶C活性"意指一种具有磷脂酶C的多肽将针对磷脂酰胆碱（PC)、磷脂 酰乙醇胺（PE)、磷脂酸（PA)和磷脂酰肌醇（PI)中的一种或多种具有活性。
[0028] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占据同一染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0029] 催化结构域：术语"催化结构域"意思指一种酶的包含该酶的催化机器的区域。 [0030]cDNA:术语"cDNA"意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0031] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0032] 控制序列：术语"控制序列"意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相 同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列 包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。 至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与 编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以 提供有多个接头。
[0033] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0034] 表达载体：术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多 核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
[0035]片段：术语"片段"意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个 (例如若干个）氨基酸的一种多肽。其中该片段具有磷脂酶C活性。在一个方面，一个片段 包含至少1700个氨基酸残基（例如，SEQIDNO:2的氨基酸1至1700)、至少1600个氨基 酸残基（例如，SEQIDNO:2的氨基酸1至1600)、或至少1500个氨基酸残基（例如，SEQ IDNO:2的氨基酸1至1500)。
[0036] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的 多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语"宿主细胞"涵 盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0037] 分离的：术语"分离的"意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的 物质的非限制性实例包括（1)任何非天然发生的物质，（2)包括但不限于任何酶、变体、核 酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所 有天然发生的成分中去除；（3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或（4)通 过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质（例如，编码该物质 的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子）。一种分离的 物质可以存在于发酵液样品中。
[0038] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ IDNO:2的氨基酸1至594。SEQIDNO:2的氨基酸-16至-1是一种信号肽。本领域中已 知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即， 具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0039] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有磷脂酶C活性的成熟 多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO: 1的核苷酸49至1830。 SEQIDNO: 1的核苷酸1至48编码一种信号肽。
[0040] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单-链或双链的一种核酸分子，该核酸分子 是从天然存在的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核 酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
[0041] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核 苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0042] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数 "序列一致性"来描述。
[0043] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件 (TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗 传学趋势（TrendsGenet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔（Needle) 程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔曼）和 Wunsch(翁施），1970,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸 序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5,以及EBLOSUM62 (BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0044](一致的残基X100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0045] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯（Rice)等人，2000,见上文）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼 德尔曼-翁施算法（尼德尔曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,见上文）来确定两个 脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚 分0. 5以及EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一 致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0046](一致的脱氧核糖核苷酸X100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0047] 严格条件：
[0048]非常低严格条件：术语"非常低严格条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探 针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性 的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、 0. 2 %SDS，在45 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0049]低严格条件：术语"低严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0. 2% SDS，在50 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0050]中严格条件：术语"中严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0. 2% SDS，在55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0051]中-高严格条件：术语"中-高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探 针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性 的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、 0. 2 %SDS，在60 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0052]高严格条件：术语"高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0. 2% SDS，在65 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0053]非常高严格条件：术语"非常高严格条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探 针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性 的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、 0. 2 %SDS，在70 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0054] 子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编 码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有磷脂酶C活性的片段。 在一个方面，一个子序列包含至少1800个核苷酸（例如，SEQIDNO: 1的核苷酸1至1800)， 至少1700个核苷酸（例如，SEQIDNO: 1的核苷酸1至1700)，或至少1600个核苷酸（例 如，SEQIDNO: 1的核苷酸1至1600)。
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