用于治疗多发性硬化及相关病症的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 依据美国法典第35卷第119(e)条，本申请要求于2012年10月11日提交的美国 临时申请No. 61/712, 733和于2013年3月14日提交的美国序列号：13/830, 521的权益和 优先权，其各自的内容通过引用以其整体并入本公开内容。
技术领域
[0003] 本公开内容涉及与免疫治疗和医药相关的组合物和方法。特别地，本公开内容涉 及用于治疗多发性硬化及相关病症的疗法。
【背景技术】
[0004] 多发性硬化（multiplesclerosis，MS)是一种潜在的致虚弱的疾病，其中身体的 免疫系统破坏了覆盖神经的保护性鞘。这干扰了大脑与身体其余部分之间的通信。最终， 这可能导致神经本身的退化，这个过程是不可逆的。
[0005] 统计显示在美国大约250, 000至350, 000的人被诊断出患有这种疾病。取决于损 伤的量以及受影响的神经，症状广泛地变化。多发性硬化的重病患者可能会失去行走或说 话的能力。MS的症状包括手臂或腿的麻木、疼痛、视力丧失、肌无力或震颤、麻痹、眩晕、疲 劳、讲话困难、膀胱功能障碍、抑郁、听力丧失和瘙痒。
[0006] 尚无治愈MS的方法，但已经发现某些药物可以减轻MS的攻击并可能延缓疾病。 治疗试图恢复攻击后的功能、预防新的攻击并预防残疾。MS药物可能具有副作用或耐受性 差。因此，在本领域中需要对于MS更好耐受性的、更有效的疗法。
【发明内容】
[0007] 为了响应本领域的需要，本文描述了用于治疗或预防多发性硬化或多发性硬化 相关病症的治疗方法和组合物。本公开内容的一个方面涉及用于在患有多发性硬化或多 发性硬化相关病症的对象中扩增和/或产生抗病原体的自身反应性T细胞群的方法，所述 方法包括向该对象施用抗原-MHC-纳米颗粒复合物，所述方法基本上由向该对象施用抗 原-MHC-纳米颗粒复合物组成，或者所述方法进一步由向所述对象施用抗原-MHC-纳米颗 粒复合物组成，其中所述抗原是多发性硬化相关抗原。
[0008] 另一个方面涉及用于在有此需要的对象中治疗多发性硬化或多发性硬化相关病 症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗原-MHC-纳米颗粒复合物，所述方法 基本上由向所述对象施用抗原-MHC-纳米颗粒复合物组成，或者所述方法进一步由向所述 对象施用抗原-MHC-纳米颗粒复合物组成，其中所述抗原是多发性硬化相关抗原。还提供 了抗原-MHC-纳米颗粒复合物在制备用于治疗多发性硬化或用于扩增和/或产生抗病原体 的自身反应性T细胞群之药物中的用途，其中所述抗原是多发性硬化相关抗原。
[0009] 另一些方面涉及复合物，其包含纳米颗粒、MHC蛋白质和多发性硬化相关抗原，基 本上由纳米颗粒、MHC蛋白质和多发性硬化相关抗原组成，或者进一步由纳米颗粒、MHC蛋 白质和多发性硬化相关抗原组成。还提供了组合物，其包含本文所述的抗原-MHC-纳米颗 粒和载体，基本上由本文所述的抗原-MHC-纳米颗粒和载体组成，或者进一步由本文所述 的抗原-MHC-纳米颗粒和载体组成。另一些方面涉及药盒，其包含本文所述的抗原-MHC-纳 米颗粒组合物和使用说明，基本上由本文所述的抗原-MHC-纳米颗粒组合物和使用说明组 成，或者进一步由本文所述的抗原-MHC-纳米颗粒组合物和使用说明组成。
【附图说明】
[0010] 以下附图构成了本说明书的一部分并包括在内以进一步证明本发明的某些方面。 通过参考这些附图中的一个或更多个并结合本文所提出的具体实施方案的详细描述可以 更好地理解本发明。
[0011] 图1示出pMHCII类-NP疗法降低了在C57BL/6小鼠中建立的EAE的严重性。用 CFA中的pMOG35_55免疫B6小鼠并用静脉注射（i.v.)百日咳毒素进行处理。使用已建立的标 准以15分量表对小鼠的EAE的体征进行评分。在免疫后21天开始每周两次用7. 5-22. 5yg 剂量的pM0G38_49/IAb包被的NP处理受影响的小鼠。
[0012] 图2证明用pMHCII类-NP疗法（pM0G38_49/IAb包被的NP)处理患有慢性EAE的小 鼠相比于未经处理的EAE小鼠重量增加。
[0013] 图3为患有EAE的经处理和未经处理小鼠的照片。经处理的小鼠（NAVACM)看起 来比未经处理的小鼠更健康。
[0014] 图4示出了在EAE影响的C57BL/6小鼠中，通过pM0G38_49/IAb包被的NP的同源自 身调节性⑶4+T细胞的系统性扩增。在这个模型中的扩增幅度比得上在用1型糖尿病相关 的pMHCII类包被NP处理的NOD小鼠中所见到的（参见，例如美国专利No:8, 354, 110,其 通过引用以其整体并入本文）。
[0015] 图5描绘了未经处理之小鼠的脊髓。未经处理的小鼠表现出白质显著的脱髓鞘和 致密的单核细胞浸润。
[0016] 图6描绘了经pM0G38_49/IAb-NP处理的小鼠的脊髓。pMHC-NP处理的小鼠具有显著 更少的脱髓鞘和单核细胞浸润。
[0017] 图7示出2只未经处理的EAE小鼠脊髓边缘的代表性实例。
[0018] 图8示出了 2只经pM0G38_49/IAb-NP处理的EAE小鼠脊髓边缘的代表性实例。 pMHC-NP处理的小鼠具有显著更少的脱髓鞘以及更低的单核细胞浸润。
[0019]图 9 示出了pMOG36_55-I-A0 (b)-C-Jun构建体（SEQIDNO:2)的蛋白质和DNA序 列。在融合蛋白中，序列的各组件是HA前导序列(下划线），接着是t)M()G说」?丨肽序列 (双下划线），hAP.i.b)(虚线下划线）和c-jun(阴影）序列。未突出显示GS接头。
[0020] 图10是含有抗原的载体的DNA图谱（DNAmap)。将编码HA前导序 列-14€[03)-(^08-81^-把8\6融合蛋白（284个氨基酸）的0嫩构建体位点克隆到口11'/ V5苍蝇细胞表达载体的NcoI(854)至Xbal(1711)之间。所述融合蛋白包含I-Aa(d) (195 个氨基酸），接着是C-Fos，GS接头（6个氨基酸），然后是BirA序列和6XHis。
[0021] 图11示出了以高密度（约5X1013/mL)浓缩的和单分散之pMHC包被的金NP(约 14nm)的代表性TEM图像。放大率：50, 000X。
[0022] 图12示出了pMHC(GNP)剂量和pMHC效价（valency)对pMHC-包被的NP的激动性 质的作用。该图比较了通过响应两种不同的pMHC-NP样品（两者均由直径14nm的约2X1013 个NP/mL组成）之同源的8. 3-CD8+T细胞分泌的IFNy的量。Au-022410和Au-21910分别 携带约 250 个pMHC/NP和约 120 个pMHC/NP。Au-011810-C携带约 120 个对照的pMHC/NP。
[0023] 图13证明了作为pMHC效价之函数的8. 3-⑶8+T细胞的pMHC-NP诱导的IFNy 分泌。用逐渐增加数目的以三种不同IGRP2Q6_214/Kd效价包被的NP培养8. 3-⑶8+T细胞 (2. 5X105个细胞 /ml)。IGRP2(16_214包含抗原肽VYLKTNVFL。
[0024] 图14示出pMHC-NP较低的激动活性可通过增加pMHC-NP的密度进行补偿，但仅在 pMHC效价的阈值以上。图以一系列的NP密度比较了三种不同的pMHC-NP制备物（携带三 种不同效价的pMHC)的激动活性。需要注意的是，携带8个pMHC的NP，不同于携带11个 pMHC的那些，与每个NP携带11个和54个pMHC的NP相比，即使在高pMHC-NP密度下也不 能充分地触发IFNy的分泌。
[0025] 图15示出了作为总pMHC输入之函数的pMHC效价阈值对pMHC-NP的激动性质的 作用。
[0026] 图16示出了pMHC效价对以较大氧化铁NP芯产生的pMHC-NP之激动活性的作用。
[0027] 图17示出了尺寸对激动活性的作用。Au-0224-15是包被有相对低pMHC效价但 以高密度制备的14nmGNP;Au-0323-40是包被有高pMHC效价但以低密度制备的40nmGNP。 Au-0224-15比Au-0323-40样品具有更优良的激动活性。
[0028] 图18示出了保护性PEG对pMHC-GNP功能的作用。Au-021910由以2kD的巯基-PEG 保护的约2X1013个直径14nmGNP/mL组成并包被有约120pMHC/GNP。Au-012810GNP(也是约 2X1013个 14nmGNP/mL)由 5kD的巯基-PEG保护并包被有约 175pMHC/GNP。样品Au-021910 具有更优良的激动活性。
[0029] 图19示出了NRP-V7/Kd包被的金NP对NRP-V7反应性的CD8+T细胞的有效扩增。 使用携带 25ygpMHC(150pMHC/NP)的 3X1012NP(约 10nm大小）。一周两次注射NRP-V7/ Kd包被的金NP持续5周来处理糖尿病前期之10周龄的NOD小鼠。TUM/Kd四聚体是阴性 对照。图中每一列对应于一只不同的小鼠。
[0030] 图20描绘了用pMHC包被的NP处理之小鼠中同源⑶8+T细胞的大量扩增。使用 携带 25ygpMHC(l5〇pMHC/NP)的 3X1012IGRP2Q6_214/Kd-NP(约 10nm大小）。上图：4 次给药 后处死之小鼠的图。下图：10次注射后两种不同小鼠的图（仅血液）。
[0031] 图21证明pMHCI类-NP复合物的相同原理适用于pMHCII类包被的NP(参见图 18)。需要注意的是，包被有17个pMHC的pMHCII类pMHC-NP(BDC2. 5mi包被的6-8nm纳 米颗粒（SFPZ))比每个NP包被有53个pMHC的PFM(20-25nm)颗粒具有更高的激动活性。 这证实了对于I类-pMHC-NP和II类-pMHC-NP二者，重要的不是pMHC的绝对效价而是pMHC 的密度。正如通过作为pMHC密度之函数的pMHC-NP诱导的⑶4+T细胞的IFNy分泌的增 加所证明的那样。
[0032] 发明详述
[0033] 应当理解的是，本发明并不限于所述的具体实施方案，因为其当然可以变化。还应 当理解的是，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而并不旨在进行限制，因为 本发明的范围将仅由所附权利要求书来限定。
[0034] 必须注意的是，除非上下文另有明确说明，否则如本文和在所附权利要求书中所 使用的没有数词限定的表述包括复数形式。因此，例如，提及"一个/种赋形剂"包括多个 /种赋形剂。
[0035] I?定义
[0036] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域普通 技术人员通常所理解的具有相同的含义。如本文所用的下列术语具有如下含义。
[0037]如本文所用的术语"包括"或"包含"意指组合物和方法包括所列举的要素但不排 除其他要素。为了陈述的目的，当使用"基本上由......组成"来限定组合物和方法时，应 指排除了对组合有任何本质重要性的其他要素。因此，基本上由如本文所限定的要素组成 的组合物将并不排除对所要求保护的发明的基本特征和新特征不具有实质性影响的其他 材料或步骤，例如用于治疗或预防多发性硬化的组合物。"由......组成"应指排除多于痕 量元素的其他成分和基本方法步骤。由这些过渡术语中每个所定义的实施方案都在本发明 的范围之内。
[0038] "生物相容的"意指递送系统的组分将不会导致组织损伤或对人生物学系 统的损伤。为了赋予生物相容性，将优先使用在人类中具有安全使用历史的或具有 GRAS(GenerallyAcceptedAsSafe，一般认为是安全的）状态的聚合物和赋形剂。生物相 容性意指在组合物中使用的成分和赋形剂最终将是"生物可吸收的"或被身体清除而对身 体无副作用。对于生物相容的且被视为无毒的组合物，其一定不会引起对细胞的毒性。类似 地，"生物可吸收的"指的是由在体内经过一段时间进行生物吸收的材料制成的纳米颗粒， 使得在患者中避免了材料的长期积累。在一个优选的实施方案中，生物相容的纳米颗粒是 经过少于2年，优选少于1年和甚至更优选少于6个月的一段时间而被生物吸收。生物吸 收的速率与颗粒的尺寸、所使用的材料以及本领域技术人员认识到的其他因素有关。可使 用可生物可吸收、生物相容材料的混合物以形成本发明中使用的纳米颗粒。在一个实施方 案中，可将氧化铁和生物相容的生物可吸收的聚合物相组合。例如，可将氧化铁和PGLA组 合以形成纳米颗粒。
[0039] 抗原-MHC-纳米颗粒复合物指的是在表面（例如生物相容的生物可降解的纳米 球）上呈递肽、碳水化合物、脂质或者抗原分子或蛋白质（即，自身肽或自身抗原）的其他 抗原区段、片段或表位。本文使用的"抗原"指的是在对象中可诱导免疫应答或扩增抗病原 体的细胞之分子的全部、部分、片段或区段。
[0040] 当在数值名称（例如温度、时间、数量和浓度，包括范围）之前使用术语"约"时， 表示可在⑴或㈠10%、5%或1 %变化的近似值。
[0041] "模拟物"是给定的配体或肽的类似物，其中所述类似物基本上类似于所述配体。 "基本上类似"意指除了模拟物具有一个或更多个官能团或修饰（其共同占小于约50%、小 于约40%、小于约30%、小于约20%、小于约10 %或小于约5%的配体分子量）之外，所述 类似物具有类似于配体的结合谱。
[0042] 多发性硬化（MS)也被称为"播散性硬化"、"播散性脑脊髓炎"或"变态性脑脊髓 炎"。MS是一种炎性疾病，其中围绕脑和脊髓的轴突的脂肪髓鞘被破坏从而导致脱髓鞘和形 成疤痕以及广谱的体征和症状。多发性硬化相关病症包括例如视神经脊髓炎（NMO)、葡萄膜 炎、神经性疼痛（neuropathispain)等。
[0043] "髓鞘少突胶质细胞糖蛋白"(MOG)是一种被认为在中枢神经系统（CNS)中神经髓 鞘形成的过程中重要的糖蛋白。在人类中，该蛋白质是由MOG基因编码的。推测其作为必 要的"粘附分子"为髓鞘提供结构完整性并且已知在少突胶质细胞的后期产生。GenBank登 录号NM_001008228. 2和NP_001008229. 1分别代表了MOG基因的mRNA和蛋白质序列。与 这些GenBank登录号中每一个相关的序列通过引用并入用于所有目的。
[0044] 术语"抗病原体的自身反应性T细胞"指的是具有抗病原体性质的T细胞（即对抗 MS的T细胞）。这些T细胞可包括抗炎性T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、低亲和力T细 胞、辅助性T细胞、自身调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、CD4+T细胞、CD8+T 细胞等。
[0045] 术语"抗炎性T细胞"指的是促进抗炎应答的T细胞。T细胞的抗炎功能可通过抗 炎蛋白、细胞因子、趋化因子等的产生和/或分泌来实现。抗炎蛋白还意在涵盖抑制免疫应 答的抗增殖信号。抗炎蛋白包括IL-4、IL-10、IL-13、IFN-a、TGF-0、IL-lra、G-CSF以及 TNF和IL-6的可溶性受体。在某些实施方案中，施用抗原-MHC纳米颗粒复合物导致有效治 疗多发性硬化之抗炎性T细胞的扩增和/或诱导增加。因此，本公开内容的多个方面涉及 用于在患者中治疗与MS相关炎症的方法，所述方法包括向该患者施用抗原-MHC-纳米颗粒 复合物，所述方法基本上由向该对象施用抗原-MHC-纳米颗粒复合物组成，或进一步所述 方法由向该对象施用抗原-MHC-纳米颗粒复合物组成，其中所述抗原是多发性硬化相关抗 原。
[0046] 术语"IL-10"或"白介素-10"指的是由IL-10基因所编码的细胞因子。所述IL-10 序列由GenBank登录号：NM_000572. 2 (mRNA)和NP_000563. 1 (蛋白）所表示。
[0047] 术语"TGF-0 "或"转化生长因子0 "指的是可具有抗炎作用的蛋白质。TGF-0 是一种分泌蛋白，其存在被称为TGF-M、TGF-02和TGF-03的至少三种同工型。这也 是TGF-0 1的原名，其是这个家族的创始成员（foundingmember)。TGF-0家族是被称为 转化生长因子0超家族的蛋白质超家族的一部分，其包括抑制素、激活素、抗苗勒管激素 (anti-milllerianhormone)、骨形态发生蛋白、生物皮肤生长因子（decapentaplegic)和 Vg-l〇
[0048] "有效量"是足以达到预期目的的量，所述预期目的的非限制性实例包括：免疫应 答的起始、免疫应答的调节、炎症反应的抑制和T细胞活性或T细胞群的调节。在一个方面， 有效量是作用以实现所述治疗目的的量，例如，治疗有效量。如本文详细描述的，有效量或 剂量取决于目的、组合物和组分，并且可根据本公开内容来确定。
[0049] 当在权利要求书和/或说明书中与术语"包括"一起使用时，词"一种"或"一个" 的使用可意指"一个/种"，但其也与"一个/种或更多个/种"、"至少一个/种"和"一个/ 种或多于一个/种"相一致。
[0050] 本文的"纳米球"、"NP"或"纳米颗粒"意指适当时，向对象、细胞样品或组织样品 单个或多个施用的小离散颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒基本上为球形。在某些实施 方案中，所述纳米颗粒不是脂质体或病毒颗粒。在另一些实施方案中，纳米颗粒是固体。如 本文所用的术语"基本上为球形"意指该颗粒的形状不偏离球体超过约10%。本发明多种 已知的抗原或肽复合物可应用于所述颗粒。本发明的纳米颗粒的尺寸为约lnm至约lym， 且优选地，约lnm至约100nm，并且在一些方面，当意指多个纳米颗粒时，指的是多个纳米颗 粒的平均直径或中值直径。例如，可通过分馏过程（由此使得较大的颗粒沉降在水性溶液 中）从而获得较小的纳米尺寸颗粒。然后，通过本领域技术人员已知的方法回收溶液的上 面部分。此上面部分被富集在较小尺寸的颗粒中。可重复该过程直到产生所期望的平均尺 寸。
[0051]在权利要求书中使用术语"或"用于指"和/或"，除非明确说明仅指替代方案或者 替代方案是互相排斥的，尽管公开内容支持所指的仅仅是替代方案以及"和/或"的定义。
[0052]如本文所用的短语"免疫应答"或其等同表达"免疫学应答"指的是细胞介导的应 答（由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导）的产生。通过呈递与I类或II类MHC分子 缔合的多肽表位以激活抗原特异性CD4+辅助T细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞而引起细 胞免疫应答。所述应答还可包括激活其他组分。
[0053]如本文所使用的术语"炎性应答"和"炎症"表示个体血管组织对有害刺激（例如 病原体、受损细胞或刺激物）的复杂的生物应答，并包括分泌细胞因子，更特别为促炎性细 胞因子，即由激活的免疫细胞主要产生并参与炎症反应放大的细胞因子。示例性的促炎性 细胞因子包括但不限于：IL_1、IL-6、TNF-a、IL-17、IL21、IL23和TGF-0。示例性的炎症 包括急性炎症和慢性炎症。急性炎症表示以由于通过血浆和白细胞的组织浸润引起的炎症 的经典体征（肿胀、发红、疼痛、发热和功能丧失）为特征的短期过程。只要存在损伤刺激通 常就会发生急性炎症，并且一旦所述刺激被移除、破坏或由瘢痕（纤维化）隔开（wallof) 时则停止。慢性炎症表示以并发的活跃性炎症、组织破坏并且试图修复为特征的病症。慢 性炎症并不以上面列出的急性炎症的经典体征为特征。相反地，慢性发炎的组织以单核免 疫细胞（单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞）的浸润、组织破坏和试图愈合（其包括 血管发生和纤维化）为特征。从在本公开内容