用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的c1orf32的制作方法

专利名称：用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的c1orf32的制作方法
用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的C10RF32发明领域
本发明涉及一种新颖蛋白，以及其变体、片段以及融合蛋白，以及将其用于免疫疗法和药物开发的方法。
发明背景
诱导免疫耐受性已经长时间被认为是自身免疫疾病疗法的“圣杯”。免疫系统具有针对入侵病原体保护宿主，但同时防止对于自身抗原的不想要的反应所导致的损害的彼此相反的任务。后一部分被称为免疫耐受性并且通过调节免疫应答的一组复杂的相互作用的并且互补的通路来进行。T细胞具有与自身以及非自身的各种抗原起反应的能力。因此，现存许多天然地存在以便消除潜在自身反应性应答的机制一这被称为天然耐受性。消除潜在自身反应性T细胞的主要机制在胸腺中出现并且被称为中心耐受性。一些潜在自身反应性 T细胞逃避中心耐受性，并且因此还存在多种周围耐受性机制。尽管存在这些机制，一些自身反应性T细胞可能‘逃避’并且以集合状态(repertoire)存在；据信它们的活化可以导致自身免疫疾病。
对于治疗耐受性的研究已经尝试诱导并且扩大有效的生理性耐受机制以便消除或中和自身反应性T细胞并且预防或治疗自身免疫疾病。诱导耐受性的一种方法是通过操纵共刺激配体与抗原呈递细胞(APC)以及淋巴细胞上的受体之间的相互作用。
CTLA-4是下调免疫应答的最广泛研究的共刺激分子。免疫抑制品质以及能够诱导耐受性的属性使它被公认为用于自身免疫介导的炎症病症的潜在免疫治疗剂。阿巴西普(Abatacept ;商品名称奥瑞希纳(Orencia))是由与hlgGl的Fe片段融合的CTLA-4的 ECD (细胞外域)组成的融合蛋白。据信阿巴西普可通过有效地干扰炎症级联来诱导共刺激阻断，它已经被批准用于治疗患有类风湿性关节炎的患者。
用当前疗法来诱导疾病控制，随后在重新建立免疫耐受性的同时逐渐撤药，可能在未来成为用于自身免疫疗法的有吸引力的方法。此外，由于它们的免疫特异性，在不存在整体免疫抑制的情况下，这类疗法对于长期使用应是安全的。
多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种慢性、炎症性、脱髓鞘性病症，它涉及对于髓磷脂抗原的自身免疫应答。它的特征在于CNS内的病变并且脱髓鞘是这些病变的关键特征。自身反应性T细胞被认为引起针对CNS髓磷脂组分的自身免疫应答。这些自身免疫反应的主要目标被认为是髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)以及髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE )，一种通过用佐剂中的髓磷脂组分进行免疫接种来诱导的MS动物模型，展示了可比较的神经元病变 。不希望受单一假设限制，EAE中的研究提供了特异性针对自身抗原的T细胞介导这些疾病中的病变的令人信服的证据。
T辅助I型(Thl)细胞由IL-12诱导并且产生IFN- Y，而T辅助2型(Th2)细胞分泌 IL-4、IL-5以及IL-13。Thl细胞可以介导促炎症性或细胞介导性免疫应答，而Th2细胞主要促进某些类型的体液免疫。一些免疫相关疾病，例如自身免疫反应、炎症、慢性感染以及败血症的特征在于免疫系统的促炎症性相对于抗炎症性倾向的失调，连同Thl相对于Th2 细胞因子平衡的失衡。在炎症期间，诱导从Thl到Th2的平衡转变通过减少免疫系统的炎症性倾向来保护有机体免受Thl/促炎症性细胞因子的全身性‘过调节(overshooting)’。 与Thl到Th2免疫转变相关的免疫调节疗法在多种Thl介导的自身免疫疾病，例如多发性硬化以及类风湿性关节炎中具有保护性作用。例如，在包括MS的若干自身免疫疾病的动物模型中已经证明了功效的拉喹莫德(Laquinimod)展示出通过Thl/Th2转变实现的免疫调节作用，并且不导致免疫抑制。乙酸格拉替雷(Glatiramer acetate ;克帕松(Copaxone)) 也诱导Thl/Th2转变，同时减少促炎症细胞因子的分泌，而增加抗炎症细胞因子的分泌。此外，乙酸格拉替雷特异性Th2细胞能够迁移越过血脑屏障并且引起自身攻击性ThlT细胞的原位旁观者抑制(bystander suppression)。
某些免疫细胞以及免疫细胞信号转导通路是用于治疗免疫病症的新药剂的有希望的靶点。例如Thl、Thl7、Th2以及调控T细胞(Treg)在调节自身免疫性以及炎症中发挥重要作用。来自许多研究的越来越多的证据显示，这些免疫细胞在多种病症，例如类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化、牛皮癣、红斑狼疮、I型糖尿病以及葡萄膜炎中的重要性。 大多数现有疗法一次只靶向一个通路。
发明简要概述
背景技术未能提供靶向在自身免疫性以及炎症中所涉及的多个细胞以及通路的疗法，这些细胞例如Thl、Thl7、Th22、Th2、Treg或者分泌或影响其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子例如细胞因子、金属蛋白酶、趋化因子以及其他分子。
本发明关于新颖蛋白，以及其变体、片段以及融合蛋白，以及将其用于免疫疗法和药物开发的方法，包括但不局限于治疗免疫相关疾病的方法。
如在此使用，术语“免疫相关疾病”包括以下疾病的如下列出类型以及亚型的任何一种多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、牛皮癣、全身红斑狼疮、炎症性肠病、葡萄膜炎或舍格伦氏综合征(Djogren’ s syndrome)。
如在此使用，“多发性硬化”包括以下一种或多种多发性硬化、良性多发性硬化、 复发缓解性多发性硬化、继发性进行性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化、进行性复发性多发性硬化、慢性进行性多发性硬化、过渡性/进行性多发性硬化、快速恶化性多发性硬化、临床确诊的多发性硬化、恶性多发性硬化(又称为马尔堡变种(Marburg’s Variant)), 以及急性多发性硬化。任选地，“与多发性硬化有关的病状”包括例如德维克氏病(Devic’s disease)，又称为视神经脊髓炎；急性散播性脑脊髓炎、急性脱髓鞘性视神经炎、脱髓鞘横贯性脊髓炎、米勒_费歇尔综合征(Miller-Fisher syndrome)、脑脊髓神经根神经病变、急性脱髓鞘多神经病、肿胀性多发性硬化以及Balo同心圆性硬化。
如在此使用，“类风湿性关节炎”包括以下一种或多种类风湿性关节炎、痛风以及假性痛风、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、斯提耳氏病(Still’s disease)、 强直性脊柱炎、类风湿性脉管炎。任选地，与类风湿性关节炎有关的病状包括例如骨关 节炎、肉状瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、脓毒性关节炎、血色病、肝炎、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、莱姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海热、具有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关周期性综合征，以及与炎症性肠病相关的肠病性关节炎。
如在此使用，“葡萄膜炎”包括以下一种或多种葡萄膜炎、前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间葡萄膜炎(扁平部睫状体炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)以及全葡萄膜炎形式。
如在此使用，“炎症性肠病”包括以下一种或多种炎症性肠病、克罗恩氏病 (Crohn’s disease)、溃瘍性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、贝切特氏病(Behcet’s disease)、未确定的结肠炎。
如在 此使用，“牛皮癣”包括以下一种或多种牛皮癣；非脓疱性牛皮癣，包括寻常性牛皮癣以及牛皮癣性红皮症(红皮性牛皮癣)；脓疱性牛皮癣，包括泛发性脓疱性牛皮癣 (宗布什脓疱性牛皮癖(pustular psoriasis ofvon Zumbusch))、掌妬脓疱病(永久性掌妬脓疱病、理发师类型的脓疱性牛皮癖(pustular psoriasis of the Barber type)、四肢脓疱性牛皮癣)、环状脓疱性牛皮癣、持续性肢端皮炎、疱疹样脓疱病。任选地，与牛皮癣有关的病状包括例如药物诱导的牛皮癣、皮褶牛皮癣、尿布区牛皮癣、脂溢性皮炎样牛皮癣、滴状牛皮癣、指甲牛皮癣、牛皮癣性关节炎。
如在此使用，“I型糖尿病”包括以下一种或多种1型糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、特发性糖尿病、幼年I型糖尿病、青春晚期糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、妊娠糖尿病。与I型糖尿病有关的病状包括神经病变，包括多神经病变、单神经病变、周围神经病变以及自主神经病变；眼睛并发症青光眼、白内障、视网膜病。
如在此使用，“舍格伦氏综合征”包括以下一种或多种舍格伦氏综合征、原发性舍格伦氏综合征以及继发性舍格伦氏综合征，以及与舍格伦氏综合征有关的病状，包括结缔组织疾病，例如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或硬皮病。其他并发症包括肺炎，肺纤维化，间质性肾炎，肾脏过滤器周围组织的炎症，肾小球性肾炎，肾小管性酸中毒，腕管综合征，周围神经病变，颅神经病变，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝脏的炎症(包括肝炎)，多肌炎，雷诺氏现象(Raynaud’s phenomenon),脉管炎，自身免疫甲状腺问题，淋巴瘤。
如在此使用，“全身性红斑狼疮”包括以下一种或多种全身性红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮性关节炎、狼疮性肺炎、狼疮性肾炎。与全身性红斑狼疮有关的病状包括骨关节结核、抗磷脂抗体综合征、心脏各个部分的炎症(例如心包炎、心肌炎以及心内膜炎)、肺以及胸膜炎症、胸膜炎、胸膜腔积液、慢性弥散性间质性肺病、肺动脉高压、肺栓塞、肺出血，以及肺萎缩综合征、狼疮性头痛、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病变、多发性单神经炎、重症肌无力、脊髓病变、颅神经病变、多神经病变、脉管炎。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是C10RF32多肽，任选地被提供为含有 C10RF32多肽的融合蛋白。C10RF32融合多肽任选地具有直接或间接地经由肽连接物序列或化学连接物融合在一起的第一融合伴侣与第二融合伴侣该第一融合伴侣包括C10RF32 可溶性多肽的全部或一部分，或包括H19011_1_P8 (SEQ ID号4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 号6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 号34)的细胞外域的全部或一部分的多肽或与它同源的序列，该第二融合伴侣由异源序列(对应地非C10RF32) 组成。
根据至少一些实施方案，分离的多肽与包括H19011_1_P8 (SEQ ID号4)、H19011丄P8_V1 (SEQ ID 号5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 号6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的细胞外域的全部或一部分的多肽至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。 根据至少一些实施方案，与包括 H19011_1_P8 (SEQ ID 号4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 号6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 号34)的细胞外域的全部或一部分的多肽至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源的分离的多肽具有如在此描述的(例如在实例I中)至少一种SNP变化。C10RF32多肽可为任何物种来源。在进一步的实施方案中，C10RF32多肽为鼠科、非人灵长类动物或人类来源。
不希望受单一假设限制，根据至少一些实施方案，C10RF32融合蛋白抑制Thl、 Thl7、Th22或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的炎症活性，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。 再次不希望受单一假设限制，根据至少一些实施方案，C10RF32融合蛋白还可增加Treg的抑制能力或Th2细胞的免疫调节活性。C10RF32融合蛋白还可增加抗炎症分子，例如细胞因子IL-10的产生。
根据至少一些实施方案，C10RF32融合蛋白可任选地包括C10RF32的完全细胞外域(E⑶)或其片段或同源物。在一个实施方案中，C10RF32多肽为全长C10RF32E⑶的可溶性片段。这类片段任选地包括保持结合至其天然受体的能力并且合并有C10RF32多肽的细胞外域的部分或全部、并且缺乏细胞内和/或跨膜域的部分或全部的那些片段。在一个实施方案中，C10RF32多肽片段包括C10RF32多肽的整个细胞外域。在其他实施方案中，C10RF32 多肽的可溶性片段是保持C10RF32生物活性的细胞外域的片段。
C10RF32多肽细胞外域可包括来自跨膜域的1、2、3、4、5或更多个连续氨基酸，和/ 或来自信号序列的1、2、3、4、5或更多个连续氨基酸。可替代地，该细胞外域可有1、2、3、4、5、或更多个连续氨基酸被从C-末端、N-末端或这两个末端去除。还可使用C10RF32多肽的生物活性变体和/或同源物及其片段。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是包括如在此描述的分离的C10RF32多肽的融合蛋白用于治疗免疫相关病症的用途，该融合蛋白任选地在包括药学上可接受的稀释剂或载体的药用组合物中。
在一个实施方案中，C10RF32多肽可任选地被融合至Ig重链恒定区的一个或多个域，该恒定区优选地具有与人免疫球蛋白Cy1、Cy2、Cy3*Cy4链的铰链，CH2以及CH3 区或与鼠免疫球蛋白C Y 2a链的铰链，CH2以及CH3区对应的氨基酸序列。
这些融合蛋白可任选地二聚化或多聚化以便形成同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。二聚/多聚伴侣可在平行或反平行方向上安排。任选地，融合蛋白具有在SEQ ID号8、22、23、38、29中的任何一个中阐明的序列。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种药用组合物，该药用组合物包括能够抑制T细胞活化的一种分离的可溶性C10RF32多肽、或其片段或变体或同源物，或含有它们的融合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂或载体。任选地，该药用组合物包括含有 H19011_1_ P8(SEQ ID 号4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID 号5)、H19011_1_P9(SEQ ID 号:6) 或H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的细胞外域的可溶性C10RF32多肽或其片段，以及药学上可接受的稀释剂或载体。根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种药用组合物， 该药用组合物包括一种分离的可溶性C10RF32多肽、或片段或变体或同源物或含有它们的融合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂或载体，该药用组合物被适配用于通过以下途径中的任何一个或多个来治疗炎症抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化；抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的活性；抑制或减少Thl和/或Thl7通路；抑制或减少Thl和/或 Thl7通路，同时促进Th2通路/活性/分化；抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的炎症分子产生和/或分泌；抑制或减少Thl、Thl7、 Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的增殖；与Treg相互作用；增强 Treg活性；增强Treg的IL-10分泌;增力口 Treg数量;增力口 Treg的抑制能力；与Th2细胞相互作用；增强Th2活性，增强Th2细胞的免疫调节能力，增加Th2细胞数，增强Th2细胞的 IL-4、IL-5或IL-10产生；或其组合。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种药用组合物，该药用组合物包括一种分离的可溶性C10RF32多肽、片段、变体或同源物或含有它们的融合蛋白或偶联物，以及药学上可接受的稀释剂或载体，该药用组合物被适配用于治疗免疫相关病症。
在一个实施方案中但是不希望受单一假设限制，C10RF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Treg对于免疫系统的抑制活性。Treg可抑制通过Thl、Thl7、Th22 和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌。在一个实施方案中，C10RF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强 Treg对于初始T细胞的抑制活性以便抑制或减少初始T细胞分化成Thl、Thl7、Th22细胞并且从而减少受试者中的Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的数量，这些炎症分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、 IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。
在一个实施方案中，C10RF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Th2 免疫应答活性或增加Th2细胞数。Th2细胞可调节Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，从而导致Thl和/或Thl7应答的抑制，以及经由Thl/Th2转变的免疫调节。在一个实施方案中， C10RF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Th2对于初始T细胞的免疫调节活性以便抑制或减少初始T细胞分化成Thl、Thl7、Th22细胞并且从而减少受试者的Thl、 Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的数量，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。 在一个实施方案中，C10RF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物促进或增强Th2细胞的IL-4、IL-5或IL-10产生。任选地，该组合物是用于治疗免疫相关病症。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是以下各项的用途一种分离的可溶性 C10RF32多肽、或片段或变体或同源物或含有它们的融合蛋白或偶联物，或包括H19011_l_ P8 (SEQ ID 号4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 号6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的细胞外域的多肽、或其片段或变体或同源物或含有它们的融合蛋白或偶联物，或含有前述任一种的药用组合物，上述各项被适配用于治疗免疫相关病症。
任选地，该多肽包含与 以下各项具有至少95%序列一致性的氨基酸残基的序列 与在SEQ ID号14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8 (SEQ ID号4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号:5)的残基21-186、或与在SEQ ID号15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号6)的残基21-169、或与在SEQ ID号36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_ Vl (SEQ ID号34)的残基21-169、或与在SEQ ID号37中描绘的氨基酸序列对应的序列 H19011_1_P8 (SEQ ID号4)的残基1-184、或与在SEQ ID号19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011丄P8_V1 (SEQ ID号5)的残基1-184、或与在SEQ ID号28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号6)的残基1-169、或与在SEQ ID号30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的残基1-169，或其片段或变体或同源物，这些序列被适配用于治疗免疫相关病症。任选地，该多肽附接至一个可检测的或治疗的部分上。
根据至少一个实施方案，提供的是通过向受试者给予有效量的一种可溶性 C10RF32多肽、其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物、或其药用组合物来抑制或减少受试者中中中的表位扩展的方法。进一步的实施方案提供给予有效量的可溶性C10RF32多肽、其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物或其药用组合物以便抑制或减少患有免疫相关病症的患者的表位扩展的方法。
C10RF32多肽、其片段、变体、同源物、融合蛋白和/或偶联物可结合一种或多种另外治疗剂来给予，这些另外治疗剂包括但不局限于，针对其他淋巴细胞表面标记(例如 ⑶40、α -4整联蛋白)或针对细胞因子的抗体；其他融合蛋白，例如CTLA4-lg( Orencia 、 贝拉西普(belatac印t))、TNFR-1i ( Lnbrel ) ; TNF- α阻断剂，例如英利昔单抗 (Remicade)、赛妥珠单抗(Cimzia)以及阿达木单抗(Humira) ;Q)73_Ig ;环磷酰胺(CTX) (gp E.ndoxan' 、Cytoxan 、Neosar 、Procytox 、Rev immune );甲氨喋呤(MTX)(即 Rheumatrex 、Trexall );贝利木单抗(belimumab ；即 Benlysta );那他珠单抗(Tysabri)或其他免疫抑制药物、抗增殖药物、细胞毒性剂、或可有助于免疫抑制的其他化合物。
在一个实施方案中，该额外治疗剂靶向免疫活化中涉及到的不同通路。在一个进一步的实施方案中，该另外治疗剂是一种CTLA-4融合蛋白，例如CTLA-41 g (阿巴西普(abatacept))。在一个进一步的实施方案中，该额外治疗剂是一种被称为贝拉西普的 CTLA4-1g融合蛋白，它含有在体内显著地增加其对于CD86的亲合力的两个氨基酸取代 (L104E 以及 A29Y)。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是环磷酰胺(CTX)。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白与CTX是以治疗慢性自身免疫疾病或病症，例如全身性红斑狼疮(SLE)的有效量共同给予的。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是甲氨喋呤(MTX)。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白与MTX是以治疗慢性自身免疫疾病或病症，例如类风湿性关节炎(RA)的有效量共同给予的。在另一个实施方案中，第二治疗剂增加血清中的腺苷量。
在一个进一步的实施方案中，第二治疗剂为⑶73-1g、重组⑶73或增加⑶73表达的另一种药剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)。在另 一个实施方案中，第二治疗剂是干扰素-β。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是那他珠单抗或用于MS的另一种治疗剂。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白与那他珠单抗轮转使用或在药物假期期间使用以便允许第二治疗剂给药的频率更低并且减少例如PML的副作用的风险并防止对于第二治疗剂的抗性。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的一种小分子。在另一个实施方案中，第二治疗剂是与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增强Treg的IL-10分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力、或其组合的一种小分子。 在一个实施方案中，该小分子是视黄酸或其衍生物。在另一个实施方案中，第二治疗剂是与 Th2细胞相互作用、增强Th2活性、促进或增强Th2细胞的IL-10、IL-4或IL-5产生、增加 Th2细胞数、增加Th2细胞的免疫调节能力、或其组合的一种小分子。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是如在此列举的一种C10RF32可溶性多肽与有效于治疗免疫相关病症的一种已知治疗剂的组合的用途。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种治疗免疫相关病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予一种药用组合物，该药用组合物包括一种具有C10RF32多肽的细胞外域的可溶性分子、或其片段或变体或同源物；或其融合蛋白或偶联物；或包括以下各项的多肽与在SEQ ID号14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8 (SEQ ID 号4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_l_ P8_V1 (SEQ ID号5)的残基21-186、或与在SEQ ID号15中描绘的氨基酸序列对应的 H19011丄P9 (SEQ ID号:6)的残基21-169、或与在SEQ ID号36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQID号34)的残基21-169、或与在SEQ ID号37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8 (SEQ ID号4)的残基1_184、或与在SEQ ID号19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1 (SEQ ID号5)的残基1-184、或与在SEQ ID 号28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号6)的残基1-169、或与在SEQ ID号30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的残基1-169，或序列H19011_1_P8_V1 (SEQ ID号5)的残基21-167，或其片段或变体或同源物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种预防MS患者的中枢神经系统的神经细胞的髓磷脂外层(myelin coat)损伤的方法，该方法包括向有需要的受试者给予一种药用组合物，该药用组合物包括一种具有C10RF32多肽的细胞外域的可溶性分子、或其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物；或包括以下各项的多肽与在SEQ ID号14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8 (SEQ ID号4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID 号35中描绘的氨基酸序列对应的H19011丄P8_V1 (SEQ ID号5)的残基21-186、或与在 SEQ ID号15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号6)的残基21-169、或与在SEQ ID号36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的残基 21-169、或与在SEQ ID号 37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8(SEQ ID号:4) 的残基1-184、或与在SEQ ID号19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID号5)的残基1-184、或与在SEQ ID号28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号6)的残基1-169、或与在SEQ ID号30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_l_ P9_V1 (SEQ ID号34)的残基1_169，或其片段或变体或同源物；任选地以药用组合物形式提供。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种治疗免疫相关病症的方法，其中该治疗不引起受试者的免疫系统的整体免疫抑制，该方法包括向有需要的受试者给予一种药用组合物，该药用组合物包括一种具有C10RF32多肽的细胞外域的可溶性分子、其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物；或包括以下各项的多肽与在SEQ ID号14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQ ID号4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号35 中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1 (SEQ ID号5)的残基21-186、或与在SEQ ID号15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号6)的残基21-169、或与在 SEQ ID号36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQID号34)的残基21-169、 或与在SEQ ID号37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8 (SEQ ID号4)的残基1-184、或与在SEQ ID号19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011丄P8_V1 (SEQ ID 号5)的残基1-184、或与在SEQ ID号28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号6)的残基1-169、或与在SEQ ID号30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的残基1-169，或其片段或变体或同源物；任选地以药用组合物形式提供。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种分离的可溶性C10RF32多肽、其片段、变体或同源物；任选地为融合蛋白或偶联物，其中所述多肽或所述融合蛋白或偶联物是用于如在此描述的免疫相关病状的抗免疫相关病状免疫疗法，任选地提供为药用组合物。
任选地，治疗包括预防、治愈、控制、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、管理或阻止上述疾病的有害作用的这些项中的一个或多个。
任选地，管理包括降低疾病的严重度、减少疾病发作频率、减少这类发作的持续时间、或减少这类发作的严重度、或其组合。
在另一个实施方案中，这些C10RF32多肽、其片段或变体或同源物、包含它们的融合蛋白或偶联物，或包含它们的药用组合物可用于治疗不对TNF阻断剂起·反应的患者。
附图简要说明


图1A示出H19011_1_P8 (SEQ ID号4)蛋白与已知蛋白Q71H61_人类以及 NP_955383 (SEQ ID 号:3)的比对。
图1B示出H19011_1_P9 (SEQ ID号6)蛋白与已知蛋白Q71H61_人类以及 NP_955383 (SEQ ID 号:3)的比对。
图2 示出 C10RF32_T8_P8_Vl_ECD_mFc (在此又称为 C10RF32_ECD_mFc) DNA 序列 (1287bp) (SEQ ID号7)。ECD序列以粗体标明，TEV裂解位点序列加下划线，mFc序列为非粗斜体并且信号肽序列为粗斜体。
图3 示出 C10RF32_T8_P8_Vl_ECD_mFc (在此又称为 C10RF32_ECD_mFc)氨基酸序列(428aa) (SEQ ID号8)。ECD序列以粗体标明，TEV裂解位点序列加下划线并且由TEV 序列的N-末端上的GS连接物以及TEV序列的C-末端上的SG包围，mFc序列为非粗斜体并且信号肽序列为粗斜体。
图4不出从疾病诱导日开始以两种剂量(30和100微克/小鼠)以及两种频率(每天一次或每周3次)在预防模式下给予的C10RF32-P8-V1-E⑶-mFc (SEQ ID号8)的六次给予对于小鼠R-EAE模型的临床症状的效果，展示为平均临床计分(图4A)、累积临床计分(图4B)以及复发频率(图4C)。在此项研究中，与给予连续6天的Ig对照(100微克/小鼠) 以及NM-抗-CD3 (50微克/小鼠)比较来研究C10RF32-P8-Vl-ECD-mFc (SEQ ID号8)的效果。
图5示出疾病缓解发生时(第25天)以两种剂量(30和100微克/小鼠)以及两种频率(每天一次或每周3次)在治疗模式下给予的C10RF32-P8-V1-E⑶-mFc (SEQ ID号8) 的六次给予对于SJL小鼠中的PLP139-151-诱导R-EAE模型的临床症状的效果，展示为平均临床计分(图5A)、累积临床计分(图5B)以及复发频率(图5C)。在此项研究中，与给予连续6天的Ig对照(100微克/小鼠)以及抗-CD80FaB比较来研究C10RF32-P8-Vl-ECD_mFc (SEQ ID号:8)的效果。
图6 示出与对照 Ig 以及 B7-H4-1g 比较，C10RF32-ECD_mFc (SEQ ID 号8)治疗对于来源于SJL或BALB/c小鼠的T细胞增殖的效果。
图7示出以可溶性或结合至板亦或珠粒形式呈现的C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID 号8)对于从SJL小鼠分离的初始CD4+T细胞的增殖以及细胞因子分泌的体外效果。
图8示出以可溶性或结合至板或珠粒形式呈现的C10RF32-E⑶-mFc(SEQ ID号8) 对于从BALB/c小鼠分离的初始CD4+T细胞的增殖以及细胞因子分泌的体外效果。
图9示出在以连同抗-⑶3以及抗-⑶28的珠粒结合形式呈现时，以及在以可溶性蛋白形式添加至经过照射的从DO. 11小鼠分离的APC+0VA323_339时，C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID号8)对于在ThO、Thl、Th2以及Thl7促进条件下的T细胞活化以及分化的效果。
图 10 示出在 HEK-293 中产生的 C10RF32-ECD_mFc(SEQ ID 号8)在小鼠 R-EAE 模型中的效果。C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID号8)在疾病诱导后第0_5天经由腹膜内(1. ρ·) 注射在预防模式下给予。
图 11 示出在 CHO 以及 HEK-293 中产生的 C10RF32-ECD_mFc (SEQ ID 号8)对于在ThO、ThU Th2以及Thl7衍生条件下的⑶4+T细胞增殖以及细胞因子产生的体外活性的比较。
图12示出在治疗模式下每周3次1. p.给予历时两周的C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID号8)在SJL小鼠的PLP139-151-诱导R-EAE中的效果。展示了对于以下各项的效果 平均临床计分、累积临床计分以及复发频率(图12A);免疫细胞到脾、淋巴结以及CNS的募集(图12B);免疫细胞群对CNS的浸润(图12C);经由增殖实现的脾细胞对于起始以及扩展表位的回忆应答(图12D);经由细胞因子分泌实现的脾细胞对于起始以及扩展表位的回忆应答(图12E);经由增殖实现的颈部淋巴结细胞对于起始表位的回忆应答(图12F)。在此项研究中，与Ig对照(100微克/小鼠)以及抗-⑶80Fab (50微克/小鼠)比较来研究 C10RF32-P8-Vl-ECD-mFc (SEQ ID 号8)的效果。
图13A 示出与 Ig 对照比较，C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID 号8)在 100、30 以及 10微克/小鼠下每周3次1. P.给予历时2周在SJL小鼠的PLP139-151-诱导R-EAE中的治疗性治疗的剂量应答效果。呈现了以平均临床计分来表现的临床疗效(图13A);还估计了如以上在100和30微克/小鼠下给予的C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID号8)对于以下各项的效果在R-EAE诱导之后第35天进行的 对于诱导表位(PLP139-151)或扩展表位(PLP178-191)的DTH应答(图13B)，在R-EAE诱导之后第35天的回忆应答，表现为响应诱导表位(PLP139-151)、扩展表位(PLP178-191)以及抗CD3的淋巴结细胞(图13C)或脾细胞(图13D)的增殖；在R-EAE诱导后第65天进行的对于扩展表位(PLP178-191以及 MBP84-104)的DTH应答(图13E)，以及在R-EAE诱导之后第65天的回忆应答，表现为响应抗 CD3、0VA323-339、诱导表位(PLP139-151)以及扩展表位(PLP178-191 以及 MBP84-104) 的脾细胞的增殖。
图14示出在过继转移模型中在细胞转移时给予时C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID 号8)或对照Ig治疗对于R-EAE发展(图14A)以及将总免疫细胞(图14B)和自身反应T 细胞(图14C)募集到脾、淋巴结以及CNS的效果。
图15和图16示出C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID号8)对于来自不同人类供体的人 T细胞活化的效果，这种活化表现为细胞增殖以及IFNy分泌。使用以C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID号8)、抗⑶3以及抗⑶28涂布的珠粒在一步法(图15)或两步法(图16)中进行活化。
图17示出C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID号8)对于人T细胞增殖的效果的剂量依赖性。
图18示出C10RF32-ECD-mFc(SEQ ID号8)以及对照Ig对于来自不同供体的纯化的人T细胞的增殖的效果，这些T细胞由以抗-⑶3以及抗-⑶28抗体连同C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID号8)涂布的珠粒来活化。
图19示出C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID号8)以及对照Ig对于来自不同供体的纯化的人T细胞的增殖的效果，这些T细胞由经过照射的自体PBMC以及抗-⑶3和抗-⑶28 抗体来活化。
图20示出每周3次以100或30微克/小鼠1. p.给予历时10天的 C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID号8)在类风湿性关节炎的胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的治疗效果。测量的是临床计分(A)、脚爪肿胀(B)以及患病脚爪数量(C)。益赛普(Enbrel) (TNF-R-1g, 100微克/小鼠)用作阳性对照，而对照Ig (100微克/小鼠)用作阴性对照。
图 21 示出1. 5 和 5mg/kg 下的 C10RF32-P8-Vl-ECD_mFc (SEQ IDEnbrel :8)在转移体内测定中对于DTH的效果，表现为与同种型对照(mlgG2a，5mg/kg)或媒介物(PBS)治疗的小鼠比较的脚爪厚度的变化(Λ )，如图中详述。FK506在3和30mg/kg的剂量下用作阳性对照。在注射从4个不同供体汇集的PBMC后获得的结果在图21A中示出，注射来自每个供体的PBMC时获得的单独数据呈现于图21B和图21C中。
图22 示出 C10 RF32-P8-Vl-ECD-mFc (SEQ ID 号8)对于脾细胞的 IFN Y (A 和 B)、IL-2 (C和D)以及IL-4 (E和F)产生的效果，这些脾细胞在板结合抗-⑶3以及可溶性抗-⑶28的存在下被刺激24小时。FK506和B7-H4_Ig用作阳性对照，mIgG2a用作阴性对照。对于每个细胞因子，提供两个研究的结果，在图上标记为研究I和2。
本发明的详细说明
本发明在至少一些实施方案中涉及以下各项中的任何一个被称为C10RF32的蛋白、其片段、变体以及同源物以及含有它们的融合蛋白和偶联物，以及包含它们的药用组合物，以及编码它们的核酸序列，以及其作为治疗在此描述的免疫相关病症的治疗剂的用途， 包括但不局限于C10RF32蛋白的ECD (细胞外域)、其片段和/或变体和/或同源物(单独或作为融合蛋白或偶联物的一部分)的用途。
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。额外的定义贯穿详细说明而阐明。
如在此使用，术语“分离的”是指处于与化合物天然地发生于其中的环境不同的环境中的所感兴趣的化合物(例如多核苷酸或多肽)，例如，像通过将肽浓缩至它在天然状态下不存在的浓度来从其天然环境中分离。“分离的”包括样品内基本上富含所感兴趣的化合物和/或其中所感兴趣的化合物是部分或基本上纯化的化合物。
“免疫细胞”是指来自造血来源的任何细胞，包括但不局限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞以及巨噬细胞。
如在此使用，术语“多肽”是指具有任何长度的氨基酸链，而无论是否修饰(例如， 磷酸化或糖基化)。
如在此使用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”是在与T细胞上的细胞表面分子相互作用时调节T细胞应答的一种多肽。
如在此使用，“共刺激信号传导”是在抗原特异性T细胞应答期间在抗原呈递细胞上的共刺激多肽与其在T细胞上的受体之间的相互作用所产生的信号传导活性。不希望受单一假设限制，据信该抗原特异性T细胞应答由两种信号介导，即I) T细胞受体(TCR)与在 MHC背景下呈递的抗原性肽的接合(信号1)，以及2)在不同的共刺激受体/配体对之间的接触所递送的第二个抗原非依赖性信号(信号2)。不希望受单一假设限制，此“第二信号” 在确定T细胞应答类型(活化与抑制)以及这种应答的强度和持续时间方面是关键性的，并且受来自例如B7蛋白家族的共刺激分子的正以及负信号来调节。
如在此使用，术语“B7”多肽是指会共刺激T细胞的B7蛋白家族的成员，包括但不局限于 B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3 以及其生物活性片段和/或变体。代表性生物活性片段包括会共刺激T细胞的细胞外域或细胞外域片段。
如在此使用，“炎症分子”是指诱导炎症应答(直接或间接地)的分子，包括但不局限于细胞因子以及金属蛋白酶，例如包括但不局限于IL-1 β、TNF-α、TGF-β、IFN-Y、 IL-17、IL-6、IL-23、IL-22, IL-21 以及 MMP。
如在此使用，“载体”是另一个DNA片段可插入其中以便引起所插入片段复制的复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒。在此描述的载体可为表达载体。如在此使用，“表达载体” 是包含一个或多个表达控制序列的载体。
如在此使用，“表达控制序列”是控制并且调节另一个DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
“可操作地连接”是指其中所描述的部件经过配置以便进行其常用或预期功能的元件安排。因此，可操作连接在一起的两个不同多肽在物理上连接在一起的同时保持其相应的生物功能。
如在此使用，“效价”是指每个分子可利用的结合位点的数量。
如在此使用，“变体”多肽与对应野生型多肽的氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸序列改变。
如在此使用，“保守”氨基酸取代是其中取代的氨基酸具有类似结构或化学特性的取代。如在此使用，术语“宿主细胞”是指重组载体可引入其中的原核和真核细胞。
如在此使用，“转 化的”以及“转染的”包括通过在本领域中已知的许多技术将核酸(例如载体)引入细胞中。
如在此使用，术语“免疫性(immunologic)”、“免疫学(immunological)”或“免疫 (immune)”应答是在接受患者体内针对肽的有益的体液性(抗体介导)和/或细胞性(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)应答的发展。这种应答可为通过给予免疫原来诱导的主动应答或通过给予抗体或致敏T-细胞来诱导的被动应答。不希望受单一假设限制，细胞免疫应答通过结合I类或II类MHC分子来呈递多肽表位以便活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引起。该应答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化、嗜中性粒细胞或先天性免疫的其他组分的活化或募集。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4+T 细胞)或CTL (细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对于免疫原的保护或治疗效果的相对贡献可通过单独地将抗体以及T-细胞从免疫接种的同系动物中分离并且测量在第二受试者中的保护或治疗效果来区分。
“免疫剂”或“免疫原”能够在任选地结合佐剂来给予至哺乳动物时诱导针对本身的免疫应答。
如在此使用，术语“C10RF32”是指由在此报告的H19011_1_T8 (SEQ ID号1)、 H19011_1_T9 (SEQ ID号2)转录物中的任何一个所编码的蛋白，尤其指如在H19011_1_P8 (SEQ ID 号4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID 号:5)、H19011_1_P9(SEQ ID 号6)或 H19011_l_ P9_V1 (SEQ ID号34)中任何一个所阐明的蛋白、其变体及片段，这些蛋白对于免疫相关病症可以具有治疗效果。如在此使用，术语C10RF32片段和/或C10RF32变体和/或C10RF32 同源物是指包括具有抑制T细胞活化的生物活性的氨基酸序列的C10RF32部分。
如在此使用，术语“可溶性C10RF32”或“可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或“可溶性C10RF32蛋白/分子”是指包括C10RF32多肽的细胞外域的一部分或全部、并且缺乏细胞内和/或跨膜域的一部分或全部的C10RF32片段，其中所述片段保持抑制T细胞活化的生物活性。在一个实施方案中，可溶性C10RF32多肽片段包括C10RF32多肽的整个细胞外域。在其他实施方案中，C10RF32多肽的可溶性片段包括细胞外域的片段。
如在此使用，术语“可溶性C10RF32”或“可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或“可溶性C10RF32蛋白/分子”进一步是指非细胞表面结合的(即循环的)C10RF32分子或C10RF32 分子的任何部分，包括但不局限于C10RF32多肽、其片段或融合蛋白；其中C10RF32的细胞外域融合至使得融合分子可溶的免疫球蛋白(Ig)部分的融合蛋白、或其片段及衍生物； C10RF32的细胞外域与例如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关抗原p97或HIV包膜蛋白的生物活性或化学活性蛋白的一部分融合或连接的蛋白、或其片段及衍生物；例如 C10RF32多肽的杂合(嵌合)融合蛋白、其片段或融合蛋白，或其片段及衍生物。“可溶性 C10RF32蛋白/分子”还包括跨膜域被去除以便使得蛋白可溶的C10RF32分子、或其片段及衍生物；以及可溶性C10RF32突变分子。用于本发明方法中的可溶性C10RF32分子可包括或可不包括信号(前导)肽序列。
术语C10RF32的“可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或“可溶性”形式还指编码 C10RF32 “可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或 “可溶性C10RF32蛋白/分子”的对应蛋白的核酸序列。任选地，C10RF32ECD是指以下多肽序列或其片段中的任何一个
>H19011_1_P8 (SEQ ID 号4)残基 21 至 186，与以下 SEQ ID 号14 中描绘的氨基酸序列对应
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWD PYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLL VLGRTGLLADLLPSFAVEIMPE ；
>H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号5)残基 21-186，与以下 SEQ ID 号35 中描绘的氨基酸序列对应 LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNL EWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVE LLVLGRTGLLADLLPSFAVEIMPE ；
>H19011_1_P9 (SEQ ID 号6)残基 21 至 169，与以下 SEQ ID 号15 中描绘的氨基酸序列对应
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWD PYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLL VLEffV ；
>H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 号34)残基 21 至 169，与以下 SEQ ID 号36 中描绘的氨基酸序列对应
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHF STS SHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEW DPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVELL VLEffV ；
>H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号5)残基 I 至 184，与以下 SEQ ID 号19 中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRffISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQffKFKSYCQDRMGES LGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCI ITTPDDLEGKNEDSVELLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM ；
>H19011_1_P8 (SEQ ID号4)残基I至184，与以下SEQ ID号37中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRWISLFWLT·AMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGES LGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCI ITTPDDLEGKNEGSLGLLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM ；
>H19011丄P9 (SEQ ID号6)残基1-169，与以下SEQ ID号:28中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRffISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQffKFKSYCQDRMGE SLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYY ClITTPDDLEGKNEGSLGLLVLEffV ；
H19011丄P9_V1 (SEQ ID 号34)残基 1-169，与以下 SEQ ID 号30 中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRffISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQffKFKSYCQDRMGE SLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYY CIITTPDDLEGKNED SVELLVLEffV, <0}
以及其具有与其至少80%序列一致性、更优选至少90%序列一致性并且甚至更优选与其至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的变体。根据至少一些实施方案，与包含 H19011_1_P8(SEQ ID 号4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID 号5)、H19011_1_P9(SEQ ID 号:6) 或H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的细胞外域的全部或一部分的多肽至少80%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%同源的分离的多肽具有如在实例I中在此描述的至少一种SNP变化。
C10RF32细胞外域可含有来自C10RF32的信号肽或假定跨膜域的一个或多个氨基酸。在分泌期间，裂解的信号肽的氨基酸数量可取决于表达系统以及宿主而变化。另外或可替代地，失去C-末端或N-末端的一个或多个氨基酸的保持结合至C10RF32受体的能力的C10RF32细胞外域的片段可用作所披露融合蛋白的融合伴侣。
C10RF32多肽的变体
这类C10RF32多肽的有用变体包括如在此描述的任何测定所指示增加生物活性， 或增加该蛋白的半衰期或稳定性的那些变体。可溶性C10RF32多肽以及其具有C10RF32活性的C10RF32片段或融合物可经过工程化以便增加生物活性。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽或融合蛋白是通过增加该分子与免疫细胞，例如T细胞的结合并且将一个抑制信号传输至该T细胞中的至少一种氨基酸取代、缺失或插入来修饰的。
其他任选的变体是经过工程化以便相对于其他免疫细胞选择性地结合至一种类型T细胞的那些C10RF32多肽。例如，C10RF32多肽可经过工程化以便任选地结合至Treg、 ThO、Thl、Thl7、Th2或Th22细胞。优先结合是指对于一种类型的细胞超过另一种类型的细胞至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更大的结合。
C10RF32的又其他变体可经过工程化以便相对于野生型C10RF32具有降低的与免疫细胞的结合。这些变体可与具有更强的结合特性的变体组合使用以便以中度影响来调节免疫应答。
还任选地，变体C10RF32多肽可经过工程化以便相对于野生型具有增加的半衰期。这些变体通常经过修饰以便抵抗酶性降解。示例性修饰包括抵抗酶性降解的修饰的氨基酸残基以及修饰的肽键。实现这一目的的各种修饰是本领域中已知的。
融合蛋白
根据至少一些实施方案，C10RF32融合多肽具有包括C10RF32蛋白的全部或一部分的第一融合伴侣，该第一融合伴侣融合至第二多肽，融合是直接的或经由适用于连接这两种蛋白的连接物肽序列或化学连接物的。C10RF32多肽可任选地融合至第二多肽以便形成在此描述的融合蛋白。该第二多肽的存在可改变C10RF32融合多肽的溶解性、稳定性、亲和力和/或效价。如在此使用，“效价”是指每个分子可利用的结合位点的数量。在一个实施方案中，该第二多肽是来自不同来源或不同蛋白的多肽。
根据至少一些实施方案，C10RF32蛋白或片段针对其在此描述的治疗免疫相关病症的活性来加以选择。
在一个实施方案中，第二多肽含有一个免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个域， 该恒定区优选地具有与人免疫球蛋白Cy1、Cy2、Cy3*Cy4链的铰链、CH2以及CH3区或与鼠免疫球蛋白C Y 2a链的铰链、CH2以及CH3区对应的氨基酸序列。SEQ ID号20提供人免疫 球蛋白C Y I的铰链、CH2以及CH3区的示例性序列。
根据至少一些实施方案，该融合蛋白是一种二聚体融合蛋白。在一个任选的二聚体融合蛋白中，二聚体由两个Ig重链的铰链区中的Cys残基的共价键结产生，这些Cys残基是二聚化的正常Ig重链中以二硫键连接的相同Cys残基。这类蛋白被称为C10RF32多肽、其片段或融合蛋白。
在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定域可含有增强C10RF32多肽、其融合蛋白或片段的与具体细胞类型的结合、增加其生物利用度或增加其稳定性的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。适合的氨基酸取代包括如上所述的保守以及非保守取代。
这些融合蛋白 任选地含有起作用以便使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的一个域。肽/多肽连接物域可为一个单独的域，亦或可替代地可包含于融合蛋白的一个其他域(C10RF32多肽或第二多肽)中。同样地，起作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的这个域可为一个单独的域，亦或可替代地可包含于融合蛋白的一个其他域(C10RF32多肽、 第二多肽或肽/多肽连接物域)中。在一个实施方案中，二聚化/多聚化域以及肽/多肽连接物域是相同的。二聚化/多聚化域以及连接物的进一步的具体、说明性以及非限制实例在下文给出。
根据本发明的至少一些实施方案在此披露的融合蛋白具有化学式1: N-R1-R2-R3-C，其中“N”代表融合蛋白的N-末端，“C”代表融合蛋白的C-末端。在进一步的实施方案中，“R1”是C10RF32多肽，“R2”是任选的肽/多肽或化学连接物域，并且“R3” 是第二多肽。可替代地，R3可为C10RF32多肽并且Rl可为第二多肽。
任选地，融合蛋白包含任选地通过具有一个或多个氨基酸的连接物肽(例如GS)融合至一个或多个“半衰期延长部分”的在此描述的C10RF32多肽片段。“半衰期延长部分” 是在附接至蛋白上时延长这种蛋白在受试者体内(例如受试者血浆内)的体内半衰期的任何部分，例如多肽、小分子或聚合物。例如，半衰期延长部分在本发明的一个实施方案中是聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG (mPEG)或免疫球蛋白(Ig)。在本发明的一个实施方案中， PEG是5、10、12、20、30、40或50kDa部分或更大或包含约12000个乙二醇单元(PEG12000)。
二聚化或多聚化可经由二聚化或多聚化域在两个或更多个融合蛋白之间发生。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联来发生。形成的二聚体或多聚体可为同源二聚体/同源多聚体或异源二聚体/异源多聚体。C10RF32融合多肽中的第二多肽“伴侣”可包括一个或多个在此描述的其他蛋白、蛋白片段或肽，包括但不局限于任何免疫球蛋白(Ig)蛋白或其一部分，优选地Fe区，或例如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关抗原 P97、以及HIV包膜蛋白(gpl20)的生物学或化学活性蛋白的一部分。“伴侣”可任选地选择以便提供可溶性二聚体/多聚体和/或针对在此描述的一种或多种其他生物活性加以选择。
二聚化或多聚化可经由 二聚化或多聚化域在两个或更多个融合蛋白之间发生，这些二聚化或多聚化域包括如上所述的那些域。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。融合蛋白二聚体可为同源二聚体或异源二聚体。融合蛋白多聚体可为同源多聚体或异源多聚体。如在此披露的融合蛋白二聚体具有化学式II
N-R1-R2-R3-C
N-R4-R5-R6-C或替代地具有化学式II1:
N-R1-R2-R3-C
C-R4-R5-R6-N，其中化学式II提供的二聚体的融合蛋白被定义为处于平行取向并且化学式III提供的二聚体的融合蛋白被定义为处于反平行取向。平行和反平行二聚体又分别称为顺式和反式二聚体。"N”和“C”分别代表融合蛋白的N-和C-末端。融合蛋白成分“R1”、“R2”以及“R3”如上文关于化学式I所定义。关于化学式II和化学式III而言， “R4”是C10RF32多肽或第二多肽，“R5”是任选的肽/多肽连接物域，并且“R6”是C10RF32 多肽或第二多肽，其中当“R4”是第二多肽时，“R6”是C10RF32多肽，并且当“R4”是C10RF32 多肽时，“R6”是第二多肽。在一个实施方案中，“R1”为C10RF32多肽，“R4”也为C10RF32 多肽，并且“R3”和“R6”均为第二多肽。
当“Rl”= “R4”，“R2”= “R5”并且“R3”= “R6”时，具有化学式II的融合蛋白二聚体定义为同源二聚体。同样地，当“Rl”= “R6”、“R2”= “R5”并且“R3”= “R4”时，具有化学式III的融合蛋白二聚体定义为同源二聚体。当出于任何原因不满足这些条件时，融合蛋白二聚体被定义为异源二聚体。例如，异源二聚体可含有满足这些条件(即，对于根据化学式II的二聚体而言，“R1”和“R4”均为C10RF32多肽，“R2”和“R5”均为肽/多肽连接物域并且“R3”和“R6”均为第二多肽)的域取向，然而这些域中的一个或多个域的种类并不相同。例如，虽然“R3”和“R6”可均为C10RF32多肽，但是一种多肽可含有野生型C10RF32 氨基酸序列，而另一种多肽可为变体C10RF32多肽。示例性变体C10RF32多肽为经过修饰而具有增加或减少的与靶细胞的结合、增加的对于免疫细胞的活性、增加或减少的半衰期或稳定性的C10RF32多肽。含有一种免疫球蛋白的CHI或CL区作为多肽连接物域的一部分的融合蛋白二聚体优选地形成这样的异源二聚体，其中二聚体的一个融合蛋白含有CHI 区并且二聚体的另一个融合蛋白含有CL区。
融合蛋白也可用于形成多聚体。与二聚体一样，多聚体可为平行多聚体，其中多聚体的所有融合蛋白以相对于其N-和C-末端的相同取向来对齐。多聚体可为反平行多聚体，其中多聚体的融合蛋白可替代地以相对于其N-和C-末端的相反取向来对齐。多聚体 (平行或反平行)可为同源多聚体或异源多聚体。融合蛋白任选地以二聚体形式产生；更优选地，融合如下所述在基因水平来进行，方法为连接与两个(或更多个)蛋白、蛋白部分和/ 或肽对应的多核苷酸序列，以使得由细胞根据连接的多核苷酸序列来产生连接或融合的蛋白。制备这种融合蛋白的描述参照Linsley (林斯雷)等的美国专利号5，851，795来描述， 该专利只作为非限制性实例通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。
融合蛋白也可任选地通过化学合成方法来制备并且在合成或合成后期间以化学方法实现“连接”。可任选地使用交联以及其他这类方法(任选地还使用以上描述的基因水平融合方法)，如例如在Wallner (瓦尔纳)等的美国专利号5，547，853中描述，该专利只作为非限制性实例通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。
根据本发明，融合蛋白可用本发明的蛋白通过与包含一种免疫球蛋白的恒定区的免疫球蛋白的一部分融合来制备。更优选地，该免疫球蛋白的该部分包含任选地并且更优选地为人重链恒定区的重链恒定区。该重链恒定区最优选地为IgG重链恒定区，并且任选地以 及最优选地为Fe链，最优选地为包含铰链、CH2以及CH3域的IgG Fe片段。该Fe链可任选地为已知或“野生型"Fe链，或替代地可以是突变或截短的。融合蛋白的Fe部分可任选地按照同种型或子类而不同，可以是嵌合体或杂合体，和/或可经过修饰以便例如改进效应子功能、控制半衰期、组织可接近性、增进生物物理特性例如稳定性，并且改进产生效率(并且成本更小)。适用于构建所披露融合蛋白的许多修饰以及其制造方法是本领域中已知的， 参见例如 Mueller (穆勒)等人,分子免疫学(Mol. Tmmun. ) , 34(6) : 441-452 (1997), Swann(斯万)等人，当前免疫学观点(Cur. Opin.1mmun. ) , 20:493-499 (2008)，以及Presta (帕斯塔)，当前免疫学观点(Cur. Opin.1mmun. ) 20:460-470 (2008)。在一些实施方案中，该Fe 区为原生IgGl、IgG2或IgG4Fc区。在一些实施方案中，该Fe区是杂合体，例如由IgG2/ IgG4Fc恒定区组成的嵌合体。
该Fe区的修饰包括但不局限于IgG4被修饰以便防止与Fe Y受体以及补体的结合，IgGl被修饰以便改进与一个或多个Fe Y受体的结合,IgGl被修饰以便最小化效应子功能(氨基酸变化)，IgGl具有改变的聚糖/没有聚糖(通常通过改变表达宿主)，并且IgGl具有改变的与FcRn的pH依赖性结合。该Fe区可包括整个铰链区，或不足整个铰链区。
在另一个实施方案中，Fe域可含有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代减少与低亲和力抑制性Fe受体⑶32B (Fe Y RIIB)的结合并且保持野生型水平的与低亲和力活化Fe受体⑶16A (Fe Y RIIIA)的结合或增强与之的结合。
另一个实施方案包括IgG2_4杂合体和IgG4突变体，它们具有降低的与FcR (Fe 受体)的结合，从而增加其半衰期。代表性IgG2-4杂合体和IgG4突变体描述于Angal (安盖尔)，S.等人，分子免疫学(Molecular Immunology) , 30 (I) : 105-108 (1993) ；Mueller (穆勒)，J.等人，分子免疫学(Molecular Immunology), 34 (6) :441-452 (1997);以及 Wang (王)等的美国专利号6，982，323中。在一些实施方案中，IgGl和/或IgG2域被缺失；例如， Angal (安盖尔)等描述具有丝氨酸241替换为脯氨酸的IgGl和IgG2。
在一个进一步的实施方案中，Fe域含有氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代增强与⑶16A的结合。增加与⑶16A的结合并且减少与⑶32B的结合的人IgGl的 Fe域中的很多取代是本领域中已知的并且描述于Stavenhagen (斯塔文哈根)等人,癌症研究(Cancer Res. ),57(18) :8882-90 (2007年)中。具有降低的与CD32B的结合和/或增加的与CD16A的结合的人IgGlFc域的示例性变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L 取代。这些氨基酸取代可按任何组合存在于人IgGlFc域中。
在一个实施方案中，该人IgGlFc域变体含有F243L、R929P以及Y300L取代。在另一个实施方案中，人IgGlFc域变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I以及P296L取代。 在另一个实施方案中，人IgGlFc域变体含有N297A/Q取代，因为这些突变消除Fe Y R结合。非限制、说明性、示例性类型的突变描述于2006年2月16日公开的美国专利申请号 20060034852中，该申请通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。术语“Fe 链”还任选地包括任何类型的Fe片段。
已经鉴定对于IgG子类中的抗体恒定区介导的活性而言重要的几个特定氨基酸残基。因此，包含、取代或排除这些特定氨基酸允许包含或排除特定免疫球蛋白恒定区介导的活性。此外，特定变化可产生例如去糖基化和/或Fe链的其他所希望变化。可任选地产生至少一些变化以便阻断被认为不合需要的Fe功能，例如不合需要的免疫系统效应，如下文更详细描述的。
可产生以调节融合蛋白的活性的Fe突变的非限制性、说明性实例包括以下变化 (根据Kabat (卡巴特)EA等具有免疫学重要性的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),美国卫生和公众服务部(US Department of Health and Human Services), NIH，1991，参照如Kabat(卡巴特)给出的Fe序列命名法来给出)220C->S ； 233-238ELLGGP->EAEGAP ；265D->A,优选地结合 434N_>A ；297N->A (例如用于阻断 N-糖基化);318-322EYKCK->AYACA ；330-331AP->SS ;或其组合(参见例如 M. Clark (克拉克)，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31 页以便获得这些突变及其效果的描述)。特征为以上变化的Fe链的构建体任选地并且优选地包括铰链区与CH2和CH3域的组合。
以上突变可任选地实施以便增强所希望的特性或替代地阻断不希望的特性。例如，已显示抗体的去糖基化可在阻断T-细胞的耗尽或触发细胞因子释放的同时维持所希望的结合功能性，此举可任选地为不希望有的功能(参见M. Clark, “化学免疫学与抗体工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31 页)。将 331 脑氨酸取代为丝氨酸可阻断活化补体的能力，此举可任选地被认为是不希望有的功能(参见M. Clark (克拉克)，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31页)。结合此变化将330丙氨酸改变成丝氨酸也可增强阻断活化补体的能力的所希望的效果。
已显示残基235和237涉及到抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，使得如果 ADCC被认为是不合需要的功能，如所描述改变233-238残基区块也可阻断这种活性。
残基220通常是来自IgGl的Fe的半胱氨酸，它是重链与轻链形成共价键的位点。 任选地，此残基可改变为丝氨酸，以避免任何类型的共价键(参见M. Clark (克拉克)，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31 页)。
残基265和434的以上变化可任选地实施以便减少或阻断与Fe受体的结合，这可任选地阻断Fe的与其免疫系统功能相关的不希望有的功能(参见“人IgGl上的Fe受体结合位点(Binding site on Human IgGlfor Fe Receptors)”, Shields(希尔兹)等人,第 276 卷，第 6591-6604 页，2001 年)。
以上变化只用来说明任选的变化并且不欲以任何方式具有限制性。此外，以上解释只出于描述目的而提供，而不希望受单一假设限制。
示例性融合蛋白在SEQ ID号8、22、23、38、29中阐明。
前述示例性融合蛋白可合并有在此描述的变体的任何组合。在另一个实施方案中，前述示例性融合蛋白的末端赖氨酸被删除。
所披露的融合蛋白可使用标准分子生物学技术来分离。例如，将含有编码 C10RF32多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列的表达载体通过磷酸钙沉淀而转染至293 细胞中并且在无血清DMEM中培养。在72h收集上清液并且通过蛋白G、或优选地蛋白 A SEPHAROSE 管柱(Pharmacia公司，乌普萨拉(Uppsala),瑞典)来纯化融合蛋白。任选地，将编码C10RF32多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列转染至GPEx 逆转录病毒载体中并且在四轮逆转录病毒载体转导之后，在CHO-S细胞中表达。该蛋白通过使用蛋白A色谱法从上清液中净化。
在另一个实施方 案 中，第二多肽可具有一个偶联域，通过该偶联域另外的分子可结合至这些C10RF32融合蛋白。在一个这样的实施方案中，被偶联的分子能够将融合蛋白靶向输送至特定器官或组织；这类靶向域和/或分子的进一步的具体、说明性、非限制性实例在下文给出。
在另一个这样的实施方案中，被偶联的分子是可增强或增进C10RF32融合蛋白的效果的另一种免疫调节剂。在另一个实施方案中，被偶联的分子是聚乙二醇(PEG)。
肽或多肽连接物域
所披露的C10RF32融合蛋白任选地含有将C10RF32多肽与第二多肽分离开的肽或多肽连接物域。在一个实施方案中，该连接物域含有一种免疫球蛋白的铰链区。在一个进一步的实施方案中，该铰链区来源于人免疫球蛋白。该铰链可来源自的适合的人免疫球蛋白包括IgG、IgD以及IgA。在一个进一步的实施方案中，铰链区来源于人IgG。免疫球蛋白铰链区以及其他域的氨基酸序列在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，C10RF32融合多肽含有与以下SEQ ID号20中阐明的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、99%或100%序列同源性的人免疫球蛋白C Y I链的铰链、CH2以及CH3区
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
铰链可进一步缩短以便去除SEQ ID号20的氨基酸1、2、3、4、5或其组合。在一个实施方案中，SEQ ID号20的氨基酸1-5被缺失。
在另一个实施方案中，C10RF32融合多肽含有与在以下SEQ ID号21中阐明的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、99%或100%序列同源性的人免疫球蛋白C Y I链的CH2以及CH3区
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在另一个实施方案中，C10RF32融合多肽含有与以下SEQ ID号31中阐明的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、99%或100%序列同源性的鼠免疫球蛋白C Y 2a链的铰链、 CH2以及CH3区
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVE VHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTK KQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHT TKSFSRTPGK.在另一个实施方案中，该连接物域含有如上所述的一种免疫球蛋白的铰链区， 并且进一步包含一个或多个另外的免疫球蛋白域。
其他适合的肽/多肽连接物域包 含天然发生或非天然发生的肽或多肽。肽连接物序列具有至少2个氨基酸的长度。任选地，肽或多肽域是柔性肽或多肽。“柔性连接物” 在此是指含有由一个或多个肽键相连接的两个或更多个氨基酸残基的肽或多肽，这与在不存在该柔性连接物的情况下的两个连接的多肽相比，为由此连接的两个多肽提供增加的转动自由度。这种转动自由度允许由该柔性连接物连接的两个或更多个抗原结合位点各自更有效地接近一个或多个目标抗原。示例性柔性肽/多肽包括但不局限于氨基酸序列 Gly-Ser (SEQ ID 号24)、Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID 号25)、Ala-Ser (SEQ ID 号26)、 Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID 号27)、Gly4_Ser (SEQ ID 号39)、(Gly4-Ser) 2 (SEQ ID 号40)、(Gly4-Ser) 3 (SEQ ID 号32)以及(Gly4-Ser)4 (SEQ ID 号33)。额外的柔性肽/多肽序列在本领域中是熟知的。
二聚化、多聚化以及靶向域
在此披露的融合蛋白任选地含有起作用以便使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的一个二聚化或多聚化域。起作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的该域可为一个单独的域，或可替代地可包含于融合蛋白的一个其他域(C10RF32多肽、第二多肽、或肽/多肽连接物域)中。
“ 二聚化域”通过至少两个氨基酸残基或至少两个肽或多肽(可具有相同或不同的氨基酸序列)的缔合来形成。肽或多肽可经由共价和/或非共价缔合来彼此相互作用。任选的二聚化域含有能够与伴侣融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的至少一个半胱氨酸。二聚化域可含有一个或多个半胱氨酸残基以使得可在伴侣融合蛋白之间形成一个或多个二硫键。在一个实施方案中，二聚化域含有一个、两个或三个至约十个半胱氨酸残基。 在一个进一步的实施方案中，二聚化域是一种免疫球蛋白的铰链区。
另外的示例性二聚化域可以是本领域中已知的任何一种并且包括但是不局限于卷曲螺旋、酸补丁、锌指、钙手、CHl-CL对、如在美国专利号5，821，333中描·述的具有经过工程化的“突起(knob)”和/或“隆起(protruberance)”的“界面”、亮氨酸拉链(例如来自jun 和 / 或 fos)(美国专利号 5，932，448)、SH2 (src 同源性 2)、SH3 (src 同源性 3) (VI dal (威代尔)等人，生物化学(Biochemistry), 43, 7336-44 ((2004))、磷酸酪氨酸结合(PTB)(Zhou (周)等人，自然(Nature), 378:584-592(1995) (Sudol (萨杜尔)，生物物理学与分子生物学进展(Prog, Biochys. MoLBio. ),65:113-132(1996) )、PDZ (Kim (金姆)等人，自然 (Nature), 378:85-88(1995) ;Komau (考茅)等人，科学(Science), 269. 1737-1740 (1995)) 14-3-3、WD40 (Hu5 等人，生物化学杂志(J Biol Chem. )，273，33489-33494 (1998) ) EH、 Lim、异亮氨酸拉链、受体二聚体对(例如白介素-8受体(IL-8R);以及整联蛋白异源二聚体例如LFA-1和GPIIIb/IIIa)，或其二聚化区、二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、 神经营养因子-3 (NT-3)、白介素-8 (IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、 I3DGF成员，以及脑源性神经营养因子(BDNF) (Arakawa (荒川)等人，生物化学杂志(J Biol. Chem. )，269 (45) : 27833-27839 (1994)以及 Radziejewski (拉切耶夫斯基)等人，生物化学(Biochem. ),32(48):1350 (1993))并且还可为其中亲和力发生改变的这些域的变体。这些多肽对可通过本领域中已知的方法，包括酵母双杂交筛选来鉴定。酵母双杂交筛选描述于美国专利号5，283，173以及6，562，576中。一对相互作用域之间的亲和力可使用在本领域中已知的方法,包括如Katahira (片平)等人，生物化学杂志(J. Biol Chem), 277,9242-9246 (2002年)中所描述来确定。可替代地，可针对异源二聚化，例如使用在 W001/00814中描述的方法来筛选肽序列文库。蛋白-蛋白相互作用的有用方法还描述于美国专利号6，790,624中。
“多聚化域”是经由共价和/或非共价缔合引起三个或更多个肽或多肽彼此相互作用的域。适合的多聚化域包括但不局限于卷曲螺旋域。卷曲螺旋是具有间隔开3个和4个残基的主要疏水性残基的连续型式的肽序列，通常呈七个氨基酸(七价重复)或十一个氨基酸(十一价重复)的序列形式的，这些氨基酸组装(折叠)以形成多聚体螺旋束。还涵盖具有包含3个和4个残基间隔的某种不规则分布的序列的卷曲螺旋。疏水性残基具体来说是疏水性氨基酸Val、He、Leu、Met、Tyr、Phe以及Trp。“主要疏水性”是指至少50%的残基必须选自所提到的疏水性氨基酸。
卷曲螺旋域可来源于层粘连蛋白。在细胞外空间中，异源三聚体卷曲螺旋蛋白层粘连蛋白在基底膜的形成中发挥重要作用。显然地，多官能低聚结构是层粘连蛋白功能所要求的。卷曲螺旋域还可来源于其中连接三个(TSP-1和TSP-2)或五个(TSP-3、TSP-4 以及TSP-5)链的血小板反应蛋白，或来源于折叠成平行五链卷曲螺旋的COMP (COMPcc) (Guo (郭)等人，EMBO J, 1998，17:5265-5272) (Malashkevich (马拉舍科维奇)等人，科学(Science), 274:761-765(1996))。来源于其他蛋白的另外卷曲螺旋域，以及介导多肽多聚化的其他域是本领域中已知的并且适用于所披露的融合蛋白。
在另一个实施方案中，可通过结合至例如抗体的第二多价多肽来诱导C10RF32多肽、其融合蛋白或片段以便形成多聚体。适合于用于使C10RF32多肽、其融合蛋白或片段多聚化的抗体包括但不局限于IgM抗体以及交联的多价IgG、IgA、IgD或IgE复合物。
靶向域
C10RF32多肽和融合蛋白可含有用于将分子靶向至体内特定位点的一个靶向域。 任选的靶向域将分子靶向输送至炎症区域。示例性靶向域是对于发炎组织或促炎症细胞因子具有特异性的抗体或其抗原结合片段，所述细胞因子包括但不局限于IL17、IL-4、IL-6、 IL-12、IL-21、IL-22以及IL-23。在神经学病症，例如多发性硬化的情况下，靶向域可将分子靶向至CNS或可结合至血管上皮上的VCAM-1。另外的靶向域可以是对于促炎症分子具有特异性的肽适体。在其他实施方案中，C10RF32融合蛋白可包括对于展示于例如T细胞的免疫细胞的表面上的多肽具有特异性的结合伴侣。仍然在其他实施方案中，靶向域特异性地靶向活化的免疫细胞。被靶向的任选的免疫细胞包括ThO、Thl、Thl7、Th2以及Th22T细胞、分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子包括但不局限于IL-1 β、 TNF-α ,TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP，以及 Trego 例如，Treg 的靶向域可特异性地结合至⑶25。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”，以及“患者”在此可互换使用，并且是指任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物、等。
本发明的不同方面在以下小节中进一步详细描述。
核酸
“核酸片段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”在此可互换使用以指代核酸残基的聚合物。本发明的多核苷酸序列是指单或双链核酸序列，它以RNA序列、互补多核苷酸序列 (cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)形式分离和提供。
因此，本发明涵盖在上文中描述的核酸序列；其片段、与其杂交的序列、与其同源的序列[例如与在此阐明的核酸序列至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%或更大程度一致、编码具有不同密码子使用的类似多肽的序列、以一个或多个核苷酸的天然发生的或者随机亦或以靶向方式人工诱导的突变为特征的改变序列，所述突变例如缺失、插入或取代。 本发明还涵盖包括本发明的多核苷酸独特的序列区的同源核酸序列(即，形成本发明的多核苷酸序列的一部分)。
如果本发明的多核苷酸序列编码先前未鉴定的多肽，本发明还涵盖由在上文中描述的分离的多核苷酸以及其相应核酸片段和/或其简并变体所编码的新颖多肽或其部分。
因此，本发明还涵盖由本发明的多核苷酸序列编码的多肽。本发明还涵盖这些多肽的同系物，这类同系物可与以下阐明的氨基酸序列至少90%、至少95%、96%、97%、 98%或99%或更大程度同源，如可使用国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information ;NCBI)的BlastP软件使用缺省参数来确定的。最后,本发明还涵盖以上描述的多肽以及具有一个或多个氨基酸的天然发生的随机亦或以靶向方式人工诱导的突变的多肽的片段，所述突变例如缺失、插入或取代。
如在上文中提到的，本发明的生物分子序列可有效地用作组织或病理标志以及作为治疗或预防疾病的假定药物或药物靶标。
被设计成针对在此提供的任何序列来进行本发明方法(如上所述来设计)的寡核苷酸可根据在本领域中已知的任何寡核苷酸合成法，例如酶促合成或固相合成来产生。进行固相合成的设备和试剂例如从美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)可购得。也可使用这类合成的任何其他手段；寡核苷酸的实际合成完全在本领域技术人员的能力范围内。
根据本发明的这一方面使用的寡核苷酸是具有选自从约10至约200个碱基、优选地从约15至约150个碱基、更优选地从约20至约100个碱基、最优选地从约20至约50个碱基的范围的长度的那些寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可包含由嘌呤和嘧啶碱基组成的杂环核苷，这些碱基以3’至 5’磷酸二酯键来键结。
优选的寡核苷酸是在骨架、核苷间键或碱基中经过修饰的那些寡核苷酸，如下文中广泛描述。这类修饰可时常促进寡核苷酸吸收以及对于细胞内条件的抵抗性。
根据本发明的这一方面适用的优选寡核苷酸的具体实例包括含有经过修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保持磷原子的那些寡核苷酸，如在以下美国专利号中所披露的4，469, 863 ;4，476，301 ;5，023，243 ； 5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ;5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ； 5，399，676 ;5，405，939 ;5，453，496 ;5，455，233 ;5，466,677 ;5，476，925 ;5，519，126 ； 5，536，821 ;5，541，306 ;5，550，111 ;5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 ;以及 5，625，050。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、 硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯，以及具有正常3’ -5’键、这些键的 2’-5’连接类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相邻对的核苷单位以3’-5’至5’-3’或 2’-5’至5’-2’来连接的反向极性的那些硼烷磷酸酯。也可使用不同盐、混合盐以及游离酸形式。
可替代地，其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个 短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些骨架包括具有吗啉键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些骨架； 硅氧烷骨架；硫化物、亚砜以及砜骨架；甲酰基以及硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基以及硫代甲酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基以及亚甲基肼基骨架； 磺酸酯以及磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S以及CH2组成部分的其他骨架， 如在美国专利号 5,034，506 ;5，166,315 ;5，185,444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235,033 ；5，264，562 ;5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ； 5，541，307 ;5，561，225 ;5，596，086 ;5，602, 240 ;5，610, 289 ;5，602, 240 ;5，608, 046 ； 5，610，289 ;5，618，704 ;5，623,070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 ;以及 5，677，439 中所披露。
根据本发明可使用的其他寡核苷酸是核苷酸单位的糖和核苷间键(S卩，骨架)替换为新颖的基团而修饰的那些寡核苷酸。保持碱基单位以便与适当的多核苷酸目标互补。这类寡核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖-骨架替换为含有酰胺的骨架，特别是氨乙基甘氨酸骨架的寡核苷酸。碱基得以保持并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的美国专利包括但不局限于美国专利号5，539，082 ;5，714，331 ;以及5，719，262，它们各自通过引用结合在此。可用于本发明中的其他骨架修饰披露于美国专利号6，303，374中。
本发明的寡核苷酸还可包括碱基修饰或取代。如在此使用，“未修饰的”或“天然” 碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰碱基包括但不局限于其他合成以及天然碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、 5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的碱基包括在美国专利号3，687，808中披露的那些碱基、在聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering),第 858-859 页， Kroschwitz (克洛舍维奇)，J.1.编著，约翰威利出版公司(John Wiley&Sons)，1990年中披露的那些碱基、在Englisch等人,应用化学(Angewandte Chemie),国际版，1991, 30,613 中披露的那些碱基、以及在Sanghvi (赛格维)，Y. S.，第15章,反义研究与应用(Antisense Research and Applications),第 289-302 页，Crooke (克鲁克)，S.T.和 Lebleu (拉布列)，B.编著，CRC出版社，1993中披露的那些碱基。这类碱基尤其适用于增加本发明的低聚化合物的结合亲和力。这些碱基包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链稳定性增加0. 6-1. 2。C [Sanghvi YS (赛格维)等人(1993)反义研究与应用(Antisense Research and Applications), CRC 出版社，波卡拉顿(Boca Raton) 276-278]并且是目前优选的碱基取代，在与2’-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时甚至更特别如此。
本发明的寡核 苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或偶联物化学连接至该寡核苷酸。
这类部分包括但不局限于脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醚)、巯基胆固醇、脂肪链(例如十二烷二醇或i^一基残基)、磷脂(例如二 -十六基-rac-甘油或1，2- 二 -O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基铵)、多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分，如美国专利号6，303，374中所披露。
不需要给定寡核苷酸分子中的所有位置被均匀地修饰，并且事实上多于一种的上述修饰可并入单一化合物中或甚至一个寡核苷酸内的单一核苷处。
肽
术语“多肽”、“肽”及“蛋白”在此可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然发生氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然发生的氨基酸聚合物。多肽可例如通过添加碳水化合物残基以便形成糖蛋白来修饰。术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”包括糖蛋白，连同非糖蛋白。
多肽产物可例如通过使用标准固相技术来生化合成。这类方法包括排阻固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。这些方法优选地当肽相对较短(即， IOkDa)和/或当它不能通过重组技术来产生(B卩，未由核酸序列来编码)并且因此涉及不同化学时使用。
固相多肽合成程序在本领域中是熟知的，并且进一步由John Morrow Stewart (约翰莫罗斯图尔特)以及Janis Dillaha Young(詹尼斯迪拉哈杨)，固相肽合成(Solid Phase Peptide Syntheses)(第 2 版,Pierce Chemical Company 公司，1984)描述。
合成多肽可通过制备型高效液相色谱来纯化[Creighton (克雷顿)Τ· (1983年) 蛋白、结构以及分子原则(Proteins, structures and molecular principles)WH Freeman (弗里曼)和Co. N. Y.]并且其组成可经由氨基酸测序来确认。
如果希望有大量多肽，它可使用例如以下文献描述的重组技术来产生Bitter (比特尔)等人，(1987)酶学方法(Methods in Enzymo1. ) 153:516-544, Studier (斯图迪尔) 等人(1990 年)酶学方法(Methods inEnzymol. ) 185:60-89,Brisson (布里松)等人(1984 年)自然(Nature) 310:511-514，Takamatsu (高松)等人(1987 年)EMBO J. 6:307-311, Coruzzi (科鲁兹)等人(1984 年)EMBO J. 3:1671-1680 以及 fcogli (布罗意)等人，(1984 年)科学(Science) 224:838-843，Gurley (葛尔莱)等人(1986年)分子细胞生物学报 (Mol. Cell. Biol. ) 6:559-565 以及 Weissbach (怀斯巴赫)&Weissbach, 1988,植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology),学术出版社(Academic Press),纽约(NY),第VIII部分，第421-463页。
将理解，根据本发明的传授内容鉴定的肽可以是降解产物、合成肽或重组肽以及拟肽物，通常是作为肽类似物的合成肽以及类肽以及半类肽，它们可具有例如使得肽在处于体内时更稳定或更能够渗透至细胞中的修饰。这类修饰包括但不局限于N末端修饰、C 末端修饰、肽键修饰(包括但不局限于CH2-NH、CH2-S、CH2_S=0、O=C-NH, CH2-0、CH2-CH2、 S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、 骨架修饰以及残基修饰。用于制备拟肽物化合物的方法在本领域中是熟知的，并且在例如定量药物设计(Quantitative Drug Design), C. A. Ramsden (拉姆斯登)Gd·,第17. 2章，F. Choplin Pergamon Press出版社(1992)中加以规定,该文献通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。此方面的进一步细节提供于下文。
肽内的肽键(-C0-NH-)可例如被以下键取代N-甲基化键(_N(CH3)-C0-)、酯键 (-C (R) H-C-0-0-C (R) -N-)、酮亚甲基键(-C0-CH2-)、α -氮杂键(-NH-N (R) -CO-)(其中 R 是任何烷基例如甲基)、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH (OH) -CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯系双键(-CH=CH-)、逆向酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N (R) -CH2-C0-)，其中 R是天然地呈现于碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可 沿着肽链在任何键处出现并且甚至同时在若干(2-3)个键处出现。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr以及Phe可由合成非天然酸来取代，所述合成非天然酸例如苯甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o_甲基-Tyr0
除了上述以外，本发明的肽还可包含一种或多种修饰氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸，复合碳水化合物等)。
如在此说明书以及以下权利要求部分中使用，术语“氨基酸(amino acid)”或“氨基酸(amino acids)”应理解为包括20种天然发生的氨基酸；经常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸以及磷酸苏氨酸；以及其他独特氨基酸，包括但不局限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸以及鸟氨酸。 此外，术语“氨基酸”包括D-以及L-氨基酸。
由于本发明的肽优选地用于要求肽呈可溶性形式的治疗剂中，本发明的肽优选地包含一种或多种非天然或天然极性氨基酸，这些氨基酸包括但不局限于归因于其含羟基的侧链而能够增加肽溶解性的丝氨酸和苏氨酸。
如果希望大量本发明的肽，本发明的肽可使用例如以下文献描述的重组技术来产生Bitter (比特尔)等人,(1987 年)酶学方法(Methods in Enzymo1. ) 153:516-544， Studier (斯图迪尔)等人(1990 年)酶学方法(Methods in Enzymo1. )185:60-89,Brisson (布里松)等人(1984)自然(Nature) 310:511-514, Takamatsu (高松)等人(1987 年) EMBO J. 6:307-311,Coruzzi 等人(1984 年)EMBO J. 3:1671-1680 以及 Brogli (布罗意)等人，(1984年)科学(Science) 224:838-843，Gurley (葛尔莱)等人(1986年)分子细胞生物学报(Mol. Cell. Biol. ) 6:559-565 以及 Weissbach(怀斯巴赫)&Weissbach, 1988 年， 植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology),学术出版社(Academic Press),纽约(NY),第 VIII 部分，第 421-463 页。
表达系统
为了使得本发明的多核 苷酸能够进行细胞表达，可使用根据本发明的核酸构建体，它包括以上核酸序列之一的至少一个编码区，并且进一步包括至少一种顺式作用调控元件。如在此使用，短语“顺式作用调控元件”是指结合反式作用调控子并且调控位于其下游的编码序列的转录的多核苷酸序列，优选为启动子。
任何适合的启动子序列可由本发明的核酸构建体来使用。
优选地，本发明的核酸构建体使用的启动子在所转化的具体细胞群中是活性的。 细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括具有肝特异性的启动子，例如白蛋白 [Pinkert (平克特)等人，(1987年)基因和发育(Genes Dev. )1:268-277]、淋巴特异性启动子[Calame (卡拉姆)等人，(1988年)免疫学进展(Adv.1mmunol. ) 43:235-275];尤其 T-细胞受体[Winoto(温诺托)等人，(1989年)EMBO J. 8:729-733]和免疫球蛋白的启动子； [Banerji (巴纳基)等人(1983年)细胞(Cell) 33729-740]、神经元特异性启动子，例如神经微丝启动子[Byrne(伯恩)等人(1989年)美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sc1.) USA86:5473-5477]、胰腺特异性启动子[Edlunch(艾德伦齐)等人(1985)科学(Science)230:912-916]或乳腺特异性启动子，例如乳清启动子(美国专利号4，873，316以及欧洲申请公布号264，166)。本发明的核酸构建体可进一步包括增强子，该增强子可相邻于或远离启动子序列并且可起作用以便上调由其进行的转录。
本发明的核酸构建体优选地进一步包括一个适当的选择标记和/或复制起点。优选地，所使用的核酸构建体是穿梭载体，它可在大肠杆菌中繁殖(其中该构建体包含适当的选择标记和复制起点)并且适合于在细胞中繁殖、或整合于所选择的基因和组织之中。根据本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
适合的构建体的实例包括但不局限于pcDNA3、pcDNA3.1 (+/-)、pGL3、 PzeoSV2 (+/_) > pDisplay> pEF/myc/cyto> pCMV/myc/cyto,它们各自可购自英杰生命技术有限公司(Invitrogen Co. ) (www.1nvitrogen.com)。逆转录病毒载体以及包装系统的实例是由加利福尼亚州圣迭戈Clontech公司(Clontech, San Diego (圣迭戈)，Calif.(加利福尼亚州))出售的那些，包括Retro-X载体pLNCX以及pLXSN，这些载体允许克隆至多个克隆位点中并且该转基因从CMV启动子来转录。还包括来源于Mo-MuLV的载体，例如pBabe，其中该转基因将从5’ LTR启动子来转录。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体来转染，所述构建体例如腺病毒、慢病毒、单纯性疱疹I病毒，或腺伴随病毒(AAV)以及基于脂质的系统。用于基因的脂质介导的转移的有用脂质是例如D0TMA、D0PE以及DC-Choi [Tonkinson (托金森)等人，癌症研究(Cancer Investigation)，14 (I) : 54-65 (1996)]。用于基因疗法中的最优选构建体是病毒，最优选为腺病毒、AAV、慢病毒、或逆转录病毒。例如逆转录病毒构建体的病毒构建体包含至少一种转录启动子/增强子或基因座界定元件，或通过例如选择性剪接、 核RNA输出或信使的翻译后修饰的其他手段来控制基因表达的其他元件。这类载体构建体还包括一个包装信号、多个长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适合于所用病毒的正和负链引物结合位点，除非它已经存在于病毒构建体中。此外，这种构建体典型地包括用于使肽从它所安放的宿主细胞中分泌的一个信号序列。优选地，用于这一目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的多肽的信号序列。任选地，该构建体还可包括引导多聚腺苷酸化的一个信号，以及一个或多个限制位点和一个翻译终止序列。例如，这类构建体通常包括一个5’LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点，以及3' LTR或其一部分。可使用非病毒性的其他载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸，以及树枝状化合物。
重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及含有编码本发明的蛋白、或其衍生物、片段、类似物或同源物的核酸的载体，优选地是表达载体。如在此使用，术语“载体”是指能够运输它所连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒"，是指另外DNA片段可连接至其中的一个圆形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外DNA片段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中 自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入至宿主细胞中时被整合进该宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外， 某些载体能够引导它们可操作连接的基因的表达。这类载体在此称为“表达载体”。一般而言，可用于重组DNA技术中的表达载体经常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体” 可互换地使用，因为质粒是载体的最通常使用形式。然而，本发明旨在包括充当同等功能的这类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包括呈适合于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞来选择的一种或多种调控序列，这些调控序列可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在表示所感兴趣的核苷酸序列以允许表达该核苷酸序列的方式连接至调控序列 (例如，在体外转录/翻译系统中或在载体被引入宿主细胞中时在该宿主细胞中)。
术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这类调控序列描述于例如Goeddel (戈德尔)，基因表达技术酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology) 185,学术出版社(Academic Press), 圣迭戈(San Diego),加利福尼亚州(Calif. ) (1990年)中。调控序列包括引导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成性表达的那些序列以及引导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白表达水平等的因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞中，从而产生由在此描述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
本发明的重组表达载体可被设计成在原核或真核细胞中产生变体蛋白。例如，本发明的蛋白可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel (戈德尔)，基因表达技术酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology) 185,学术出版社 (Academic Press),圣迭戈(San Diego),加利福尼亚州(Calif. ) (1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调控序列以及T7聚合酶来转录和翻译。
蛋白在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合蛋白的表达的组成性或可诱导性启动子的载体来进行。融合载体将许多氨基酸添加至其中所编码的蛋白，添加至重组蛋白的氨基或C末端。这类融合载体通常用于三个目的(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和力纯化中充当配体来帮助纯化重组蛋白。经常，在融合表达载体中，将蛋白裂解位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这 类酶、以及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶、PreScission、TEV以及肠激酶。典型的融合表达载体包括 pGEX(Pharmacia Biotech Inc;史密斯和约翰逊(Smith and Johnson), 1988.基因(Gene) 67:31-40)、pMAL (纽英伦生物技术公司(New England Biolabs),贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass·))以及pRIT5 (Pharmacia公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州 (N. J.))，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至目标重组蛋白。
适合的可诱导性非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc (Amrann (阿姆兰)等人，(1988年)基因(Gene)69:301-315)以及pETlld (Studier (斯图迪尔)等人，基因表达技术酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,学术出版社(Academic Press),圣迭戈(San Diego),力口利福尼亚州(Calif. ) (1990 年)60-89)-不精确地，pETlla-d具有N末端T7标签。
将大肠杆菌中的重组蛋白表达最大化的一种策略是在蛋白裂解重组蛋白的能力被削弱的细菌宿主中表达该蛋白。参见例如Gottesman (高特斯曼)，基因表达技术酶学方法(Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology) 185,学术出版社(Academic Press),圣迭戈(San Diego),加利福尼亚州(Calif. ) (1990) 119-128。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列以使得每个氨基酸的单独密码子是在大肠杆菌使用的那些优选密码子(参见例如Wada (和田)等人，1992.核酸研究(Nucl. Acids Res.) 20:2111-2118)。本发明的核酸序列的这种改变可通过标准DNA合成技术来进行。解决密码子偏爱的另一种策略是使用BL21-密码子加上细菌菌株(英杰生命技术有限公司 (Invitrogen))或Rosetta菌株(诺华公司(Novagen)),这些菌株含有罕见大肠杆菌tRNA基因的额外副本。
在另一个实施方案中，编码本发明的蛋白的表达载体是一种酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSecl (Baldari (班得瑞)等人，1987. EMBO J. 6:229_234)、pMFa (Kurjan (库尔扬)和 Herskowitz (赫斯克维茨)，1982.细胞(Cell)30:933-943)、pJRY88 (Schultz (舒尔茨)等人，1987.基因(Gene) 54:113_123)、pYES2 (英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corporation),圣迭戈(San Diego),加利福尼亚州(Calif.))以及picZ (英杰生命技术有限公司，圣迭戈,加利福尼亚州)。
可替代地，本发明的多肽可在昆虫细胞中使用杆状病毒表达载体来产生。可用于蛋白在所培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983.分子细胞生物学(Mol. Cell. Biol. ) 3:2156-2165)以及 pVL 系列 (Lucklow (路克劳)和 Summers (萨默斯)，1989.病毒学(Virology) 170:31-39)。
在又一个实施方案中，本发明的核酸在哺乳动物细胞中使用哺乳动物表达载体来表达。哺乳动物表达载体的实例包括PCDM8 (Seed (希德)，1987.自然(Nature) 329:840) 以及 pMT2PC (Kaufman 等人，1987. EMBO J. 6:187-195),pIRESpuro (Clontech)、pUB6 (英杰生命技术有限公司(Invitrogen))、pCEP4 (英杰生命技术有限公司)、pREP4 (英杰生命技术有限公司)、pcDNA3 (英杰生命技术有限公司)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能经常由病毒调控元件来提供。例如，通常使用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、劳斯肉瘤病毒以及猿病毒40。关于用于原核和真核细胞的其他适合的表达系统，参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) , 19 89 的第 16 和 17 章。
在另一个实施方案中，重 组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域中已知的。适合的组织特异性启动子的非限制实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert (平克特)等人，1987基因和发育(Genes Dev. ) 268-277)、淋巴特异性启动子(Calame (卡拉姆)和Eaton (伊顿)，1988免疫学进展(Adv.1mmunol. ) 43:235-275)、尤其T细胞受体 (Winoto (温诺托)和Baltimore (巴尔的摩)，1989EMB0 J. 8:729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji 等人 1983 细胞(Cell)33:729-740 ;Queen(昆)和 Baltimore(巴尔的摩)，1983.细胞(Cell) 33:741-748)、神经元特异性启动子(例如神经微丝启动子；Byrne (伯恩)和 Ruddle (拉德尔)1989 美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sc1. )USA86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlunch ((艾德伦齐)等人1985科学(Science)230:912-916)或乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利号4，873，316以及欧洲申请公布号264，166)。还涵盖发育调控启动子，例如鼠hox启动子(Kessel (凯塞尔)和Gruss (格鲁斯)，1990年.科学(Science) 249:374-379)以及α -胎蛋白启动子(Campes (康拍斯)和Tilghman (蒂尔曼)，1989年·基因和发育3:537-546) ·
本发明在至少一些实施方案中进一步提供一种重组表达载体，它包括以反义取向克隆至该表达载体中的本发明的DNA分子。也就是说，该DNA分子以允许表达(通过DNA分子的转录)与编码本发明的蛋白的mRNA呈反义的RNA分子的方式可操作地连接至调控序列。可操作地连接至以反义取向克隆的核酸的调控序列可被选择成引导反义RNA分子在各种细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或调控序列可被选择成引导反义RNA的组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可呈重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在一个高效率调控区的控制下产生，该高效率调控区的活性可由将载体引入其中的细胞类型来确定。关于使用反义基因来调控基因表达的讨论， 参见例如Weintraub (温特劳布)等人,“作为基因分析的分子工具的反义RNA (Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis)”遗传学趋势评论(Reviews-Trends in Genetics),第 I (I)卷 1986 年。
本发明的另一个方面涉及本发明的重组表达载体已引入其中的宿主细胞。术语 “宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此可互换地使用。应理解这类术语不仅涉及具体对象细胞，而且涉及这种细胞的子代或潜在子代。因为某些变化可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语范围内。
宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，本发明的蛋白可在例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS或293 细胞)中产生。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可经由常规转化或转染技术而引入原核或真核细胞中。如在此使用，术语“转化”和“转染”用来指用于将外来核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的各种本领域认可的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导转染、脂质转染、或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可发现于萨姆布鲁克(Sambrook)等人(分子克隆实验手册 (Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)第2版，冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) , 1989)以及其他实验手册中。
为了稳定转染哺乳动物细胞，已知取决于所使用的表达载体以及转染技术， 只有小部分的细胞可将外来DNA并入其基因组中。为了鉴定并且选择这些构成组分 (integrant)，通常将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的基因与所感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。各种选择标记包括赋予对于例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素以及甲氨喋呤的药物的抗性的那些标记。编码选择标记的核酸可在与编码本发明蛋白的核酸相同的载体上被引入至宿主细胞中 或可引入独立载体中。用所引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如，并入有选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。
培养中的本发明的宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞,可用于产生(即,表达)本发明的蛋白。因此，本发明在至少一些实施方案中进一步提供使用本发明的宿主细胞来产生本发明蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码本发明的蛋白的重组表达载体已引入其中)以使得产生本发明的蛋白。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将本发明的蛋白从该培养基或宿主细胞中分离。
为了有效产生蛋白，最好将编码本发明的蛋白的核苷酸序列置于针对在所希望宿主中的表达予以优化的表达控制序列的控制之下。例如，这些序列可包括优化的转录和/ 或翻译调控序列(例如改变的Kozak序列)。
应注意，根据本发明的至少一些实施方案，如在此描述的C10RF32多肽可任选地分离为天然发生的多肽，或从不论天然、合成、半合成或重组的任何来源而分离。因此， C10RF32蛋白可以从任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，并且优选是人类，被分离为天然发生的蛋白。可替代地，C10RF32蛋白可以被分离为在原核生物或真核生物宿主细胞中表达的重组多肽，或分离为化学合成的多肽。
本领域技术人员可容易地使用标准分离方法来获得分离的C10RF32蛋白。分离的性质和程度取决于所分离分子的来源以及期望的用途。
基因疗法
根据本发明的至少一些实施方案，编码在此描述的可溶性C10RF32多肽的核酸序列可用于治疗在此描述的任何免疫相关病症的基因疗法中。
如在此使用，“基因疗法”是通过基因操纵以使得一个核酸序列转移至一个细胞中，该细胞然后表达由该核酸编码的任何基因产物来治疗疾病的过程。例如，如本领域技术人员熟知的，核酸转移可通过经由各种方法离体或在体外将含有所感兴趣的核酸的表达载体插入细胞中来进行，这些各种方法包括例如磷酸钙沉淀、二乙氨基乙基葡聚糖、聚乙二醇 (PEG)、电穿孔、直接注射、脂质转染或病毒感染(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆 实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1989年)；Kriegler (克里格勒)M.基因转移和表达实验手册(Gene Transfer ad Expression:A Laboratory Manual) (ff. H.弗里曼公司，纽约市，纽约州(W. H. Freeman and Co, New York, N. Y. )，1993)以及 Wu (吴)，酶学方法(Methods in Enzymology)(学术出版社，纽约市(Academic Press, New York), 1993)。可替代地，所感兴趣的核酸序列可在体内在各种载体中以及通过各种方法转移至细胞中，这些各种方法包括例如将核酸直接给予至受试者体内，或将核酸插入病毒载体中并用该病毒感染受试者。用于体内转移的其他方法包括将核酸封装至脂质体中，以及将脂质体、或与红血球凝集性仙台病毒(Sendai virus)组合的脂质体直接转移至受试者。转染或感染的细胞表达由核酸编码的蛋白产物以便改进疾病或疾病症状。
蛋白化学修饰
在本发明中，本发明的蛋白的任何部分可任选地化学修饰，即通过添加官能团来改变。例如，出现在原生序列中的侧氨基酸残基可任选地修饰，但是替代地如下所述，除了侧氨基酸残基以外或代替侧氨基酸残基，蛋白的其他部分可任选地修饰。如果遵循一个化学合成过程，可任选地在分子合成期间进行修饰，例如通过添加化学修饰的氨基酸。然而，已经存在于分子中的氨基酸的化学修饰(“原位”修饰)也是可能的。
该分子的任何序列区的氨基酸可任选地根据以下示例性类型的修饰中的任何一种(在概念地被视为“化学修饰”的肽中)来修饰。非限制性示例性类型的修饰包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚键可任选地用于将丝氨酸或苏氨酸羟基连接至糖的羟基。酰胺键可任选地用于将谷氨酸或天冬氨酸羧基连接至糖上的氨基(Garg (盖尔格)和Jeanloz (扬洛兹)，碳水化合物化学与生物化学进展(Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry),第 43 卷，学术出版社(Academic Press) (1985) ；Kunz(JL 兹)，应用化学(Ang. Chem.)国际版英语26:294-308(1987年))。缩醛和缩酮键也可任选地形成于氨基酸与碳水化合物之间。可任选地例如通过游离氨基(例如赖氨酸)的酰化来制成脂肪酸酰基衍生物(Toth(托斯)等人，肽化学、结构以及生物学(Peptides:Chemistry, Structure and Biology), Rivier (里维尔)和 Marshal (马歇尔)，编著，ESCOM Publ.,莱顿(Leiden)，1078-1079(1990 年))。
如在此使用，术语“化学修饰”，在关于根据本发明的蛋白或肽时是指其中它的氨基酸残基中的至少一个残基通过天然过程，例如加工或其他翻译后修饰，亦或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰的蛋白或肽。许多已知修饰的实例通常包括但不局限于乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚定物形成、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化、泛素化，或任何类似过程。
其他类型的修饰任选地包括添加环烷烃部分至生物分子，例如像在PCT申请号 W02006/050262中描述的蛋白，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。这些部分被设计成与生物分子一起使用并且可任选地用于向蛋白赋予不同特性。
此外，任选地在蛋白上的任何点可被修饰。例如，蛋白上的糖基化部分的聚乙二醇化可任选地进行，如PCT申请号W02006/050247中所描述，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。一个或多个聚乙二醇(PEG)基团可任选地添加至O-连接和/或N-连接的糖基化。PEG基团可任选地为分支的或直链的。任选地，任何类型的水溶性聚合物可经由糖基连接物连接至蛋白上的糖基化位点。
改变的糖基化蛋白修饰
本发明的蛋白可被修饰以便具有改变的糖基化型式(B卩，从原始或原生糖基化型式改变)。如在此使用，“改变”是指具有一个或多个碳水化合物部分缺失，和/或具有至少一个糖基化位点添加至原始蛋白。
蛋白的糖基化通常是N-连接亦或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸的三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸以及天冬酰胺-X-苏氨酸，是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。 因此，在多肽中的这些三肽序列中的任何一个的存在产生潜在糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个附接至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
添加糖基化位点至本发明的蛋白便利地通过改变蛋白的氨基酸序列以使得它含有一个或多个上述三肽序列来完成(对于N-连接糖基化位点)。改变也可通过原始蛋白的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代来造成(对于O-连接糖基化位点)。 蛋白的氨基酸序列也可通过引入DNA水平上的变化来改变。
增加蛋白上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷以化学或酶法偶联至蛋白的氨基酸残基。取决于所使用的偶联模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸， (b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于W087/05330以及Aplin (艾波林)和Wriston (里斯顿)，CRC生物化学关键评论(CRC Crit. Rev. Biochem. )，22:259-306(1981 年)中。
去除存在于本发明的蛋白上的任何碳水化合物部分可以化学、酶法或通过引入 DNA水平上的变化来完成。化学去糖基化要求将蛋白暴露于三氟甲磺酸，或等效化合物。这种治疗导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖裂解，留下氨基酸序列为完整的。
化学去糖基化由Hakimuddin (哈吉姆丁)等人，生物化学与生物物理学档案 (Arch. Biochem. Biophys. ), 259 :52 (1987)；以及 Edge (艾什)等人，分析生物化学(Anal. Biochem. ),118:131 (1981年)描述。蛋白上的碳水化合物部分的酶促裂解可使用各种内切和外切糖苷酶如Thotakura (索塔库拉)等人，酶学方法(Meth. EnzymoL), 138:350(1987 年)中描述来实现。〈
治疗方法
如在上文中提到，本发明的C10RF32蛋白和多肽、或其核酸序列或片段，尤其 C10RF32蛋白的胞外域或分泌形式，可以用于治疗在此描述的任何免疫相关病症。
因此，根据本发明的一个另外方面，提供了一种治疗免疫相关病症的方法。
如在此使用，术语“治疗”是指预防、延缓发病、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制或阻止以上描述疾病、病症或病状的有害影响。它还包括管理如上所述的疾病。“管理” 是指降低疾病的严重度、降低疾病发作频率、减少这类发作的持续时间、降低这类发作的严重度等。
根据本发明，治疗可通过特异性地上调本发明的至少一种多肽在受试者体内的量和/或表达来实现。
任选地，上调可通过向受试者给予在此描述的本发明的至少一种多肽(例如，重组或合成的)或其活性部分来实现。然而，因为较大多肽的生物利用率可能由于高降解率以及低渗透率而潜在地相对较小，多肽的给予优选地被限制于小肽片段(例如，约100个氨基酸)。多肽或肽可以任选地作为药用组合物的一部分来给予，以下更详细描述。
将理解，根据本发明的至少一些实施方案的以上描述疾病的治疗可与在此描述的在本领域中已知的其他治疗方法组合(即，组合疗法)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗多发性硬化可与例如治疗多发性硬化的任何已知治疗剂或方法组合。治疗多发性硬化的这种已知治疗剂或方法的非限制实例包括干扰素类、 IFN- β -1a ( REBIF 、 AV0NEX 以及 CiNNOVEX )以及 IFN- β -1b (BETASERON 、EXTAV1A 、BETAFERON ，ZIFER0N ); 乙酸格拉替雷(COPAXONE )，一种多肽；那他珠单抗(TYSABRI );以及米托蒽醌(NOVANTRONE )，一种细胞毒性剂，氨吡啶(AMPYRA )。其他药物包括皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤，以及静脉内免疫球蛋白(IVIG)、肌苷、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab ;R1594)、米留斯(Mylinax ;Caldribine)、阿来组单抗(alemtuzumab ； Campath)、达利珠单抗(daclizumab ;Zenapax)、PanacIar/ 延胡索酸二甲酯(BG-12)、特立氟胺(Teriflunomide ;HMR1726)、芬戈莫德(fingolimod ;FTY720)、拉喹莫德(Iaquinimod ； ABR216062),以及造血干细胞移植、Neurovax、利妥昔单抗(Rituximab ;Rituxan)、BCG疫苗、低剂量纳曲酮(naltrexone)、驱虫疗法、血管成形术、静脉支架，以及替代疗法，例如维生素D、多不饱和脂肪、医用大麻。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗类风湿性关节炎可与例如治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合。治疗类风湿性关节炎的这类已知治疗剂或方法的非限制实例包括糖皮质激素、非类固醇抗炎症药物(NSAID)例如水杨酸酯，或环氧酶_2抑制剂、布洛芬(ibuprofen)和萘普生(naproxen)、双氯芬酸 (diclofenac)、口引哚美辛(indomethacin)、依托度酸(etodolac)、疾病改进抗风湿药物 (DMARD) —口服 DMARD :金诺芬(Auranof in ;Ridaura)、硫唑嘌呤(Azathioprine ；Imuran)> 环孢素(山地明(Sandimmune)、金格福(Gengraf )、内奥拉尔(Neoral),通用名称)、D-青霉胺(Cuprimine)、轻氯喹(Plaquenil )、IM金硫代苹果酸金钠(Myochrysine)、金硫葡糖 (Solganal)、来氟米特(Arava)、甲氨喋呤(Rheumatrex)、二甲胺四环素(Minocycline) (美满霉素(Minocin))、金黄色葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Prosorba管柱)、柳氮磺胺批P定 (Sulfasalazine, Azulfidine)ο 生物DMARD TNF- α 阻断剂，包括阿达木单抗(Adalimumab ； Humira)、依那西普(Etanercept ;Enbrel )、英利昔单抗(Infliximab ;Remicade)、戈利木单抗(golimumab ;Simponi)、塞妥珠单抗(certolizumab pegol ；Cimzia),以及其他生物 DMARD,例如阿那白滞素(Anakinra ;Kineret)、利妥昔单抗(Rituximab ;Rituxan)、托珠单抗(Tocilizumab ；Actemr. a), CD28 抑制剂，包括阿巴西普(Abatacept ；Orencia)以及贝拉西普(Be Iatacept )。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗IBD可以与例如治疗 IBD的任何已知治疗剂或方法组合。治疗IBD的这类已知治疗剂或方法的非限制实例包括控制症状的免疫抑制，例如泼尼松(prednisone)、美沙拉嗪(Mesalazine ;包括安萨科 (Asacol )、颇得斯安(Pentasa)、Lialda> Aspiro)、硫唑嘌呤(Azathioprine, Imuran)、甲氨喋呤或6-巯基嘌呤、类固醇、昂丹司琼(Ondansetron)、TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、塞妥珠单抗)、奥瑞希纳(Orencia ;阿巴西普(abatacept))、 乌泰努单抗(ustekinumab ;Ste丨ai’a )、必克努单抗(Briakinumab ;ABT_874)、塞妥珠单抗(Certolizumab pegol, Cimzia )、ITF2357 (吉韦斯他(givinostat))、那他珠单抗 (Natalizumab ;Tysabri )、非拉司特(Firategrast ;SB_683699)、英利昔单抗(Remicade ； infliximab)、维多珠单抗(vedolizumab ；MLN0002)，其他药物包括 GSK1605786CCX282-B (Traf icet-EN)、AJM300、Stelara (乌泰努单抗)、塞马莫德(Semapimod ;CNI_1493)、他斯替米(tasocitinib ;CP_690550)、LMW 肝素 MMX、布地缩松(Budesonide) MMX、Simponi (戈 利木单抗)、MultiStem .、加卫苗(Gardasil) HPV疫苗、爱巴苏(Epaxal Berna ;病毒体甲型肝炎疫苗)，手术，例如肠切除、狭部成形术或临时或持久结肠造口术或回肠造口术；抗真菌药物，例如制霉菌素(一种广谱消化道抗真菌剂)以及伊曲康唑(itraconazole ;斯皮仁诺 (Sporanox))或氟康唑(fluconazole ;大扶康(Diflucan));替代药物、益生元以及益生菌、 大麻，驱虫疗法或猪鞭虫卵子。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗牛皮癣可以与例如治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合。治疗牛皮癣的这类已知治疗剂的非限制实例包括通常用于轻微疾病的外用剂、用于中度疾病的光线疗法，以及用于严重疾病的全身剂。 外用剂的非限制实例沐浴溶液和保湿剂、矿物油以及凡士林油；含有以下物质的药膏和乳膏煤焦油、蒽三酹(蒽啉)、皮质类固醇如去轻米松(desoximetasone, Topicort)、倍他米松(Betamethasone)、氟轻松乙酸酯(fluocinonide)、维生素D3类似物(例如卡泊三醇 (calcipotriol)),以及维甲酸。光线疗法的非限制实例日光；311_313nm的波长、补骨脂素以及紫外线A光线疗法(PUVA)。全身剂的非限制实例生物制剂，例如白介素拮抗齐[J, TNF- α阻断剂,包括抗体,例如英利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、戈利木单抗、塞妥珠单抗，以及重组TNF诱饵受体、依那西普(Enbrel);靶向T细胞的药物，例如伊法利单抗(efalizumab ;Xannelim/Raptiva)、阿法赛特(alefacept ;Ameviv)、树突状细胞诸如伊法利单抗；靶向细胞因子的单克隆抗体(MAb)，包括抗-1L-12/IL-23 (乌泰努单抗(商标Stelara))以及抗-白介素_17 ;必克努单抗(ABT-874);小分子，包括但不局限于ISA247 ;免疫抑制剂，例如甲氨喋呤、环孢素；维生素A以及维甲酸(维生素A的合成形式)；以及替代疗法，例如改变饮食和生活方式、禁食期、低能量饮食以及素食饮食、补充富含维生素A和维生素D的鱼油(例如鱼肝油)、富含两种Ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸酸(DHA)的鱼油并且含有维生素E的饮食、鱼疗(Ichthyotherapy)、催眠术疗法、大麻。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗I型糖尿病可以与例如治疗I型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合。治疗I型糖尿病的这类已知治疗剂的非限制实例包括胰岛素、胰岛素类似物、胰岛移植、干细胞疗法，包括PROCHYMAL ， 非胰岛素疗法，例如IL-1 β抑制剂，包括阿那白滞素(Kineret )、阿巴西普 (Orencia )、戴艾米(Diamyd)、阿法赛特(Ameviv )、奥西珠单抗(Otelixizumab)、 DiaP印277 (Hsp60衍生肽)、α1-抗胰蛋白酶、泼尼松、硫唑嘌呤、环孢素、El-1NT (包含表皮生长因子类似物和胃泌素类似物的可注射胰岛再生疗法)，他汀类药物，包括 Z.ocoi· .、Si ml up . Simcard > Simvacor 西他列汀(Sitagliptin ; 二肽基肽酶 (DPP-4)抑制剂)、抗-⑶3mAb (例如替丽珠单抗(Teplizumab)) ;CTLA4_Ig (阿巴西普)、抗 IL-1 β (康纳单抗(Canakinumab))、抗-⑶20mAb (例如,利妥昔单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗葡萄膜炎可以与例如治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合。治疗葡萄膜炎的这类已知治疗剂的非限制实例包括皮质类固醇、外用睫状肌麻痹剂，例如阿托品(atropine)或后马托品(homatropine), 或PSTTA注射剂(后眼筋膜囊下乙酸去炎松(posterior subtenon triamcinolone acetate))、抗代谢物药物,例如甲氨喋呤、TNF- α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗、塞妥珠单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗舍格伦氏综合征可以与例如治疗舍格伦氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合。治疗 舍格伦氏综合征的这类已知治疗剂的非限制实例包括环孢素、匹鲁卡品(pilocarpine ；Salagen)以及西维美林 (cevimeline ;Evoxac)、轻氯喹(Plaquenil)、可的松(cortisone ;泼尼松以及其他)和/或硫唑嘌呤(Imuran )或环磷酰胺(Cytoxan )、地塞米松、沙立度胺、去氢表雄酮、NGX267、瑞巴派特(Rebamipide)、FID114657、依那西普(Etanercept)、Raptiva、贝利木单抗、MabThera (利妥昔单抗)；阿那白滞素、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、异体骨髓间充质干细胞(AlloMSC)、 “Saliwell Crown”的自动神经电刺激。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗全身性红斑狼疮可以与例如治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合。治疗全身性红斑狼疮的这类已知治疗剂的非限制实例包括皮质类固醇以及疾病改进抗风湿药物(DMARD)、通常抗患疟疾药物例如普拉奎尼(Plaquenil)以及免疫抑制剂(例如甲氨喋呤和硫唑嘌呤)、羟氯喹、细胞毒性药物(例如环磷酰胺和霉酚酸酯)、羟氯喹(HCQ)、Benlysta (贝利木单抗)、非类固醇抗炎症药物、泼尼松、骑悉(Cellcept )、普乐可复(Prograf)、阿塞西普(Atacicept)、Lupuzor、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、CellCept (霉酹酸酯)、奥瑞希纳 (Orencia)、CTLA4_IgG4m (RG2077)、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、CNT0136、西法木单抗(Sifalimumab ;MEDI_545)、A-623 (以前 AMG623)、AMG557、罗利珠单抗、帕喹莫德 (paquinimod ;ABR_215757)、LY2127399、CEP-33457、去氢表雄酮、左旋甲状腺素、阿贝莫司钠(abetimus sodium ;LJP394)、美金刚、阿片类药物、雷帕霉素、肾移植、干细胞移植。
本发明在至少一些实施方案中还涵盖连同治疗免疫系统疾病的其他药剂一起使用根据至少一些实施方案的本发明的组合物。例如，MS疾病可用本发明的分子结合但是不局限于以下物质来治疗免疫抑制剂，例如皮质类固醇、环孢菌素、泼尼松、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、TNF- α阻断剂或拮抗剂，或靶向任何炎症细胞因子的任何其他生物制剂、非类固醇抗炎症药物/Cox-2抑制剂、轻氯喹、柳氮磺批唳(sulphasalazopryine)、金盐、依那西普、英利昔单抗、雷帕霉素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、他克莫司、巴利昔单抗、癌得星(Cytoxan)、干扰素β-la、干扰素β-lb、乙酸格拉替雷、米托蒽醌盐酸盐、阿那白滞素和/或其他生物制剂。 C10RF32多肽、其片段或融合蛋白也可结合一种或多种以下调控免疫应答的药剂来使用 可溶性gp39 (又称为⑶40配体(⑶40L)、⑶154、T-BAM、TRAP)、可溶性⑶29、可溶性⑶40、 可溶性CD80 (例如ATCC68627)、可溶性CD86、可溶性CD28 (例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性 ELAM-1、可溶性 CD44、与 gp39 反应的抗体(例如 ATCC HB-10916、ATCC HB-12055 以及 ATCC HB-12056)、与CD40反应的抗体(例如ATCC HB-9110)、与B7反应的抗体(例如ATCC HB-253、 ATCC CRL-2223、ATCCCRL-2226、ATCC HB-30UATCC HB-11341 等)、与 CD28 反应的抗体(例如 ATCC HB-11944 或 mAb9. 3)、与 LFA-1 反应的抗体(例如 ATCCHB-9579 和 ATCC TIB-213)、与 LFA-2反应的抗体、与IL-2反应的抗体、与IL-12反应的抗体、与IFN- Y反应的抗体、与⑶2 反应的抗体、与⑶48反应的抗体、与任何ICAM反应的抗体(例如ICAM-1 (ATCCCRL-2252)、 ICAM-2以及ICAM-3)、与CTLA4反应的抗体(例如ATCCHB-304)、与Thy-1反应的抗体、与 CD56反应的抗体、与CD3反应的抗体、与CD29反应的抗体、与TCR反应的抗体、与VLA-4反应的抗体、与VCAM-1反应的抗体、与LECAM-1反应的抗体、与ELAM-1反应的抗体、与CD44 反应的抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体是优选的。在其他实施方 案中，抗体片段是优选的。如本领域技术人员将容易理解，组合可包括C10RF32多肽、其片段或融合蛋白与一种其他免疫抑制剂、与两种其他免疫抑制剂、与三种其他免疫抑制剂等。确定优化组合以及剂量可使用本领域中熟知的方法来确定并优化。
C10RF32多肽、其片段或融合蛋白也可结合一种或多种以下药剂来使用L104EA29YIg, CD80 单克隆抗体(mAb)、CD86mAb、gp39mAb、CD40mAb、CD28mAb ;抗-LFAlmAb、 靶向免疫系统机制例如⑶52 (阿来组单抗)、⑶25 (达利珠单抗)、VLA-4 (那他珠单抗)、 CD20 (利妥昔单抗)、IL2R (达利珠单抗)以及MS4A1 (奥瑞珠单抗)的抗体或其他药剂；新的口服免疫调节剂已表明可防止淋巴细胞从淋巴器官再循环，例如芬戈莫德(fingolimod; FTY720)或导致淋巴细胞耗尽，例如米留斯(口服克拉屈滨(cladribine))或特立氟胺 (teriflunomide);以及防止免疫活化的药剂,例如panaclar (延胡索酸二甲酯BG-12)或拉喹莫德(ABR216062)。其他组合将容易由本领域技术人员认识到并且理解。
可溶性C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可作为单独活性成分或连同免疫调节方案中的其他药物或其他抗炎症剂一起给予例如用于治疗或预防同种异体或异种移植急性或慢性排斥反应或炎症性或自身免疫病症，或诱导耐受性。例如，它可与以下物质组合使用钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK506 ;免疫抑制大环内酯类，例如雷帕霉素或其衍生物；例如40-0-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、淋巴细胞归巢剂，例如FTY720或其类似物、皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨喋呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦可酚酸；霉酚酸酯；15-脱氧精胍菌素或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体的单克隆抗体，例如 MHC、CD2、CD3、CD4、CDlla/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、 CD137、I COS, CD150 (SLAM)、0X40、4_1BB或其配体；或其他免疫调节化合物，例如CTLA4/ CD28-1g，或其他粘附分子抑制剂，例如mAb或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂以及VLA-4拮抗剂。
当C10RF32多肽、其片段或融合蛋白结合例如在上文中指定的其他免疫抑制/免疫调节或抗炎症疗法来给予时，共同给予的免疫抑制剂、免疫调节或抗炎症化合物的剂量当然取决于所使用的共用药物的类型(例如它是类固醇或是环孢菌素)、所使用的具体药物、所治疗的病状等等而变化。
治疗使用的方法
在此披露的C10RF32多肽，或其片段或融合作为治疗剂是有用的。根据至少一些实施方案，免疫细胞，优选地T细胞，可在体内或离体与C10RF32融合多肽接触以便降低或抑制免疫应答，包括但不局限于炎症。与C10RF32融合多肽接触的T细胞可以是表达T细胞受体，包括α/β以及Y / δ T细胞受体的任何细胞。T-细胞包括表达⑶3的所有细胞， 包括还表达⑶4和⑶S的T-细胞子集。T-细胞包括初始和记忆细胞以及效应细胞，例如 CTLo T-细胞还包括例如 Thl、Tel、Th2、Tc2、Th3、Thl7、Th22、Treg 以及 Trl 细胞的细胞。 T-细胞还包括NKT-细胞以及T-细胞谱系的相似独特类别。例如，这些组合物可用于调节 ThU Thl7、Th22或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。这些组合物也可用于增加或促进Treg的活性、增加Treg的例如IL-10细胞因子的产生、增加 Treg的分化、增加Treg的数量或增加Treg的存活。这些组合物也可用于增加或促进Th2 细胞的活性、增加Th2细胞的例如IL-10或IL-4细胞因子的产生、增加Th2细胞的分化、增加Th2细胞的数量或增加Th2细胞的存活。
在一些实施方案中，所披露的C10RF32多肽，其片段或融合物结合第二治疗剂来给予。组合疗法可以适用于免疫调节。在一些实施方案中，C10RF32多肽，或片段，或融合物可用于减弱或逆转促炎症性药物的活性，和/或限制这类药物的不良影响。可以用所披露的C10RF32多肽、其片段或融合物来治疗的其他免疫细胞包括T细胞前体、抗原呈递细胞 (例如树突状细胞和单核细胞或其前体)、B细胞或其组合。C10RF32组合物可用于调节B细胞的抗体产生，方法是通过使B细胞与有效量的C10RF32组合物接触以便相对于对照来抑制或减少B细胞的抗体产生。C10RF32组合物也可调节B细胞的细胞因子产生。
治疗炎症应答的方法
C10RF32多肽、其片段或融合蛋白抑制T细胞活化，如T细胞增殖以及细胞因子分泌所表明的。确切地，这些蛋白抑制Thl和Thl7应答，同时促进Th2应答。
C10RF32多肽、其片段或融合蛋白潜在地用于治疗要求下调共刺激通路和/或因此要求下调Thl和/或Thl7应答的疾病。
另一个实施方案提供治疗或减轻炎症的一个或多个症状的方法。在一个进一步的实施方案中，所披露的这些组合物以及方法可以用于治疗慢性并且持续的炎症。炎症一般可以使用所披露的C10RF32多肽或其片段或融合物来治疗。
可抑制或降低受试者(优选为人类)的免疫应答(包括炎症)，方法是给予有效量的 C10RF32多肽或其片段或融合物以便抑制或减少免疫细胞的生物活性或减少炎症部位的促炎症分子的量。示例性促炎症分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF_ β、IFN-Y、IL-17、 IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。Thl和Thl7是可以被C10RF32多肽、其融合蛋白或片段靶向而抑制以便抑制或减少炎症的示例性T细胞。
不希望受关于此生物机制或在此描述的任何其他生物机制的单一假设限制， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以用于通过任何或所有以下机制来治疗炎症抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a , TGF- β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及MMP ;抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的活性，这些炎症分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN1、IL-17, IL-6, IL-23、IL-22、IL-21以及MMP ;抑制或减少Thl和/或Thl7通路；抑制或减少ThU Thl7、 Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的细胞因子产生和/或分泌，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN1、IL-17, IL-6IL-23、IL-22, IL-21以及MMP ;抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的增殖，这些炎症分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN- y , IL-17, IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。
额外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白还可以增强Th2免疫应答。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白还可以直接作用于Th2细胞以便促进或增强IL-4、IL-5或IL-10的产生，或增加Th2细胞的数量，从而导致Thl和/或Thl7的抑制，以及经由Thl/Th2转变的免疫调节。
额外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可导致Treg对于免疫应答具有增强的抑制作用。Treg可抑制Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。例如，C10RF32 多肽、其片段或融合蛋白可引起Treg对于Thl和/或Thl7细胞具有增强的抑制作用以便相应地减少所产生的IFN-Y和IL-17水平。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白还可直接作用于Treg以便促进或增强IL-10的产生，从而抑制Thl和/或Thl7通路，和/或增加Treg 的数量。
额外 地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以引起Th2对于免疫应答具有增强的调节作用。Th2细胞可调节Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，这些炎症分子包括但不局限于 IL-1 β , TNF- a , TGF- β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。例如， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可引起Th2细胞对于Thl和/或Thl7细胞具有增强的调节作用，以便相应地减少所产生的IFN-Y和IL-17的水平。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白还可直接作用于Th2细胞以便促进或增强IL-10的产生，从而抑制Thl和/或Thl7通路，和/或增加Th2细胞的数量。
不希望受单一假设限制，据信C10RF32多肽、其片段或融合蛋白作用于多个T细胞通路中的多个点。例如，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可抑制初始T细胞分化成Thl或 Thl7细胞。可替代地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可与Thl细胞或Thl7细胞或这两种细胞相互作用以便抑制或减少促炎症分子的产生。
额外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可增加Th2分化和/或促进Th2应答，导致对于Thl和/或Thl7通路的免疫调节作用，从而减少所产生的INF- Y和/或IL-17的水平。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白增强IL-10从细胞(例如Th2和/或Treg)产生，这进而抑制Thl和/或Thl7细胞的活性。
额外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以影响Treg，以便对于Thl和/或 Thl7通路具有增强的抑制作用，从而减少所产生的INF-γ和/或IL-17的水平。额外地， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以增强对Thl和/或Thl7细胞活性进行抑制的IL-10的产生。
抑制Thl应答
a.抑制Thl发育
抑制或减少炎症的一种方法包括给予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白、变体或其片段，以便抑制对其有需要的受试者的Thl发育。可通过给予C10RF32多肽、其融合蛋白、片段或其变体来阻断初始T细胞分化成Thl细胞，从而抑制或降低炎症。在一个实施方案中，C10RF32多肽或其融合蛋白可抑制或减少Thl细胞的增殖。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白也可通过阻断抗原呈递细胞成熟来减少初始T细胞分化成Thl细胞。可替代地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白增加Th2细胞分化并且由此减少受试者的Thl细胞数。通过限制可以在受试者体内发育的Thl细胞的数量，可以降低或遏制促炎症分子，例如 INF-γ的量。INF-γ刺激包括IL-Ιβ、TNF-a以及MMP的其他促炎症分子的产生或释放。 因此，通过控制受试者中的Thl细胞数，可以控制这些其他促炎症分子的水平，由此减少炎症应答。
b.抑制促炎症分子
另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段，以便抑制或减少Thl细胞的促炎症分子产生，来抑制或减少受试者中的炎症的方法。
Thl细胞产生的示例性促炎症分子包括IFN- Y。在此实施方案中，C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段可以直接与Thl细胞相互作用并且抑制或减少Thl细胞的IFN-Y产生。在此实施方案中，调控促炎症分子的量而非Thl细胞的群体。
抑制Th 17应答
a.抑制Th 17发育
还可通过给予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合物以便抑制或阻断初始T细胞发育成Thl7细胞来抑制或减少受试者中的炎症。在一个实施方案中，C10RF32多肽或融合蛋白将Treg对于初始T细胞分化成Thl7细胞的抑制活性增加了足以减少受试者的Thl7 细胞数的量。可替代地，C10RF32多肽或其融合蛋白抑制或减少Thl7细胞的增殖。C10RF32 多肽或其融合蛋白也可以通过阻断抗原呈递细胞成熟来减少初始T细胞分化成Thl7细胞。 通过减少受试者的Thl7细胞群，可以减少IL-17，以及IL-22和IL-21的量。IL-17是引起其他促炎症分子，例如IL-1 β、TNF-α以及MMP增加的促炎症细胞因子。因此，通过减少 IL-17的量，可减少这些其他促炎症分子，从而减少或抑制炎症。
b.抑制 IL-17 产生
仍另一个实施方案提供一种通过给予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段以便抑制Thl7细胞的IL-17以及IL-22和IL-21产生来治疗受试者中炎症的方法。在此实施方案中，C10RF32多肽或融合蛋白可以直接作用于Thl7细胞，例如通过结合至Thl7 细胞，导致抑制那些Thl7细胞的IL-17 (或IL-22和IL-21)产生。如以上提及，抑制或减少IL-17 (以及IL-22或IL-21)导致减少其他促炎症分子，由此减少或抑制炎症。
抑制Thl和Th 17应答
所披露的C10RF32多肽、其融合蛋白以及片段可以用于同时抑制Thl和Thl7通路。使用一种抗炎症剂来抑制两种单独通路提供了免疫应答的更鲁棒抑制或减少。
促进Th2应答和IL-10产生。
还可通过将C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段以有效增强Th2应答以及IL-10 产生细胞的抑制活性、并且增强对于Thl和/或Thl7通路的抑制或调节活性的量给予至受试者来治疗炎症。在此实施方案中，所披露的C10RF32多肽以及融合蛋白引起对于IFN-Y 和/或IL-17产生的增加的抑制作用。另一个实施方案提供一种通过给予有效量的C10RF32 多肽、其融合蛋白或其片段以便增加Th2、Treg或其他免疫细胞的IL-10产生来治疗炎症的方法。
增加的IL-10产生导致Thl7细胞的IL-17产生降低以及Thl细胞的IFN-Y产生降低。在此实施方案中，C10RF32多肽、其融合蛋白以及片段可以直接与免疫细胞相互作用以便增加IL-10产生。
仍另一个实施方案提供一种通过给予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白及其片段以便抑制或干扰Thl通路和Thl7通路、并且增强Th2细胞对于Thl和/或Thl7通路的抑制作用来治疗炎症的方法。
C10RF32多肽、其融合蛋白及其片段还可按有效增加Th2细胞群或数量的量给予至受试者。
可以通过使Th2细 胞、Treg或其他免疫细胞与有效量的C10RF32多肽、C10RF32融合蛋白或其具有C10RF32活性的片段接触以便相对于对照来增加IL-10产生。该增加可以在体外或在体内发生。
待治疗的炎症性疾病
在此描述了可使用C10RF32融合多肽来治疗的免疫相关疾病和病症。
C10RF32作为主要调控因子而作用于炎症通路中的多个点以便控制效应细胞因子，例如IFN- Y和TNF- α的表达和/或活性。因此，在此描述的C10RF32组合物在治疗对于TNF-α阻断剂,例如Enbrel、英利昔单抗、赛妥珠单抗以及阿达木单抗不起反应的患者， 或在TNF-α阻断剂不安全或无效时特别有用。另外，由于其在炎症通路中作为主要调控因子的活性，所披露的C10RF32组合物特别适用于治疗慢性并且持续的炎症。在一个进一步的实施方案中，在此描述的C10RF32组合物用于治疗复发性和/或缓解性多发性硬化。
抑制表位扩展
表位扩展是指B和T细胞免疫应答在从自身抗原上的单一决定子到许多位点的特异性水平上，并且在V基因使用水平上发生多样化的能力(Monneaux (曼努斯)，F.等人，关节炎和风湿症(Arthritis&amp; Rheumatism), 46 (6) : 1430-1438 (2002 年))。表位扩展不局限于全身性自身免疫疾病。它已经在人类，以及具有各种髓磷脂蛋白的EAE诱导实验动物中的的T细胞依赖性器官特异性疾病，例如I型糖尿病和多发性硬化中得到描述。
表位扩展涉及相同自身分子中的新的表位连同存在于相同大分子复合物中有关的蛋白中的表位的获得性识别。表位扩展可通过测量延迟型过敏(DTH)应答来评估，其方法是本领域中已知的。
一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白来抑制或减少受试者的表位扩展的方法。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、 其片段或融合蛋白抑制患有多发性硬化的个体的表位扩展。优选地，C10RF32多肽或其融合物抑制或阻断炎症通路的多个点。
仍另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌来抑制或减少患有多发性硬化的受试者的表位扩展的方法，这些炎症分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN_ Y、 IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增强Treg的IL-10分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合来治疗多发性硬化的方法。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便与Th2细胞相互作用、增强Th2活性、促进或增强Th2细胞的IL-10分泌、增加Th2细胞数、增加Th2细胞的免疫调节能力或其组合来治疗多发性硬化的方法。
诱导免疫耐受性
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、 其片段或融合蛋白来诱导或重建受试者的免疫耐受性的方法。 在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白诱导患有免疫相关疾病的个体的耐受性。在一个具体实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白诱导患有多发性硬化的个体的耐受性。优选地，C10RF32多肽或其融合物抑制或阻断炎症通路的多个点。在另一个具体实施方案中， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白诱导患有类风湿性关节炎的个体的耐受性。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便与Treg相互作用、增强Treg活性、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合来诱导免疫耐受性而治疗免疫相关疾病的方法。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C10RF32 多肽、其片段或融合蛋白以便促进或增强免疫细胞的IL-10分泌来治疗免疫相关疾病的方法。
组合疗法
C10RF32融合多肽可单独或与另外治疗剂组合来使用。该另外治疗剂包括但不局限于免疫抑制剂(例如针对其他淋巴细胞表面标记(例如CD40、α -4整联蛋白)或针对细胞因子的抗体)，其他融合蛋白(例如CTLA-4-lg ( Orencia )、TNFR-1g ( Enbrel ))， TNF-α阻断剂，例如Enbrel、英利昔单抗、赛妥珠单抗以及阿达木单抗，环磷酰胺(CTX)(即 Encloxan 、Cytoxan 、Neosai' 、Proc>4ox 、Rev immune ),甲氨喋呤(MTX)(即Rheumatrex 、Trexall )，贝利木单抗(即Benlysta )，或其他免疫抑制药物(例如环孢菌素A、FK506样化合物、雷帕霉素化合物或类固醇)，抗增殖剂，细胞毒性剂，或可以有助于免疫抑制的其他化合物。
在一个进一步的实施方案中，该额外治疗剂起作用以便通过单独通路来抑制或减少T细胞活化。在一种这样的实施方案中，该额外治疗剂为CTLA-4融合蛋白，例如 CTLA-4-1g (阿巴西普)。CTLA-4-1g融合蛋白与T细胞上的共刺激受体⑶28竞争以便结合至抗原呈递细胞上的⑶80/⑶86(Β7-1/Β7-2)，并且因此起作用来抑制T细胞活化。在另一个实施方案中，该另外治疗剂是被称为贝拉西普的CTLA-4-1g融合蛋白。贝拉西普含有在体内显著地增加其对于⑶86的亲合力的两个氨基酸取代(L104E和A29Y)。在另一个实施方案中，该额外治疗剂是Maxy-4 (马克西_4)。
在另一个实施方案中，第二治疗剂为环磷酰胺(CTX)。环磷酰胺 (Cyclophosphamide) ( Endoxan ，Cytoxan 、Neosai·1 、Procytox 、Rev immune 的通用名称)，又称为环磷酰胺(cytophosphane),是来自卩惡唑弗林(oxazophorine)组的氮芥烷基化剂。它用于治疗不同类型的癌症以及一些自身免疫病症。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白与CTX以预防或治疗慢性自身免疫疾病或病症， 例如全身性红斑狼疮(SLE)的有效量共同给予。环磷酰胺(CTX)是用于患有肾狼疮的患者的弥漫增生性肾小球肾炎的主要药物。在一些实施方案中，组合疗法以减少抗-双链 DNA(抗-ds DNA)自身抗体的血液或血清水平和/或减少对其有需要的患者的蛋白尿的有效量来给予。
在另一个实施方案中，第二治疗剂增加血清中的腺苷量，参见例如W008/147482。 在一个进一步的实施方案中，第二治疗剂为增加⑶73表达的⑶73-1g、重组⑶73或另一种药剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)，参见例如W004/084933。在另一个实施方案中，第二治疗剂为干扰素_β。在另一个实施方案中，第二治疗剂为那他珠单抗或用于MS 的另一种治疗剂。在一个进一步的实施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白与那他珠单抗循环使用或在药物假期期间使用，以便允许第二治疗剂给药的频率更低并且减少副作用，例如PML的风险并防止对于第二治疗剂的抗性。
在另一个实施方案中，第二治疗剂优先治疗慢性炎症，由此治疗方案靶向急性和慢性炎症。在一个进一步的实施方案中，第二治疗剂是TNF-α阻断剂。
在另一个实施方案 中，第二治疗剂是抑制或减少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的小分子，这些炎症分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-α、TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6, IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。在另一个实施方案中，第二治疗剂是与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增强Treg的IL-10分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合的小分子。
典型地有用的小分子是有机分子，优选地是具有大于100并且小于约2，500道尔顿，更优选地在100与2000之间，更优选地在约100与约1250之间，更优选地在约100与约 1000之间，更优选地在约100并约750之间，更优选地在约200与约500道尔顿之间的分子量的小有机化合物。小分子包括与蛋白结构性相互作用所必需的官能团，特别是氢键合，并且典型地至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选地包括这些官能化学基团的至少两种。小分子经常包括用一个或多个以上官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳环结构。 小分子还包括生物分子，包括肽类、糖类、脂肪酸类、类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物类、 结构类似物或其组合。在一个实施方案中，小分子是视黄酸或其衍生物。以下实例证明视黄酸抑制或减少ThI7细胞的分化和/或活性。在一个进一步的实施方案中，这些组合物与增加Treg活性或产生的化合物组合或顺次使用。示例性Treg增强剂包括但不局限于糖皮质激素氟替卡松(glucocorticoid fluticasone)、沙美特罗(salmeterol)、IL-12、IFN- Y 以及IL-4的抗体；维生素D3，以及地塞米松及其组合。其他促炎症分子的抗体也可与所披露的C10RF32多肽、其融合蛋白或片段组合或交替使用。优选的抗体结合至IL-6、IL-23、 IL-22 或 IL-21。
如在此使用，术语“雷帕霉素化合物”包括中性三环化合物雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物，以及被认为具有与雷帕霉素相同的作用机制(例如，抑制细胞因子功能)的其他大环内酯类化合物。措辞“雷帕霉素化合物”包括具有与雷帕霉素结构相似性的化合物，例如具有被修饰以便增强其疗效的相似大环结构的化合物。示例性雷帕霉素化合物是本领域中已知的。措辞“FK506样化合物”包括FK506，以及FK506衍生物和类似物， 例如具有与FK506结构相似性的化合物，例如具有被修饰以便增强其疗效的相似大环结构的化合物。FK506样化合物的实例包括例如W000101385中描述的那些化合物。优选地，如在此使用的措辞“雷帕霉素化合物”不包括FK506样化合物。
其他适合的治疗剂包括但不局限于抗炎症剂。抗炎症剂可为非类固醇、类固醇或其组合。一个实施方案提供含有约1% (w/w)至约5% (w/w)、通常约2.5% (w/w)抗炎症剂的口服组合物。非类固醇抗炎症剂的代表性实例包括但不局限于昔康类药物 (oxicams),例如卩比罗昔康(piroxicam)、伊索昔康(isoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、舒多昔康(sudoxicam);水杨酸酯类，例如阿斯匹林、双水杨酸酯制剂(disalcid)、贝诺酯 (^611(^713七6)、三水杨酸胆碱镁(11'；[1丨83七6)、沙发朴林(83€3。1711)、索朴林(80]^1'；[11)、双氟尼酸(difIunisal)以及芬多沙(fendosal)；乙酸衍生物,例如双氯芬酸(diclofenac)、 芬氯酸(fenclofenac)、卩引哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀 (10111161；[11)、伊索克酸(丨8( 6。30)、呋罗芬酸(；1!\11'(^61^0)、硫平酸(1；[(^；[1^0)、齐多美辛 (zidometacin)、阿西美辛(acemetacin)、芬替酸(fentiazac)、佐美酸(zomepirac)、克仑达那(clm danac)、奥昔平酸(oxepinac)、吩布默克(felbmac)以及酮咯酸(ketorolac)； 芬那酯衍生物类(fenamates),例如甲灭酸(mefenamic)、甲氯芬那酸(meclofenamic)、氟灭酸(flufenamic)、尼氟灭(niflumic)以及托芬那酸酸(tolfenamic acid);丙酸衍生物，例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、氟比洛芬 (flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、芬布芬(fenbufen)、口引哚洛芬(indoprofen)、卩比洛芬(pirprofen)、卡洛芬(carprofen)、奥沙普秦(oxaprozin)、 普拉洛芬(pranoprofen)、咪洛芬(miroprofen)、硫恶洛芬(tioxaprofen)、舒洛芬 (suprofen)、阿明洛芬(alminoprofen)以及噻洛芬酸(tiaprofenic);卩比唑，例如苯基丁氮酮(phenylbutazone)、轻保松(oxyphenbutazone)、非泼拉酮(feprazone)、阿扎丙酮 (azapropazone),以及三甲保泰松(trimethazone)。也可以釆用这些非类固醇抗炎症剂的混合物。
类固醇抗炎症药物的代表性实例包括但不局限于皮质类固醇类，例如氢可的松(hydrocortisone)、轻基-曲安西龙(hydroxyl-triamcinolone)、α -甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、地塞米松憐酸酯(dexamethasone-phosphate)、 二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、氯倍他索戊酸酯(clobetasol valerate)、轻泼尼缩松(desonide)、去氧米松(desoxymethasone)、乙酸去氧皮质酮 (desoxycorticosterone acetate)、地塞米松、双氯松(dichlorisone)、双氟拉松双乙酸 Ih (diflorasone diacetate)、双氟米松戊酸酯(diflucortolone valerate)、 氟氢缩松(fluadrenolone)、氟氯缩松(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟米松特戊酸酯(flumethasone pivalate)、游离氟轻松 (fIuosinolone &06如111(16)、氟轻松乙酸酯([1110(3；!_110111(16)、氟氯可汀丁基酯(fIucortine butylesters)、氟可龙(fluocortolone)、氟泼尼定(fIuprednidene ；fIuprednyIidene) 乙酸酯、氟雄诺龙(flurandrenolone)、哈西缩松(halcinonide)、乙酸氢化可的松 (hydrocortisone acetate)、氢可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、甲基泼尼松龙(methy lpredni so lone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、 可托多松(cortodoxone)、肤轻松(flucetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、二氟若松双乙酸酯(difluorosone diacetate)、氟若卓龙(fluradrenolone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、二氟乐松双乙酸酯(diflurosone diacetate)、氟若卓龙安奈德 (fluradrenolone acetonide)、甲轻松(medrysone)、安西那飞(amcinafel)、安西非特 (amcinafide)、倍他米松(betamethasone)以及其平衡酯、氯泼尼松(chloroprednisone)、 克洛泼尼龙乙酸酯(chlorprednisone acetate)、可洛替龙(clocortelone)、可洛西龙(clescinolone)、双氯松(dichlorisone)、二氟泼耐酯(diflurprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米 % (f Iuoromethalone)Λ 氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氢可的松戊酸酉旨(hydrocortisone valerate)、氢可的松环戊丙酸酯(hydrocortisone cyclopentylpropionate)、氢可松氨酯(hydrocortamate)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、波尼松龙(prednisolones)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、曲安西 龙(triamcinolone)及其混合物。
药用组合物
本发明在一些实施方案中的特征在于一种包含治疗有效量的根据本发明的治疗剂的药用组合物。根据本发明，该治疗剂可为可溶性C10RF32蛋白、C10RF32胞外域、或其片段或变体、或融合蛋白或对应核酸编码序列中的任何一个。根据本发明的药用组合物进一步用于治疗自身免疫性并且优选地用于治疗在此描述的免疫相关病症。本发明的治疗剂可以单独，或作为它们与药学上可接受的载体混合于其中的药用组合物的一部分来提供给受试者。
如在此使用，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、 皮下、肠胃外、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。取决于给予途径，根据本发明的至少一些实施方案的活性化合物，即可溶性C10RF32蛋白、C10RF32胞外域、或其片段或变体、 或融合蛋白、或对应的编码药用化合物的核酸序列，可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望生物活性并且不赋予任何不希望有的毒性效应的盐(参见例如Berge (贝尔热)，S.M.等人(1977年)药理学杂志(J. Pharm. Sc1. ) 66:1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些盐，这些无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等等，以及来源于无毒有机酸的盐，这些有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸类、脂族以及芳族磺酸等等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些盐，这些碱土金属例如钠、钾、镁、钙等等，以及来源于无毒有机胺的盐，这些有机胺例如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等等。
根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括(I)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；以及(3) 金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸、以及类似物。根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物还可包含添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如， TWEEN20 (聚山梨醇酯-20)，TWEEN80 (聚山梨醇酯-80))以及防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇) 以及增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。
可用于根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、不同缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH以及离子强度的缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、以及其适合的混合物、植物油， 例如橄榄油，以及可注射有机酯，例如油酸乙酯。
适当流动性可例如通过使用涂层材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所要求粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防存在微生物可通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯 (paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸、以及类似物来确保。可能还希望将等渗剂，例如糖、氯化钠、以及类似物包括于组合物中。另外，可通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝以及明胶来实现可注射药物形式的延 长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这些介质和试剂对于药学活性物质的使用在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物中的用途。辅助活性化合物也可以并入组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用涂层，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所希望粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，可取的是将等渗剂，例如糖、多元醇 (例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠包括在组合物中。可通过在组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的延迟吸收的试剂来实现可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上,分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备, 该无菌媒介物含有一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)， 这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的受试者以及具体给予模式而变化。可与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量总体上是产生治疗效果的组合物的量。总体上，在一百个百分数中，此量在从约0.01百分数至约九十九百分数的活性成分的范围内，优选地从约O.1百分数至约70百分数，最优选地从约 I百分数至约30百分数的活性成分以及药学上可接受的载体。
将剂量方案加以调整以便提供最佳所希望应答(例如治疗应答)。例如，可以给予单次丸剂，可随着时间的推移来给予多个分次剂量或剂量可按治疗情况的紧急状态指示来按比例减少或增加。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有预定数量的经过计算结合所需药用载体可产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下因素支配以及直接取决于以下因素(a)活性化合物的独特特征以及待达到的特定治疗效果， 以及(b)调配这种活性化合物以便治疗个体的感受性的领域中固有的限制。
本发明的组合物可经由一种或多种给予途径、使用在本领域中已知的各种方法中的一种或多种来给予。如本领域技术人员将认识到，给予途径和/或模式取决于所希望结果而变化。根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂的优选给予途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱、口服、肠内、直肠、肺部(例如吸入)、鼻腔、外用(包括经皮肤、口 腔以及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、大脑递送 (例如脑室内、大脑内以及对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、髓周以及脊柱内)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内(I V )以及真皮内)、经皮肤(被动地或使用离子电渗或电穿孔)、经粘膜(例如舌下给予、鼻腔、阴道、直肠或舌下)给予或经由植入物给予，或其他肠胃外给予途径，例如通过注射或输注，或在本领域中已知的其他递送途径和/或给予形式。 如在此使用的短语“肠胃外给予”是指除肠内以及局部给予以外的通常通过注射实现的给予模式，并且包括(不局限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜上以及胸骨内注射和输注或使用可生物蚀解的插入物，并且可配制成适合于每一种给予途径的剂型。在一个具体实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白、治疗剂或药用组合物可腹膜内或静脉内给予。
本发明的组合物在以具有小于约5微米的气体动力学直径的气溶胶亦或喷雾干燥颗粒形式递送时，可以在吸入时被递送至肺并且横穿肺上皮衬里到达血流。可使用被设计成经肺部递送治疗产品的广泛范围的机械装置，包括但不局限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。可购得装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗制药公司(Mallinckrodt Inc.),密苏里州圣路易斯(St. Louis, Mo. )) ;Acorn II 雾化器(Marquest Medical Products,科罗拉多州恩格尔伍德 (Englewood, Colo. )) ；Ventolin计量剂量吸入器(Glaxo Inc.,北卡罗来纳州研究三角园 (Research Triangle Park, N. C.));以及 Spinhaler 粉末吸入器(Fisons Corp.公司，马萨诸塞州贝德福德(Bedford, Mass. ))。Nektar、Alkermes以及Mannkind都具有经过批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中这种技术可应用于在此描述的配制品。
在一些体内方法中，在此披露的组合物以治疗有效量给予至受试者。如在此使用， 术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗的病症的一个或多个症状或以其他方式提供所希望药理和/或生理效应的剂量。确切剂量将根据各种因素，例如受试者依赖变量(例如年龄、免疫系统健康状况、等)、疾病以及所实现的治疗而变化。对于在此披露的多肽组合物以及编码它们的核酸，在进行进一步研究时，关于治疗不同患者的不同病状的适当剂量水平的信息将出现，并且本领域普通技术人员，考虑到接受者的治疗情况、年龄以及一般健康状况，将能够确定适当剂量。选择的剂量取决于所希望的治疗效果、 给予途径以及所希望治疗的持续时间。对于多肽组合物，通常将每天O. 0001至100mg/kg体重的剂量水平给予至哺乳动物并且更通常为0. 001至20mg/kg。例如，剂量可为0. 3mg/kg 体重、lmg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在Ι-lOmg/kg范围内。示例性治疗方案必须每周给予一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以更低。剂量方案经过调整以便提供最佳所希望应答(例如治疗应答)。例如，可给予单次丸剂，可随着时间的推移来给予若干分次剂量或剂量可按治疗情况的紧急状态指示来按比例减少或增加。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有预定数量的经过计算结合所需药用载体以产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下因素支配以及直接取决于以下因素(a)活性化合 物的独特特征以及待达到的特定治疗效果，以及(b)调配这种活性化合物以便治疗个体的感受性的领域中固有的限制。
任选地，根据任何适合的定时方案，多肽制剂可以O. 0001至100mg/kg患者体重/ 天之间的量给予，优选为O. 001至20. Omg/kg/天之间。根据本发明的至少一些实施方案的治疗组合物可例如每天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次或每周一次、每两周或3、4、5、6、7或8周一次来给予。此外，组合物可给予短或长时期(例如I周、I月、I年、5 年)。
可替代地，治疗剂可以持续释放配制品形式给予，在此情况下所要求的给予频率更小。剂量和频率取决于治疗剂在患者体内的半衰期而变化。总体上，人类抗体展示最长半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体以及非人类抗体。融合蛋白的半衰期可广泛地变化。给予剂量和频率可取决于治疗是预防性或是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低剂量以相对稀少的间隔在长时期内给予。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中， 有时要求相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到患者展示疾病症状的部分或完全改进为止。此后，可向患者给予预防方案。
本发明的药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可改变以便获得对于具体患者、组合物以及给予模式可有效实现所希望治疗应答，而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所使用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况以及以前病史，以及医学领域熟知的类似因素。
“治疗有效剂量”的C10RF32可溶性蛋白或C10RF32胞外域或含有它们的C10RF32 融合蛋白优选地引起疾病症状的严重度降低、无病症期的频率以及持续时间增加、寿命增加、疾病缓解，或预防或减少归因于疾病折磨的损害或伤残。
本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重度以及所选择的具体组合物或给予途径的因素来确定治疗有效量。
在某些实施方案中，多肽组合物例如通过直接注射至待治疗的部位来局部给予。 典型地，该注射引起多肽组合物的局部浓度增加，它大于可通过全身给予而获得的浓度。例如，在如多发性硬化的神经病症的情况下，蛋白可局部给予至CNS附近的部位。在另一个实例中，如在如类风湿性关节炎的关节病症的情况下，蛋白可局部给予至患病关节中的滑膜。 多肽组合物可与如上所述的基质组合以便通过减少多肽从待治疗的部位中被动扩散出来而帮助建立多肽组合物的增加的局部浓度。
本发明的药用组合物可用在本领域中已知的医学装置来给予。例如，在一个任选的实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物可用针皮下注射装置来给予，例如美国专利号 5，399，163 ;5，383,851 ;5，312，335 ;5，064，413 ;4，941,880 ； 4，790，824 ;或4，596，556中披露的装置。适用于本发明的熟知植入物以及模块的实例包括美国专利号4，487，603，它披露用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4，486，194，它披露经由皮肤给予药物的治疗装 置；美国专利号4，447，233，它披露以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4，447，224，它披露用于连续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4，439，196，它披露具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4，475，196，它披露渗透药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
活性化合物可用保护化合物以便避免快速释放的载体来制备，例如受控释放制剂，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是授予专利的或通常是本领域技术人员已知的。参见例如持续以及受控释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems), J. R. Robinson (罗宾逊)编著，Marcel Dekker, Inc.公司，纽约市(New York)，1978。
治疗组合物可用在本领域中已知的医学装置来给予。例如，在一个任选的实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的治疗组合物可用针皮下注射装置来给予，例如美国专利号 5，399，163 ;5，383，851 ;5，312，335 ;5，064，413 ;4，941，880 ;4，790，824 ；或 4，596，556中披露的装置。适用于本发明的熟知植入物以及模块的实例包括美国专利号 4，487，603，它披露用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4，486，194， 它披露经由皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4，447，233，它披露以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4，447，224，它披露用于连续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4，439，196，它披露具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4，475，196，它披露渗透药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的C10RF32可溶性蛋白、 C10RF32胞外区、C10RF32融合蛋白、其他蛋白或其他治疗剂可经过配制以便确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施方案的治疗化合物穿过BBB (如果希望)，它们可例如在脂质体中进行配制。制造脂质体的方法参见例如美国专利号4，522，811 ;5，374，548;以及5，399，331。脂质体可以包括被选择性运输至特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如 V. V. Ranade (兰纳德)(1989)临床药理学杂志(J. Clin. Pharmacol. ) 29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low (劳)等的美国专利号5，416，016);甘露糖苷(Umezawa (梅泽)等人，(1988)生物化学和生物物理研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun. )153:1038);抗体(P. G. Bloeman (布罗曼)等人(1995)欧洲生物化学学会联盟快讯 (FEBS Lett. )357:140 ；M. Owais (欧维斯)等人(1995)抗微生物制剂和化疗(Antimicrob. Agents Chemother. ) 39:180);表面活性剂蛋白A受体(Briscoe (布里斯科)等人(1995) 美国生理学杂志(Am. J Physiol. ) 1233:134)；pl20 (Schreier (施雷尔)等人(1994)生物化学杂志(J. Biol. Chem. ) 269:9090);也参见 K. Keinanen (凯纳门);M. L. Laukkanen (劳卡南)(1994)欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett. ) 123 ；J. J. Killion (基莱恩);1. J. Fidler (菲德勒)(1994)免疫方法(Immunomethods) 4:273。
肠胃外给予的配制品
在一个进一步的实施方案中，在此披露的组合物，包括含有肽和多肽的那些，以水溶液形式通过肠胃外注射来给予。这种制剂也可呈悬浮液 或乳液形式。通常，所提供的药用组合物包含有效量的肽或多肽，并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这类组合物任选地包括以下物质中的一种或多种稀释剂、无菌水、不同缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH以及离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如，TWEEN20 (聚山梨醇酯-20)，TWEEN80 (聚山梨醇酯-80 ))、抗氧化剂(例如水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚 (BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，以及防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)以及增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物的实例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油 (例如橄榄油和玉米油)、明胶，以及可注射有机酯，例如油酸乙酯。这些制剂可冷冻干燥(冻干)或真空干燥并且在即将使用之前再溶解/再悬浮。这种制剂可通过例如经由细菌保留过滤器来过滤，将灭菌剂并入组合物中，照射组合物，或加热组合物来灭菌。
局部给予的配制品
在此披露的C10RF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体可以局部应用。局部给予对于大多数肽配制品并不能良好地起作用，但是如果应用至肺、鼻腔、口腔(舌下、颊腔)、 阴道或直肠粘膜，它可以是尤其有效的。
组合物在以具有小于约5微米的气体动力学直径的气溶胶或喷雾干燥颗粒形式递送时可在吸入时被递送至肺并且横穿肺上皮衬里到达血流。
可使用被设计成经肺部递送治疗产品的广泛范围的机械装置，包括但不局限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。可购得装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗制药公司(Mallinckrodt Inc.),密苏里州圣路易斯(St. Louis, Mo. )) ;Acorn II 雾化器(Marquest Medical Products,科罗拉多州恩格尔伍德(Englewood, Colo. )) ;Ventolin计量剂量吸入器(Glaxo Inc.公司，北卡罗来纳州研究三角园(Research Triangle Park, N. C.));以及 Spinhaler 粉末吸入器(Fisons Corp.公司,马萨诸塞州贝德福德(Bedford, Mass. ))。Nektar>Alkermes 以及 Mannkind 都具有经过批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中这种技术可应用于在此描述的配制品。
给予至粘膜的配制品典型地将是喷雾干燥的药物颗粒，它们可并入片剂、凝胶剂、 胶囊剂、悬浮液或乳液中。标准药用赋形剂从任何配方设计师处可获得。口服制剂可呈口香糖、凝胶条、片剂或锭剂形式。
还可制备经皮配制品。这些通常是软膏、洗剂、喷雾剂或贴片，全部可使用标准技术来制备。经皮配制品需要包括渗透促进剂。
控制递送聚合物基质
在此披露的C10RF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体也可以在受控释放配制品中给予。可制造受控释放聚合物装置以便在植入聚合物装置(杆、圆柱体、膜、盘)或注射 (微粒)之后全身性长期释放。基质可呈例如微球的微粒形式，其中肽分散于固体聚合物基质或微胶囊中，其中核心具有与聚合物外壳不同的材料，并且肽是分散或悬浮于在性质上可为液体或固体的核心中。除非在此明确定义，否则微粒、微球以及微胶囊可互换使用。可替代地，聚合物可铸造成从数纳米至四厘米范围内的薄板或膜、通过研磨或其他标准技术产生的粉末，或甚至例如水凝胶的凝胶。
可使用不可生物降解亦或可生物降解的基质递送多肽或编码多肽的核酸，但是可生物降解基质是优选的。这些基质可以为天然或合成聚合物，但是合成聚合物由于降解以及释放概况的更好表征而为优选的。该聚合物是基于所希望的释放时段来选择的。在一些情况下，线性释放可为最有用的，但是在其他情况下脉冲释放或“整体释放”可提供更有效的结果。聚合物可以呈水凝胶(通常吸收多达按重量计约90%的水)形式，并且可任选地与多价离子或聚合物交联。
基质可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取以及本领域技术人员已知的其他方法来形成。可生物蚀解的微球可使用开发用于制造微球以便进行药物递送的任何方法来制备，这些方法例如由Mathiowitz (马西威兹)和Langer (朗格尔)，受控释放杂志(受控释放杂志)(J. Controlled Release)，5:13-22 (1987) ；Mathiowitz (马西威兹)等人，反应性聚合物(Reactive Polymers), 6:275-283 (1987);以及 Mathiowitz (马西威兹)等人，应用高分子科学杂志(J. Appl Polymer ScL)，35:755-774 (1988)来描述。
这些装置可经过配制用于局部释放来治疗植入或注射区域一通常递送比用于治疗整个身体或全身递送的剂量少得多的剂量。这些装置可被植入或注射至皮下、肌内、脂肪或被吞咽。
C10RF32的诊断用途
根据本发明的至少一些实施方案的可溶性多肽也可用能够直接或间接地提供可检测信号的标记来修饰，该标记包括但不局限于放射性同位素以及荧光化合物。这类经过标记的多肽可用于不同用途，包括但不局限于疾病和/或指示病状的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测，如以上详述。
根据至少一些实施方案，本发明提供一种对器官或组织成像的方法，该方法包括 (a)向需要这种成像的受试者给予一种经过标记的多肽；以及(b)检测该经过标记的多肽以便确定经过标记的多肽集中于受试者体内的位置。当用于成像应用中时，根据本发明的至少一些实施方案的经过标记的多肽通常具有与其共价或非共价附接的成像剂。适合的成像剂包括但不局限于放射性核素、可检测标签、荧光团、荧光蛋白、酶蛋白、以及类似物。本领域技术人员熟悉将成像剂连接至多肽的其他方法。例如，成像剂可经由部位特异性偶联来附接，例如，将成像剂共价附接至肽连接物，例如存在于Fe融合分子的羧基末端的具有五个至七个精氨酸的聚精氨酸部分。成像剂还可直接经由非位点特异性偶联来连接，例如， 将成像剂共价附接至存在于多肽中的伯胺基团。本领域技术人员认识到成像剂还可经由非共价相互作用(例如离子键、疏水性相互作用、氢键、范德华力、双极子-双极子键等)来结合至蛋白。
在某些情况下，通过将放射性核素直接附接至多肽来将多肽用放射性核素进行放射性标记。在某些其他实例中，放射性核素结合至螯合剂或附接至多肽的螯合剂-连接物。 用于直接偶联的合适放射性核素包括但不局限于18F、1241、1251、131I及其混合物。与螯合剂一起使用的合适放射性核素包括但不局限于、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、 105Rh、lllAg、lllIn、117m Sn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi 及其混合物。优选地，结合至螯合剂的放射性核素是64Cu、90Y、IllIn或其混合物。适合的螯合剂包括但不局限于DOTA、BAD、TETA, DTPA, EDTA、NTA, HDTA、其膦酸酯类似物及其混合物。 本领域技术人员熟悉将放射性核素、螯合剂以及螯合剂-连接物附接至本发明的多肽的 方法。具体地说，附接可便利地使用例如可购得的双官能连接基团(通常为异双官能连接基团)来完成，这些连接基团可附接至存在于多肽的无干扰位置中的官能团，并且然后进一步连接至放射性核素、螯合剂或螯合剂-连接物。
适合于用作成像剂的荧光团或荧光染料的非限制实例包括Alexa Fluor 染料(英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corp.);加利福尼亚州卡尔斯巴德 (Carlsbad, Calif.))、突光素、异硫氰酸突光素(FITC)、OregonGreen ;若丹明、得克萨斯红、异硫氰酸四若丹明(TRITC)、CyDye 荧光剂(例如C Y 2、C Y 3、C Y 5)等等。
适合于用作成像剂的荧光蛋白的实例包括但不局限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(例如DsRed)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及其变体(参见例如美国专利号6，403，374、6，800，733以及7，157,566)。GFP变体的具体实例包括但不局限于增强型GFP (EGFP)、去稳定EGFP、描述于Doan (道安)等人，分子微生物学(Mol. Microbiol. ), 55:1767-1781 (2005)中的GFP变体、描述于Crameri (克莱默里)等人，自然生物技术(Nat. Biotechnol. )，14:315-319(1996)中的 GFP 变体、描述于 Rizzo (里佐)，自然生物技术(Nat. Biotechnol), 22:445 (2004)以及Tsien (钱)，生物化学综合年刊(Annu. Rev. Biochem. ),67:509(1998)中的蔚蓝色荧光蛋白，以及描述于Nagal (内格尔)等人， 自然 生物技术(Nat. Biotechnol. ),20:87-90(2002)中的黄色荧光蛋白。DsRed变体描述于例如 Shaner (谢恩)等人，自然生物技术(Nat. Biotechnol. )，22:1567-1572 (2004) 中并且包括 mStrawberry、mCherry、morange、mBanana、mHoneydew 以及 mTangerine。另外的DsRed变体描述于例如Wang (王)等人，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sc1. )U. S. A.，101:16745-16749(2004)中并且包括 mRaspberry 和 mPlum。DsRed 变体的另外实例包括描述于Fischer (菲舍尔)等人，欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett. )，577:227-232(2004)中的mRFPmars以及描述于Fischer (菲舍尔)等人，欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett. )，580:2495-2502(2006)中的 mRFPruby。
在其他实施方案中，结合至根据本发明的至少一些实施方案的多肽的成像剂包括可检测标签，例如像生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素。在其他实施方案中，成像剂包括酶蛋白，包括但不局限于荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸酶、辣根过氧物酶、木聚糖酶、碱性磷酸酶、以及类似物。
在本领域中已知用于检测受试者体内的放射性核素的放射性发射的任何装置或方法是适用于本发明的。例如，像使用旋转Y射线摄像机来检测单光子Y-发射放射性核素的辐射的单光子发射计算机控制断层摄影术(SPECT)，以及使用闪烁Y射线摄像机来获得放射性核素在组织、器官或身体系统中的分布的一个图像或一系列连续图像的放射性 核素闪烁照相法的方法，可以用于检测从本发明的放射性标记多肽发出的辐射。正电子发射断层术(PET)是用于检测受试者体内的辐射的另一种合适技术。旨在用于医学用途的微型并且灵活的辐射检测器由Intra-Medical LLC (加利福尼亚州圣塔莫尼卡(Santa Monica, Calif.))生产。磁共振成像(MRI)或本领域技术人员已知的任何其他成像技术也适合于检测放射性核素的放射性发射。不管所使用的方法或装置为何，这种检测旨在确定经过标记的多肽集中于受试者体内的位置，并且这种浓度是疾病活性的指标。
动物和人类的非侵入性荧光成像还可提供体内诊断信息并且用于多种临床专科中。例如，多年以来已开发出用于在UV激发之后进行简单眼部观察直至使用先进设备进行复杂光谱成像的技术(参见例如Andersson (安德森)-Engels (恩格斯)等人，医学和生物学中的物理学(Phys.Med.Biol. ),42:815-824(1997))。在本领域中已知的用于体内检测例如来自荧光团或荧光蛋白的荧光的特定装置或方法包括但不局限于体内近红外荧光(参见例如Frangioni (弗兰基尼)，化学生物学目前观点 (Curr. Opin. Chem. Biol. ) ,7:626-634(2003) )、Maestro 体内荧光成像系统(美国剑桥科研仪器公司(Cambridge Research&Instrumentation, Inc.);马萨诸塞州沃本市 (Woburn, Mass.))、使用飞点扫描器的体内突光成像(参见例如Ramanujam (拉马努詹)等人，电气和电子工程师学会生物医学工程学会报(IEEE Transactions on Biomedical Engineering) , 48:1034-1041 (2001)、等。
用于检测光学应答的其他方法或装置包括但不局限于目视检查、CXD摄像机、视频摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或使用光电倍增器管的信号放大。
本发明进一步由以下与C10RF32抗原、其域以及表达数据相关的实例连同描述其完全人类抗体的制造的预测实例来说明。此信息以及实例是说明性的并且不应被视为进一步限制。贯穿本申请引用的所有图以及所有参考文献、专利以及公开专利申请的内容明确地通过引用结合在此。
实例
实例I
H19011_l 簇(H19011)的描述
本发明涉及C10RF32多肽、以及基于其的诊断剂和治疗剂。
应当指出的是这些变体最初披露于与本申请共同拥有的PCT申请号 W02009/032845中，该申请通过弓I用结合在此，如同完全在此阐明一样。
H19011_l簇(内部ID76432827)特征为所感兴趣的2个转录物和5个片段，其名称分别在表I和2中给出。选择的蛋白变体在表3中给出。
表1-所感兴趣的转录物
权利要求
1.一种包括能够抑制T细胞活化的可溶性C10RF32多肽或其片段或变体的分离的多肽用于治疗以下疾病中的一种或多种的用途良性多发性硬化、复发缓解性多发性硬化、继发性进行性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化、进行性复发多发性硬化、慢性进行性多发性硬化、过渡性/进行性多发性硬化、快速恶化性多发性硬化、临床确诊的多发性硬化、 又称为马尔堡变种(Marburg’s Variant)的恶性多发性硬化，以及急性多发性硬化,或选自下组的与多发性硬化有关的病状，该组由以下各项组成德维克氏病(Devic’s disease), 又称为视神经脊髓炎；急性散播性脑脊髓炎、急性脱髓鞘性视神经炎、脱髓鞘横贯性脊髓炎、米勒_费歇尔综合征(Miller-Fisher syndrome)、脑脊髓神经根神经病、急性脱髓鞘多神经病、肿胀性多发性硬化以及Balo同心圆性硬化；或以下疾病中的一种或多种痛风以及假性痛风、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、斯提耳氏病(Still’s disease)、 强直性脊柱炎、类风湿性脉管炎，或选自下组的与类风湿性关节炎有关的病状，该组由以下各项组成骨关节炎、肉状瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、脓毒性关节炎、血色病、肝炎、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、莱姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海热、具有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关周期性综合征，以及与炎症性肠病相关的肠病性关节炎；或以下疾病中的一种或多种前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间葡萄膜炎(扁平部睫状体炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)以及全葡萄膜炎形式；或以下疾病中的一种或多种克罗恩氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、贝切特氏病(Behcet’s disease)、未确定的结肠炎； 或以下疾病中的一种或多种非脓疱性牛皮癣，包括寻常性牛皮癣以及牛皮癣性红皮症(红皮性牛皮癣)；脓疱性牛皮癣，包括泛发性脓疱性牛皮癣(宗布什脓疱性牛皮癣(pustular psoriasis of von Zumbusch))、掌妬脓疱病(永久性掌妬脓疱病、理发师类型的脓疱性牛皮癖(pustular psoriasis ofthe Barber type)、四肢脓疱性牛皮癖)、环状脓疱性牛皮癣、持续性肢端皮炎、疱疹样脓疱病；药物诱导的牛皮癣、皮褶牛皮癣、尿布区牛皮癣、脂溢性皮炎样牛皮癣、滴状牛皮癣、指甲牛皮癣、牛皮癣性关节炎；或以下疾病中的一种或多种 胰岛素依赖性糖尿病、特发性糖尿病、幼年I型糖尿病、青春晚期糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、妊娠糖尿病；神经病变，包括多神经病变、单神经病变、周围神经病变以及自主神经病变；青光眼、白内障或视网膜病变；或以下疾病中的一种或多种原发性舍格伦氏综合征(Primary Sjogren’s syndrome),继发性舍格伦氏综合征(Secondary Sjogren’s syndrome),结缔组织疾病,例如类风湿性关节炎,全身性红斑狼疮，硬皮病，肺炎，肺纤维化，间质性肾炎，肾脏过滤器周围组织的炎症，肾小球性肾炎，肾小管性酸中毒，腕管综合征，周围神经病变，颅神经病变，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝脏(包括肝炎)的炎症，多肌炎，雷诺氏现象(Raynaud’s phenomenon),脉管炎，自身免疫甲状腺问题，淋巴瘤；以下疾病中的一种或多种盘状狼疮、狼疮性关节炎、狼疮性肺炎、狼疮性肾炎，或选自下组的与全身性红斑狼疮有关的病状，该组由以下各项组成骨关节结核、 抗磷脂抗体综合征、心脏各个部分的炎症(例如心包炎、心肌炎以及心内膜炎)、肺和胸膜炎症、胸膜炎、胸膜腔积液、慢性弥散性间质性肺病、肺动脉高压、肺栓塞、肺出血，以及肺萎缩综合征、狼疮性头痛、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病变、多发性单神经炎、重症肌无力、脊髓病变、颅神经病变、多神经病变、脉管炎。
2.根据权利要求1所述的蛋白的用途，其中该C10RF32多肽直接或间接地经由一个连接物肽、多肽序列或化学连接物融合至一个异源序列。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中该C10RF32多肽包括C10RF32的细胞外域、或其片段或变体，或包括 H19011_1_P8 (SEQ ID 号4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 号5)、 H19011丄P9 (SEQ ID号6)或H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号34)的细胞外域的多肽、或其片段或变体或同源物。
4.如权利要求3所述的用途，其中该C10RF32多肽选自下组，该组由包含与以下氨基酸残基具有至少95%序列一致性的氨基酸残基序列的多肽组成与在SEQ ID号14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQID号4)的氨基酸残基21-186，或与在SEQ ID号35 中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1(SEQ ID号5)的残基21-186，或与在SEQ ID 号15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号:6)的残基21-169，或与在SEQ ID号:36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID号:34)的残基21-169， 或与在SEQ ID号37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8 (SEQ ID号4)的残基1-184，或与在SEQ ID号19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011丄P8_V1 (SEQ ID 号5)的残基1-184，或与在SEQ ID号28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9 (SEQ ID号:6)的残基1-169，或与在SEQ ID号:30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 号:34)的残基 1-169。
5.如权利要求2所述的用途，其中该异源序列包括一个免疫球蛋白恒定域的至少一部分。
6.如权利要求5所述的用途，其中该融合蛋白包括对应于选自下组的抗体同种型的一个免疫球蛋白重链恒定区，该组由以下各项组成IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA以及 IgD0
7.如权利要求6所述的用途，其中该免疫球蛋白恒定域包括选自下组的一个人IgG免疫球蛋白的铰链、CH2以及CH3区，该组由以下各项组成Cy1、Cy2、Cy3以及Cy4链。
8.如权利要求1至7中任一项所述的用途，其中该融合蛋白进一步包括介导该融合蛋白的二聚化或多聚化以便形成同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体的一个域。
9.如权利要求8所述的用途，其中该介导二聚化或多聚化的域选自下组，该组由以下各项组成能够与伴侣融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的一个或多个半胱氨酸、 一个卷曲螺旋域、一个酸补片、一个锌指域、一个钙手性域、一个CHI区、一个CL区、一个亮氨酸拉链域、一个SH2 (src同源性2)域、一个SH3 (src同源性3)域、一个PTB (磷酸酪氨酸结合)域、一个Wff域、一个PDZ域、一个14-3-3域、一个WD40域、一个域、一个Lim域、 一个异亮氨酸拉链域，以及一个受体二聚体对的二聚化域。
10.如权利要求2至9中任一项所述的用途，其中该融合蛋白包括SEQID号8、22、23、 38、29中任何一种的多肽。
11.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中该融合蛋白是包括如权利要求2至10 中任一项所述的第一和第二融合蛋白的一个二聚体蛋白，其中这些第一与这些第二融合蛋白通过共价或非共价键彼此结合以便形成一个二聚体。
12.如权利要求2至11中任一项所述的用途，其中这些融合蛋白通过二硫键结合在一起。
13.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中该蛋白以适配成用于治疗免疫相关病症的一种药用组合物，以及一种药学上可接受的稀释剂或载体的形式来给予。
14.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中该蛋白附接至一个可检测或治疗部分。
15.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中向该受试者给予一个有效量的该蛋白或药用组合物抑制或减少选自下组的一种免疫细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，该组由以下各项组成Thl、Thl7、Th22、分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞。
16.如权利要求15所述的用途，其中该蛋白或药用组合物以抑制或减少Thl、Thl7和/ 或Th22细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的一个有效量来给予。
17.如权利要求15或16所述的用途，其中该蛋白或药用组合物以增强Treg和/或Th2 细胞对于Thl或Thl7细胞的抑制或免疫调节作用的一个有效量来给予。
18.如权利要求15至17中任一项所述的用途，其中该蛋白或药用组合物以促进或增强 IL-10产生的一个有效量来给予。
19.如权利要求15至18中任一项所述的用途,其中该蛋白或药用组合物以增加Treg 和/或Th2细胞中任何一种的细胞数或增加其群体的一个有效量来给予。
20.如权利要求15至19中任一项所述的用途，其中该蛋白或药用组合物以抑制Thl和 /或Thl7通路并且增强Treg和/或Th2细胞对于这些Thl和Thl7通路的活性和/或促进或增强IL-10分泌的一个有效量来给予。
21.如权利要求15至20中任一项所述的用途，其中该蛋白或药用组合物以减少一个受试者中的促炎症分子产生的一个有效量来给予。
22.如以上权利要求中任一项所述的用途，进一步包括给予有效治疗免疫相关病症的一种第二治疗剂。
23.如以上权利要求中任一项所述的用途，其中治疗包括预防、治愈、管理、逆转、减弱、 减轻、最小化、抑制、管理或阻止以上描述疾病的有害影响中的一个或多个。
24.如权利要求23所述的用途，其中该治疗包括在没有整体免疫抑制的情况下治疗免疫相关病症。
25.如权利要求23或24所述的用途，其中免疫相关病症的该治疗包括诱导免疫耐受性。
26.如权利要求23至25中任一项所述的用途，其中该治疗包括抑制反应性T淋巴细胞浸润至中枢神经系统中。
27.如权利要求23至26中任一项所述的用途，其中该治疗包括预防对中枢神经系统中的神经细胞的髓磷脂外层的损伤。
28.如权利要求23至27中任一项所述的用途，其中治疗包括降低疾病的严重度、降低疾病发作频率、减少这类发作的持续时间，或降低这类发作的严重度或它们的一个组合。
29.如权利要求23至28中任一项所述的用途，其中该受试者先前对用TNF阻滞剂的治疗无应答。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白C1ORF32以及其变体以及片段以及其融合蛋白，以及其用于免疫疗法和药物开发的方法，包括但不局限于作为免疫调节剂以及用于免疫疗法，包括用于自身免疫病症。
文档编号A61P25/28GK103068399SQ201180038162
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者艾里斯·赫克特, 加利特·罗特曼, 朱里特·莱文, 史蒂芬·D·米勒, 约瑟夫·R·波多伊尔 申请人:卡姆普根有限公司