专利名称：以细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与s100a9的结合的阻碍为指标的慢性炎症抑制剂或癌 ...的制作方法
以细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的阻 碍为指标的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法技术领域
本发明提供以S100A9的新受体即细胞外基质金属蛋白酶诱导因子为指标的慢性 炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法。
背景技术：
作为在过量增殖或银屑病中被向上调节的蛋白质已知有S100A8及S100A9。 S100A8及S100A9属于由超过20的成员构成的EF-手钙结合SlOO蛋白质家族(非专利文献 I Marenholz I et al. , Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111—1122)。任一种蛋 白质都通过中性粒细胞、活化单核细胞及巨噬细胞分泌，作为这些细胞的趋化性分子发挥 功能，与关于炎症性细胞的递增的正反馈回路相关(非专利文献2 :Roth J et al. , Trends Immunol (2003) 24:155-158)。S100A8及S100A9阳性骨髓细胞，是浸润于炎症区域内的最 初的细胞(非专利文献3 :0dink K et al.，Nature (1987) 330:80-82)。在包含慢性类风湿 性关节炎(非专利文献 4:Liao H et al. , Arthritis Rheum(2004) 50:3792-3803)、多发性 硬化症(非专利文献 5 :Bogumil T et al. , Neurosci Lett (1998) 247:195-197)、克罗恩病 (Crohn’s disease)(非专利文献 6 :Lugering N, et al.，Digestion(1995) 56:406-414)及 结缔组织疾病(非专利文献 7 :Kuruto R，et al. , J Biochem(Tokyo) (1990) 108:650-653) 的大量的人炎症性疾病中观察到高的S100A8及S100A9血清水平。因此，认为S100A8及 S100A9在炎症的诱导及传播中承担重要的作用。
对于上皮细胞中S100A8和100A9所发挥的生物学的功能，本发明者在以前弄清楚 了 通过外源性S100A8和S100A9形成复合体(S100A8/A9)(又名钙卫蛋白)来刺激正常 表皮角质形成细胞(NHEK)并产生在银屑病性病变等中表达增强的炎症性细胞因子，进而 S100A8/A9诱导性细胞因子刺激NHEK中的S100A8及S100A9的产生及分泌(非专利文献 8 J Cell Biochem. 2007Nov28, Epub ahead of print)。进而，还发现 S100A8/A9 本身增强 NHEK的增殖。这些结果说明，S100A8/A9作为主要介质参与的NHEK的增殖和炎症的正反 馈机制的存在。即，启示了 形成了 S100A8/A9诱导炎症性细胞因子的产生而引起炎症性疾 病，该炎症诱导细胞增殖，细胞增殖进一步诱导炎症这样的循环，从而成为增殖-炎症连锁 的持续性皮肤炎症性疾病、例如特应性皮炎、银屑病等的原因。
为了阻止由S100A8/A9引起的慢性炎症的负循环形成，认为鉴定S100A8及A9的 受体是必要的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献I =Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
非专利文献2 =Trends Immunol (2003) 24:155-158
非专利文献3 =Nature (1987) 330:80-82
非专利文献4 :Arthritis Rheum(2004) 50:3792-3803
非专利文献 5 =Neurosci Lett (1998) 247:195-197
非专利文献6 =Digestion (1995) 56:406-414
非专利文献7 J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
非专利文献8 :J Cell Biochem. (2008) 104:453-464
非专利文献9 :Nature Cell Biol. (2006)8(12) :1369-1375
非专利文献10 Hum Genet (2002) 111: 310—313
非专利文献11 :Mor;rison TB et al.，Biotechniques (1998) 24:954-958，960，962 发明内容
发明要解决的课题
本发明提供以S100A9的新受体为指标的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法。
用于解决课题的方法
技术领域：
本发明者们确认了，作为S100蛋白质家族的受体而已知的RAGE (晚期糖基化终末 产物受体，Receptor for advanced glycation endoproducts)也与 S100A9 结合。但是， 未能通过中和抗体、siRNA试验的任一者确认由两者的结合产生的信号系统的存在。
因此，本发明者们尝试了从培养角质形成细胞中分离与S100A8和/或A9结合的 蛋白质并进行LC/MS/MS分析，从而鉴定S100A8/A9结合蛋白质，结果发现了大量S100A9的 受体候选。其中，着眼于作为免疫球蛋白超家族的成员、且作为跨膜型的糖蛋白质的细胞 外基质金属蛋白酶诱导因子(Emmprin) (The extracellular matrix metalloproteinase inducer)(又名vacidin或⑶147),发现由于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达的抑 制，而由S100A9产生的细胞因子诱导、基质金属蛋白酶诱导显著降低。另外，免疫染色的结 果显示，S100A9及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在患有特应性皮炎、银屑病的患者的表 皮以及浸润的黑色素瘤细胞中强烈表达。
因此发现，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子为S100A9的受体，并且通过阻碍它们 之间的结合可以抑制慢性炎症，进而抑制癌的转移，从而完成了本发明。
因此，本申请包含以下的发明
(I) 一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法，其中，在慢性炎症抑制 剂或癌转移抑制剂的候选物质显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或 S100A8/A9的结合的情况下，评价该候选物质显著地抑制慢性炎症或癌转移。
(2)根据⑴所述的方法，其包括以下步骤在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的 候选物质的存在下，将细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9进行温育， 选择阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的物质作为慢性 炎症抑制剂或癌转移抑制剂。
(3)根据⑴或⑵所述的方法，其中，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子被固相化 于固体支持体。
(4)根据⑴ (3)的任一项所述的方法，其中，所述结合的阻碍通过ELISA法来确定。
(5) 一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其含有阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂。
(6)根据(6)所述的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其中，所述药剂含有一种或 二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。
(7) 一种慢性炎症或癌转移的抑制方法，其包括以下步骤将阻碍细胞外基质金 属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的药剂施与受试者。
(8)根据(9)所述的方法，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归 及野芝麻中的植物体或其提取物。
发明效果
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，诱导基质金属蛋白酶(MMP)从而诱导癌的 转移。这样，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与恶性肿瘤的关系为人们所熟知。另 外，对于S100A8/A9，也已知转移的多发部位与由癌细胞所产生的VEGF、TNF等因子 等反应，分泌S100A8/A9，这诱导癌细胞的转移(非专利文献9 :Nature Cell Biol. (2006)8(12) :1369-1375)。本发明者们用S100A8/A9刺激培养角质形成细胞，结果确认了 虽然参与癌的浸润的MMP由于该刺激而表达增强，但是在敲除了细胞外基质金属蛋白酶诱 导因子的情况下，其表达显著地被抑制(结果未显示)。一直以来，认为MMP的表达增强是 通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的自身分泌回路，但上述的结果显示，MMP的表达仅通 过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子并不被增强，必须经过S100A9刺激。
参与癌细胞的转移的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子作为S100A9的受体发挥功 能，是由本发明者们首次发现的。实际上通过抑制细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达， 从而由S100A9产生的细胞因子和/或MMP的表达增强低下(实施例)。因此，认为如果考虑 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的关系，则对于癌的转移和其恶性度可能给出 新的解释。进而，因为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9同样地在特应性皮炎、银 屑病的患者的表皮上层和/或黑色素瘤细胞的表皮中表达，所以预想两者与特应性皮炎、 银屑病、癌等的慢性炎症都相关。因此，根据本发明，可以通过以细胞外基质金属蛋白酶诱 导因子与S100A9的结合的阻碍为指标，来探索慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。
图1 :细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的一级结构。
图2 :通过使用了多维毛细管LC/MS/MS的蛋白质的综合分析法鉴定的S100A9的 受体候选蛋白质。
图3 :通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA的细胞外基质金属蛋白酶诱导 因子的表达抑制效果。
图4 :随着细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制的细胞因子的表达变化。
图5 :随着细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制的MMP的表达变化。
图6 :通过蛋白质印迹法进行的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合蛋白质的鉴 定。箭头显示S100A9的带。
图7 :通过可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子产生的MMPl的诱导效果。
图8A :显示人正常皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子及SlOO蛋白质的定 位的免疫染色图。
图8B :显示皮肤模型中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子及SlOO蛋白质的定位 的免疫染色图。
图8C :显示特应性皮肤疾病皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子及SlOO蛋 白质的定位的免疫染色图。
图8D :使用S100A8抗体、27E10、Dapi进行免疫染色后的特应性皮炎及银屑病的皮 肤的比较。
图8E :使用S100A9抗体、27E10、Dapi进行免疫染色后的特应性皮炎及银屑病的皮 肤的比较。
图8F :显示黑色素瘤组织中的S100A9的定位的免疫染色图(上段为HE染色，中 段为通过S100A9抗体的染色，下段为DAPI染色。左侧、中央、右侧的照片分别来自于不同 的样品)。
图8G :显示恶性黑色素瘤中的S100A9的定位的免疫染色图。
图8H:显示黑色素瘤组织中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的定位的免疫染 色图。
图9 :通过PLA(邻位连接分析,Proximity Ligation Assay)法进行的特应性皮肤 中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的相互作用的证明(200倍)。
图10 :通过PLA法进行的特应性皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与 S100A9的相互作用的证明(400倍)。
图11 :阻碍S100A9与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的结合的植物提取物的筛选结果。
图12 :艾草提取物、野芝麻提取物、当归提取物的S100A9-细胞外基质金属蛋白酶 诱导因子结合阻碍效果的比较。
具体实施方式
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是具有2个Ig结构域的I次跨膜型的糖蛋白质， 具有胶原酶(MMP-1)的表达增强作用。在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子缺失小鼠中，发 现精子形成、受精、感觉功能及记忆功能、以及混合淋巴细胞反应的缺损。图1显示细胞外 基质金属蛋白酶诱导因子的一级结构，另外序列号I显示细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 的全长序列。被MMP-1切割的Ig结构域I诱导胶原的表达。
对本发明的筛选方法没有特别限定，包括以下步骤在候选物质的存在下将细胞 外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9进行温育，选择显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶 诱导因子与S100A9的结合的候选药剂作为由S100A9引起的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制 剂。作为其评价标准，例如，如果与使对照作用的情况相比，细胞外基质金属蛋白酶诱导因 子与S100A9蛋白质的结合10%以上、或20%以上、或30%以上、或50%以上、或70%以上、 或100%被阻碍，则判断为“显著地抑制”慢性炎症或癌转移。
S100A9如上所述有时与S100A8形成复合体，该复合体也有时与细胞外基质金属 蛋白酶诱导因子结合。因此，可以筛选阻碍S100A8/A9与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 的结合的物质作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。
对检测细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的阻碍的方法并没有特别限定，可以基于ELISA法来制作细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9(或S100A8/ A9)的结合中的标准曲线，从而将阻碍该结合的分子、即吸光度降低的分子作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选药剂检测出来。从确保良好的检测灵敏度的观点出发，吸附于固体支持体的分子优选为分子量大的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。
本说明书中使用的“慢性炎症”，除了特应性皮炎、银屑病以外，还包含癌等。另外， 本说明书中使用“癌转移抑制”，是指抑制癌细胞由作为原发病灶的组织经由浸润、通过血中及淋巴管的迁移、向新的组织的附着从而开始增殖的过程中的任一或全部步骤，与癌细胞的增殖抑制不同。
S100A8 及 A9
S100A8及A9的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的DNA序列在例如Hum Genet (2002) 111:310-313(非专利文献10)中公开。能够在本发明中使用的S100A8及A9 通常是来自人的天然型、或者重组蛋白质，但只要有活性，就可以使用改变型、来自异种的、 或者非纯化品。S100A8及A9的重组蛋白质可以按照本领域公知的方法来大量制备，所述本领域公知的方法例如,将分离的或通过PCR合成的S100A8或A9基因(cDNA)插入例如质粒、病毒等来制备表达载体，将其导入宿主细胞例如微生物、动物细胞或植物细胞等培养细胞中，使其表达。
将S100A9溶解于水或培养基、例如适合表皮角质形成细胞的培养的培养基、例如上述EpiLife (注册商标)培养基中，添加于本发明的筛选体系中。添加量不能一概规定， 为lng/ml lmg/ml左右，优选为10ng/ml 100 μ g/ml左右，更优选为100ng/ml 10y g/ ml左右的浓度。S100A9或S100A8/A9的添加优选在氯化钙的存在下进行。对在S100A9或 S100A8/A9的存在下的温育时间、温育温度等培养条件没有特别限制，优选为30 37°C、 I 14小时，更优选为34 37°C、2 7小时，优选在C025%的存在下进行温育。
本发明的慢性炎症抑制剂可以作为对起因于S100A8/A9的持续性皮肤炎症性疾病例如特应性皮炎、银屑病等的预防、治疗这样的改善等有效的药品或化妆品利用。
作为通过本发明的筛选方法得到的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，可举出选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。特别是艾草提取物被确认了显著地阻碍 S100A9与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的结合(图12)，因此被预想为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的优选活性成分。这里，本发明中使用的各植物的植物体或其提取物，是将各个植物体的各种部位(花、花穗、果皮、果实、莖、叶、枝、枝叶、干、树皮、根莖、根皮、根、种子或全草等)直接或干燥后进行粉碎而作为干燥粉末得到的物质，或者直接或干燥和/或粉碎后用溶剂提取而得的物质。
在提取物的情况下，提取所使用的提取溶剂只要是通常提取所使用的溶剂即可， 特别地可单独或者组合使用甲醇、乙醇或者1，3- 丁二醇等醇类、含水醇类、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，其中特别优选醇类、含水醇类，特别优选甲醇、乙醇、1，3-丁二醇、含水乙醇或含水1，3-丁二醇。另外上述溶剂优选在室温至溶剂的沸点以下的温度使用。
对提取方法没有特别限制，通常只要是在由常温至常压下的溶剂的沸点的范围即可，提取后过滤或使用离子交换树脂进行吸附、脱色、纯化制 成溶液状、糊状、凝胶状、粉末状即可。进而在大多数情况下，可在原有的状态下利用，如果必要，在对其效果没有影响的范围内可进一步施加脱味、脱色等纯化处理，作为脱味和/或脱色等纯化处理方法，可使用活性碳柱等，根据提取物质不同任意选择一般采用的通常方法来进行即可。
作为植物体的提取部位，在艾草的情况下考虑叶，在当归的情况下考虑根，在野芝麻的情况下考虑茎、叶、花，但提取部位并不限定于这些部位。
可以将上述用溶剂进行提取得到的提取物直接使用，或者使用例如通过冷冻干燥等浓缩而得的提取物，另外根据需要还可以使用利用吸附法、例如使用离子交换树脂除去杂质后的物质，和/或以多孔聚合物(例如安珀莱特(Amberlite)XAD-2)柱吸附后用所需的溶剂溶出并进一步浓缩而得的物质。
本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂优选包含上述植物体或其提取物的一种或二种以上，在不损害本发明的效果的范围内，可含有其他的各种成分。另外，本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂可根据其使用目的适当确定用量、用法、剂型。例如，本发明的慢性炎症抑制剂的施与方式可以是经口、非经口、外用等。作为剂型，例如可举出片剂、 粉剂、胶囊剂、颗粒剂、浸膏剂、糖浆剂等经口施与剂、或注射剂、点滴剂或栓剂等非经口施与剂软膏、乳膏、乳液、洗剂、面膜、沐浴用剂等外用剂。
本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的上述提取物成分的配合量可根据用途适当确定，通常在阻碍剂总量中，作为干燥物为O. 0001 20. O质量％，优选为O. 0001 10. O质量％。认为艾草提取物、野芝麻提取物、当归提取物浓度依赖性地抑制慢性炎症或癌转移。
另外，在慢性炎症抑制剂中或癌转移抑制剂中，除了上述药剂以外，可根据需要适当配合例如通常的食品或药品中使用的赋形剂、防潮剂、防腐剂、强化剂、增稠剂、乳化剂、 抗氧化剂、甜味料、酸味料、调味料、着色料、香料等，化妆品等中通常使用的美白剂 、保湿剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。
进而，将本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂作为皮肤外用剂使用的情况下，也可适当配合皮肤外用剂中惯用的助剂，例如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、 柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等金属封闭剂、咖啡因、单宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡萄糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类、视黄酸、维生素A、乙酸维生素A、棕榈酸维生素A等维生素A类等。
以下，举出具体例，更具体地说明本发明。另外，本发明不限定于此。实施例
1.新S100A9受体候选的筛选
将由培养角质形成细胞回收的蛋白质混合物与GST融合S100A9或S100A8/A9蛋白质混合后，对于该样品进行通过毛细管LC/MS/MS的蛋白质的综合分析法。
LC/MS/MS 分析
为了保持填充剂，在内径100 μ m、长度120mm的未填充的毛细管柱(New Objetive 社制)的圆锥状的出口侧的端部制作二氧化硅制的烧结。在得到的毛细管柱中，填充平均粒径为5 μ m的十八烧基化二氧化娃型填充剂Aqua C18 (Phenomenex社制)使其高度为 100mm，得到分析用逆相毛细管柱。
为了保持填充剂，在内径250μπι、长度150mm的未填充的毛细管柱(Agilent社制)的出口侧的端部制作二氧化硅制的烧结。在得到的毛细管柱的出口侧填充将平均粒径为5 μ m的阳离子交换树脂型填充剂PartisphereSCX resins (Whatman社制)和平均粒径为5 μ m的阴离子交换树脂型填充剂PolyWAX LP (PolyLC社制)以质量比2:1混合而得的物质使其高度为25mm，在入口侧填充平均粒径为5 μ m的十八烷基化二氧化硅型填充剂Aqua C18 (Phenomenex社制)使其高度为25mm，得到包含阱用逆相毛细管柱及SCX-WAX混合毛细管柱的二相型毛细管柱。
另外，制作分析用逆相毛细管柱及二相型毛细管柱时，使用高压氮气及加压型填充容器，通过匀浆填充法来填充填充剂。
接着，通过6步的MudPIT型分析(二维HPLC/ESI MS/MS)，来分析上述蛋白质混合物。
首先，将含有约4μ g肽的上清通过加压法上样到二相型毛细管柱后，使用试样溶液的10倍以上的体积的移动相A(水、乙腈及甲酸的体积比95:5:0.1的混合液；pH值 2. 6),进行洗漆、脱盐。将该二相型毛细管柱10,通过贯通孔型接头(Upchurch Scientific 社制)(不图示)与分析用逆相毛细管柱20连接。接着，连接于使用内径为100 μ m的毛细管作为配管的Nanospace SI_2型HPLC装置(资生堂社制)上。此时，阱用逆相毛细管柱 11配置于SCX-WAX混合毛细管柱12及分析用逆相毛细管柱20的上游侧。
作为移动相，使用移动相A、移动相B (水、乙腈及甲酸的体积比20:80:0.1的混合液)、移动相C (含有500mm的乙酸铵的移动相A ；pH值 6. 8)，肽的溶出法，是使以矩形加入的移动相C的体积％每步骤递增的共计6步的梯度溶出法。
步骤I的梯度曲线是，流入移动相A5分钟，接着的5分钟使移动相B的比率由O 体积％增加至15体积％，接着的60分钟使移动相B的比率增加至45体积％，接着的10分钟使移动相B的比率增加至75体积％，然后以该比率流入5分钟。
步骤2 6的梯度曲线是，流入移动相Al分钟，接着将4分钟使移动相C的比率为X[体积％ ]流入，接着的5分钟使移动相C的比率由O体积％增加至15体积％，接着的 60分钟使移动相C的比率增加至45体积％，接着的10分钟使移动相C的比率增加至75体积％，然后以该比率流入5分钟。此时，泵的送液的流速为250μ L/分钟，通过利用抵抗型毛细管的分流，将柱的流速调整为300 400nL/分钟。
另外，测定ESI MS/MS时，使用离子阱型质量分析计LCQ-Deca(THERMO FiSHER SCiENTiFiC社制)。此时，由分析用逆相毛细管柱溶出的肽不分流，直接导入质量分析计。
另外，将质荷比(m/z)为400 1400的全扫描MS谱测定I次、数据依赖型MS/MS 谱测定3次，通过各步骤重复进行。此时，标准化裂解能为35%。另外，微扫描在MS谱测定及MS/MS测定都为3。进而，变动排除设定为，重复计算1、重复时间O. 50分钟、排除列表大小25、排除时间10. 00分钟。
得到的MS/MS 谱通过在 Bioworks 软件(Thermo Fisher Scientific 社制)上运行的SEQUEST计算程序，相对于非冗长人数据库(ftp:1l ftp.ncb1.nih.gov/blast/db/ fasta/nr. gz, 2007/2/8 版)进行检索。
其结果是鉴定了如图2所列的受体候选蛋白质。从这些蛋白质中，将Vacidin(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子)作为S100A9的新受体进行以下 的实验。
2.通过siRNA的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制
为了抑制细胞 外基质金属蛋白酶诱导因子的表达，使用RNAiMax，使细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA (Santa Cruz: sc-35298)以终浓度成为40nM或80nM转染增殖期的培养角质形成细胞(图3中的“BSG”)。作为对照，使用什么也不添加的物质(图3中的 “NT”(无处理对照，non-treated control))及与人基因的任一部分不具有同源性的对照 siRNA-A (Santa Cruz Biotechnology, Inc. , sc-3707)(图 3 中的“LF”)。另外，转染在将培养培养基交换成不含有增殖因子的基础培养基之后进行。由转染开始24小时后用S100A9 刺激增殖角质形成细胞，再过24小时后提取RNA。其结果如图3所示，在转染了细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA的情况下，在24、48、72小时后，与使用上述对照的情况下的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达量相比，表达被抑制到I 3%。
3.由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制引起的细胞因子及MMP的表达变化
已经清楚IL-8 (CXCL-8)、TNF a、IL1-F9、CXCL-1 通过 S100A8/A9 的添加而在角质形成细胞中的表达被增强(上述J Cell Biochem. (2008) 104:453-464)(非专利文献8)。 对于是否通过S100A9的添加IL-8 (CXCL-8)、TNF a、IL1-F9及CXCL-1的表达也被增强，以及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制对这些细胞因子的表达有怎样的影响，通过实时定量PCR来研究。通过同样的方法，对于S100A9刺激对MMP-1及ΜΜΡ-10的表达的影响也进行研究。
实时定量PCR
将在EpiLife (商标)_KG2 (Cascade Biologies社)中培养的增殖期的NHEK，置换成含有或不含有2mM的氯化钙、S100A8或S100A9(各10μ g/ml)的相同培养基，曝露3小时， 使用 MagNA (商标)Pure mRNA 提取试剂盒及 MagNA Pure (商标)仪器(Roche Diagnostics 社，日本，东京都)提取mRNA。得到的mRNA使用SuperScript (商标)II (Invitrogen Corporation社,美国，加利福尼亚州，卡尔斯巴德)使其逆转录。实时定量PCR,按照制造商的操作说明书使用 LightCycler FastStart DNA master SYBR green I 试剂盒(Roche Diagnostics社)在LightCycler高速热循环仪系统上实施。典型的反应条件是，10分钟的活化步骤、接着由95°C变性15秒、60°C退火10秒、72°C延伸10秒组成的循环40次。使用的引物示于下述的表I。各引物的最终浓度在20 μ I的总反应体积中为0. 2 0. 25 μ m。 将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为对照基因使用。通过融解曲线分析来确认扩增的片段的特异性。各基因的表达水平使用LightCycler分析用软件进行定量分析(非专利文献 11 :Morrison TB et al.，Biotechniques (1998) 24:954-958，960，962)。目的的mRNA 量，作为相对于A8/对照siRNA-A (santa Cruz: sc-37007) (A8/LF)的mRNA的量的比率来表/Jn ο
权利要求
1.一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法，其中，在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的情况下，评价该候选物质显著地抑制慢性炎症或癌转移。
2.根据权利要求1所述的方法，其是筛选慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的方法，该方法包括以下步骤在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质的存在下，将细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9进行温育，选择阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的物质作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子被固相化于固体支持体。
4.根据权利要求1 3的任一项所述的方法，其中，所述结合的阻碍通过ELISA法来确定。
5.一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其含有阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂。
6.根据权利要求5所述的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。
7.—种慢性炎症或癌转移的抑制方法，其包括以下步骤将阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂，施与需要治疗慢性炎症或癌转移的受试者。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。
9.阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂用于抑制慢性炎症或癌转移的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻的植物体或其提取物。
全文摘要
本发明提供慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法，其中，在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的情况下，评价该候选物质显著地抑制慢性炎症或癌转移。
文档编号A61P35/00GK103052882SQ201180038059
公开日2013年4月17日 申请日期2011年1月28日 优先权日2010年8月2日
发明者日比野利彦, 江浜律子, 本山晃, 山田章子, 山本真实, 阪口政清, 许南浩 申请人:株式会社资生堂