骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品的制作方法

骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品的制作方法
【专利摘要】本发明公开了骨骼肌全器官脱细胞基质及其衍生出的医疗产品，以及它们的制备和使用方法。骨骼肌全器官脱细胞基质完整的保留了骨骼肌三维的、平行排列的骨骼肌基底膜超微结构，保留了血管基质网络和肌肉-肌腱接头，保留了大量生长因子、透明质酸、氨基葡聚糖、层连蛋白等生物活性成分，高度亲和肌源性干细胞，具有一定的机械强度和韧性，脱细胞彻底、无明显免疫排斥，无伦理道德问题，是迄今为止报道最多优点的骨骼肌再生支架和平台。所制备的骨骼肌全器官脱细胞基质，以及其各种衍生出的医疗产品，可用作体外体内构建和再生骨骼肌，适用于修复各个部位、各种范围的骨骼肌缺损，有望解决目前临床上仍十分棘手的、大范围骨骼肌缺损修复和肌肉再生难题。
【专利说明】骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品
【技术领域】
[0001]本发明描述了骨骼肌全器官脱细胞基质((Whole organ acellularmatrix, WOACM))及其衍生出的医疗产品如微粒、流体化组合物、凝胶和活性肽等的制备方法及其用途。涉及领域包括组织工程与再生医学、外科学、生物材料学。
【背景技术】
[0002]骨骼肌缺损的治疗，特别是大范围肌肉缺损的功能重建，到目前为止仍是临床难题。骨骼肌占人体重量的40-50%。骨骼肌系统创伤也是人体最常见的创伤之一，据统计30-55%的运动损伤、50-70%的战伤均涉及到骨骼肌。轻微骨骼肌损伤，如各种挫伤或拉伤，骨骼肌组织能依靠成肌细胞(卫星细胞)再生肌纤维实现自我修复。然而，缺损量超过20%的骨骼肌创伤难以实现功能性修复而伴有疤痕形成、远心端肌肉失神经支配萎缩、功能障碍。针对这些患者，目前临床的标准治疗是自体取材修复，包括各种肌皮瓣移植，虽能部分恢复损伤区功能，但存在可利用的肌肉来源有限、组织解剖结构和生物力学改变、供区损伤等不足；以“创伤修复创伤”也不符合外科微创化的发展方向。总之，骨骼肌缺损的治疗，特别是大范围肌肉缺损的功能重建，到目前为止仍是临床难题。通过诱导组织再生实现大范围骨骼肌缺损的功能重建符合医学需要，该项技术具有广阔的前景。
[0003]细胞外基质具有迄今最好的体内骨骼肌诱导再生效果，但仍有改进需要。骨骼肌是单一功能器官，理论上来说较肝脏、肺等脏器更容易通过组织工程和再生医学技术实现其功能性再生。事实上，目前组织工程骨骼肌的进展已落后于肝脏和肺等领域，原因是骨骼肌具有复杂的超微结构，包括平行排列的、周期性的三维骨骼肌基底膜管结构，肌肉-肌腱接头等，这些结构都非常难于人工模仿。此外骨骼肌具备功能的前提是受神经支配以及足够的血管网络提供营养和氧分(肌细胞是物质代谢非常旺盛、高耗氧细胞)，而目前各种体外构建环境，包括生物反应器在内，均难以提供骨骼肌细胞生长发育所需的氧分和营养支持。此外有研究发现，酶消化获得的骨骼肌成肌细胞(Myoblast)在分离和扩增过程中会丧失再生骨骼肌纤维的能力。直接将肌源性干细胞接种到受损部位至今未有接种的干细胞存活率达到1%的报道。上述困难驱使人们研究可否在体内诱导骨骼肌组织再生，如仅提供生物化学信号调节局部微环境加速骨骼肌再生、减少疤痕形成。这方面国外学者已取得令人瞩目的突破，即应用脱细胞基质(Acellular matrix, ACM)支架材料，如猪小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa, SIS)基质、膀胱基质(Urinarybladder matrix，UBM)，在体内实现骨骼肌功能性再生。这些ACM的成分为细胞外基质(Extracellular matrix, ECM),主要由I型和III型胶原纤维组成,含少量V型和VI型胶原纤维，有一定孔隙率，其余部分主要为糖蛋白、纤维粘蛋白、氨基葡聚糖(硫酸软骨素、透明质酸、肝素等)，易于细胞粘附并能促进粘附的细胞生长增殖；含有多种细胞因子，包括成纤维细胞生成因子(FGF)-2、转化生长因子(TGF)-β和血管内皮生长因子(VEGF)等；还有良好的可降解性和降解速率可控性，无抗原作用。ECM修复骨骼肌缺损的机理是“内源性组织再生”:植入后ECM能够实现快速再血管化，其中的生物活性信号蛋白和生长因子吸引干细胞迁移进入支架材料，并诱导干细胞分化形成位置特异性主质细胞如骨骼肌成肌细胞、血管前体细胞；随着持续的ECM材料的降解和持续的宿主细胞新生基质沉积，功能性骨骼肌组织开始形成，恢复成它的起源结构、功能性和生理性状态。实验动物骨骼肌缺损区使用ECM填充修复，虽然未接种干细胞，但也能够再生出功能性骨骼肌。Valentin等使用SIS修复大鼠腹壁缺损，6个月后在修复区看到岛屿状功能性骨骼肌组织，其产生的收缩力可达到正常腹肌的80 %。同样，Turner等在犬8 X 4cm大小部分肌肉缺失模型中，6个月后同样观察到SIS修复区有血供良好、受神经支配、有收缩功能的骨骼肌新生，几乎与修复区周围正常肌肉组织难以区分。当然，预接种干细胞会进一步加快组织再生速度；ConConi等发现大鼠腹肌ECM体外接种成肌细胞后重新植入修复大鼠腹壁缺损，仅9天即可形成具有复杂结构、可收缩、血管化的骨骼肌组织。上述研究结果国外已转化为临床应用，即植入ECM材料促进遭受中等范围骨骼肌损失的患者实现肌肉功能重建，改善肢体残疾。已有的报道均来自于美国军方。第I例临床应用是采用UBM为一名自阿富汗战场返回的右下肢腓肠肌部分被炸飞的士兵实现了肌肉再生，受伤部位的骨骼肌肌力恢复到对侧的70%。我国的报纸《参考消息》也转载了这一成果(第19120期，2011年6月21日)。第2例是一名右大腿根部部分骨骼肌缺失的士兵，他接受多层SIS植入治疗时距他受伤已有3年。在这3年中，他的受伤区是疤痕修复，虽经多年康复治疗，他仍一直有明显的右膝伸直困难。接受SIS植入后4月，他的这一症状明显改善，受伤区肌力提高了 30%。不过值得注意的是，这一方法目前仍存在一些局限性，包括①操作繁琐，上述研究中所用的ECM材料是UBM和SIS，虽然来源方便，但因为UBM和SIS的平均厚度不到100 μ m，要达到缺损骨骼肌的体积需要层叠数百层的材料；②再生骨骼肌并不是真正意义上具有全部收缩功能的骨骼肌:骨骼肌物质代谢非常旺盛，骨骼肌剧烈运动时其内的血流量能达到平静状态时的20-80倍，故正常人体骨骼肌均有较粗直径的支配血管且每平方毫米肌肉中有1350-3000条毛细血管；而UBM和SIS植入区再生骨骼肌的血供均由周围组织侵入的毛细血管提供，无明显支配血管、毛细血管密度也不足，无法提供剧 烈收缩时需要的血流量；③UBM和SIS未能反映出天然骨骼肌基质的复杂结构，再生骨骼肌的肌纤维排列不理想。总之ECM诱导骨骼肌功能性再生是一项非常有前景的技术，但目前仍有值得深入研究改进措施的地方。

【发明内容】

[0004]本发明的特征在于获得了骨骼肌全器官脱细胞基质(W0ACM)，具有高组织相容性，保留了骨骼肌三维超微结构和血管基质网络以及肌肉-肌腱接头结构等，保留有骨骼肌特异性细胞外基质成分，较迄今已有的各种支架材料更好的模拟了天然骨骼肌细胞外基质的物理和生物特性。
[0005]在举例的一个具体实施方案中，本发明详细的叙述了骨骼肌WOACM这种生物活性骨骼肌再生支架材料的制备方法，包括取材对象的选择、原料骨骼肌组织的获取和准备、前置处理、脱细胞、消毒保存、体外评估等。
[0006]本发明制备的骨骼肌WOACM起始原料是异体异种骨骼肌，如人体，猪，狗等的骨骼肌，优选的骨骼肌是血供明显的骨骼肌，最优的是带独立支配血管的骨骼肌。取材范围优选的包括骨骼肌支配血管的上级血管，最优的是来自于供体躯体的主干血管，以期相应血管脱细胞后能方便用于外科缝合。供体的年龄以年轻为佳，因为年轻供体骨骼肌的细胞外基质中各种促干细胞粘附成分、生长因子等较丰富，所含脂肪组织较少。取材时间应于供体死亡后30分钟内，优选方案是在取材部位骨骼肌仍具备有效血液循环时取材。
[0007]本发明涉及的原材料准备指骨骼肌在获取时应有较好的保存液灌注，其标准是确保骨骼肌内动静脉系统均得到充分灌注、血液成分被排出而不会在骨骼肌小血管中凝结致微循环阻塞，此外灌注未导致骨骼肌内血管网络破坏；优选的方案是供体有预先全身肝素化，最佳的是供体预先全身肝素化联合局部保存液充分灌注，充分灌注的标准是经支配动脉灌入保存液，支配动脉伴行的静脉中无粘稠血性液流出。经充分灌注后，原材料可反复冷冻、复温。[008]本发明涉及的前置处理指明确所插管动脉支配的骨骼肌范围、支配动脉有无解剖学变异，插管支配动脉的伴行静脉，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪组织；
[0009]本发明涉及的脱细胞方法包括将插管血管接入生物反应器，经支配血管按序列分批灌注不同处理液，所述处理液可包括酶处理液和化学药物处理液，所述酶处理液可选自如胰蛋白酶(Trypsin)、核酸外切酶或核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)、α -半乳糖苷酶等的一种或几种,所述化学药物处理液可选自离子型、非离子型和两性表面活性剂、螯合剂、高低渗溶液的一种或几种，例如乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、乙二酉享双四乙酸(Ethylene glycoltetraacetic acid, EGTA)、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X)、脱氧胆酸(Deoxycholic acid)等,上述酶处理液和化学药物处理液可选择匹配组成多种方案用于骨骼肌脱细胞，不同方案间可在药物选用、药物使用顺序、药物浓度和药物作用时间上有差异，但目标一致，即以最温和的方式实现彻底脱细胞并同时最大限度保留骨骼肌细胞外基质中的生物活性成分，至少需保留骨骼肌细胞外基质中80%以上的生物活性成分。
[0010]脱细胞方案所用胰蛋白酶的终浓度为0.01~0.25%，EDTA或EGTA的终浓度为
0.02~0.5%, DNase的终浓度为30_50U/ml，α -半乳糖苷酶的终浓度为10_25U/ml，SDS的终浓度为0.01~0.1%、Triton-X的终浓度为0.1~1%、Deoxycholate acid的终浓度为
0.5 ~2%。
[0011]脱细胞方案中，所述分批灌注的处理液可选自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇双四乙酸、脱氧核糖核酸酶/ α -半乳糖苷酶、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚和脱氧胆酸的几种，其中所用胰蛋白酶/EDTA或EGTA的作用时间1_3小时，DNase和α -半乳糖苷酶的作用时间0.4-1小时，SDS的作用时间4-24小时、Triton-X的作用时间8-24小时、Deoxycholate的作用时间4-24小时。
[0012]本发明涉及的消毒技术可选自全灌注系统预灭菌、全程使用灭菌液体灌注、制备后消毒液灌注，或辐射灭菌，具体可包括经支配血管灌注过氧乙酸(Peroxyaceticacid，PAA)/乙醇(ETOH)混合液或Y射线辐射灭菌等。其中PAA的终浓度(V/V)为
0.1-0.5%,乙醇的终浓度(V/V)为2-10%，PAA/乙醇混合液的作用时间2_3小时。制备的骨骼肌WOACM可选择水化保存，或经真空冷冻干燥形成干燥体保存。
[0013]在举例的一个具体实施方案中，本发明详细的叙述了骨骼肌WOACM这种生物活性骨骼肌再生支架材料体外生物活性的检测方法和结果，包括检测骨骼肌WOACM的组织学、超微结构，检测脱细胞的彻底性(包括残留核酸、内毒素含量和生物负载如真菌、病毒含量，残留核酸链的大小，残留脱细胞化合物含量)，检测骨骼肌基底膜特异成分的存在如IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白等，测定促干细胞粘附、增殖和分化成分的含量如透明质酸、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan, GAGs)、硫酸类肝素、各种生长因子如血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growthfactor, bFGF)、转化生长因子-β (transforming growthfactor- β , TGF- β )等。
[0014]在举例的一个具体实施方案中，本发明详细的叙述了骨骼肌WOACM较其他支架材料在促血管和肌源性干细胞趋化、促血管和肌源性干细胞增殖、促肌源性干细胞成肌分化和肌管生成方面的优势。
[0015]本发明所制备的骨骼肌WOACM可衍生出微粒、流体化组合物、凝胶和活性肽等医疗产品。微粒产品为将骨骼肌WOACM真空冷冻干燥后的干燥体经高速旋转粉碎所得，包括多个产品等级(≤38 μ m，38-100 μ m, 100-250 μ m)，可用作骨骼肌创面覆盖、骨骼肌缺损充填材料等。流体化组合物为将骨骼肌WOACM微粒在酸性环境中使用胃蛋白酶消化所得。凝胶产品为均匀流体化组合物再浓缩、中性化处理所得，包括不同浓度等级，可用作骨骼肌创面覆盖、注射用充填骨骼肌缺损、治疗肌营养不良等。制备上述衍生产品的技术均是本领域技术人员所熟知的。
[0016]本发明涉及的骨骼肌WOACM活性肽的制备:将骨骼肌WOACM流体化组合物经超高速离心13000rpm)后，上清液真空冷冻干燥，所得干燥体即为骨骼肌WOACM的活性肽，体外测试证实其促骨骼肌成肌细胞趋化、增殖和分化的能力远较骨骼肌WOACM流体化组合物更高效。
[0017]由本文的描述，本发明的另外的方面以及特征和优点对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】

【附图说明】
图1为猪下腹直肌的支配血管解剖和取材范围示例图；
图2为原始骨骼肌以及由该块肌肉制备的骨骼肌示意图；
图3为骨骼肌WOACM结构完整，保留有血管网络的示例图；
图4为天然骨骼肌和骨骼肌WOACM的横断面、沿长轴面的扫描电镜图；
图5为骨骼肌WOACM的可见保留的毛细血管网络的横断面扫描电镜图；
图6为天然骨骼肌和骨骼肌WOACM横断面的HE染色、基底膜蛋白免疫组化染色(200X)示例图；
图7为天然骨骼肌和骨骼肌WOACM沿长轴面的HE染色、基底膜蛋白免疫组化染色(200X)示例图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。经研究发现，骨骼肌ECM更利于骨骼肌再生，其中骨骼肌WOACM具有最佳的理论优势。近年来越来越多的研究显示，特定组织的ECM均拥有该组织独特的成分和结构，同样骨骼肌ECM也具备骨骼肌特异性的成分和结构①高IV型胶原含量，主要存在于骨骼肌基底膜中，利于成肌细胞粘附、迁移和激活复杂的、具有启动功能的三维超微结构，包括平行排列的肌内膜管结构、残存的神经和血管通路，可促进成肌细胞的调整和融合，并刺激神经血管生长；③富含生长因子、透明质酸、层粘连蛋白、硫酸肝素、硫酸蛋白聚糖等，生物相容性极佳；④降解产物具有强有力的促肌肉干细胞的有丝分裂和趋化作用，且这些降解产物形成的微环境，对维持肌细胞和卫星细胞的活力非常重要。因此，骨骼肌ECM应较其他材料更适合于重建骨骼肌，骨骼肌ECM修复骨骼肌缺损时也应具有更好的诱导再生效果。
[0019]制备骨骼肌ECM—直是组织工程和再生医学领域的难题。通常认为骨骼肌结构致密，组织间有多重结缔组织分隔，脱细胞液体于其中难以弥散，故迄今仅有大鼠四肢小块骨骼肌ECM和猪骨骼肌薄片的ECM制备成功的报道，但这些骨骼肌ECM不能用于修复临床上的大范围骨骼肌缺损。2008年国际顶级医学期刊《Nature Medicine》首先报道了一项革命性技术，灌注法脱细胞制备整器官的细胞外基质用于构建相应的组织工程器官。美国学者Ott HC等应用此法制备出大鼠心脏的全器官脱细胞基质，接种干细胞体外构建8天后成功获得一人工心脏，其泵血功能达到正常成年大鼠心脏的2%，16周胎鼠心脏的25%。受到此项技术启发，人们先后获得了肝、肾、肺等脏器的全器官脱细胞基质，相关文章均发表在《Science》、《!fepatology》等顶级期刊。与此同时，国际知名的组织工程中心也一直在开展骨骼肌WOACM的制备工作，因为从理论上来说，骨骼肌WOACM较目前国内外已报道的各种骨骼肌再生平台，包括无机生物材料如可溶性磷酸盐玻璃纤维支架等、生物可降解合成高分子材料如聚羟基乙酸、聚乳酸以及和各类酯单体共聚物如聚乳酸-乙醇酸等，天然可降解生物材料如壳聚糖、胶原、SIS和UBM等，具有许多无可比拟的优势:
A.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌复杂的、具有启动功能的三维平行排列、周期性的肌内膜(基底膜)管结构，这样的超微结构目前尚不能人工模仿，特别利于肌源性干细胞定向迁移、延伸和融合，也 能引导新生肌管的方向；
B.骨骼肌WOACM保留有生物活性成分(维持肌源性干细胞活性的生物信号):包括骨骼肌基底膜特异成分(IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白)、促干细胞粘附、增殖和分化成分(透明质酸、糖胺聚糖、硫酸类肝素和生长因子如bFGF、TGF-β 1、IGF、VEGF等)；
C.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌完整的血管基质网络，包括终末动脉、静脉和毛细血管系统；用于系统性接种干细胞可确保干细胞均匀分布到整个基质内并且所有接种的细胞在血管周围150-200 μ m内，能良好存活；此外,血管基质网络若能连通至受体的循环系统则可为干细胞持续提供营养；
D.骨骼肌WOACM保留了主要供应血管的基质，有机会再生出新的大直径供应血管来支配新生骨骼肌成为全功能骨骼肌；
E.骨骼肌WOACM保留了肌肉-肌腱接头结构，可直接传导力学；
F.骨骼肌WOACM具有一定的机械强度和韧性；
G.骨骼肌ECM较其他材料更容易实现新生骨骼肌的再神经化。研究显示，轻度骨骼肌损伤机体实现自我修复时，超过95%的神经-肌肉接头还是再生于基底膜和肌内膜上的原位(卫星细胞龛)，而骨骼肌WOACM保留了肌卫星细胞龛的成分和结构。本发明的骨骼肌WOACM的制备方法适用于制备所有生物、各个部位的骨骼肌W0ACM，如人体、猪、狗的腹直肌、背阔肌。以下将以猪腹壁下腹直肌为例进行详细说明。以下实施例中所提到的所有具体参数，仅用于举例说明，本领域技术人员可由下述公开的内容得到多种简单变化的方案，这些简单变换的方案也在本发明的保护范围内。
[0020]原材料(猪腹壁下腹直肌)的获取和准备:选择供体为16-20周龄雌性Yorkshaire猪，体重25-30kg，预先经外周静脉全身肝素化(10000U/只)，采用从剑突直至下腹近肛门的腹正中切口，切开腹白线至腹膜前间隙，向头部方向推开腹膜，暴露腹膜后结构，包括腹主动静脉、髂总血管、髂外血管。切开髂外动脉，置入14-20G套管至腹壁下动脉，灌注泵驱动向腹壁下动脉内注入肝素化(l_5U/ml)的生理盐水，保持动脉内压力在活体正常血压水平(100-120mmHg)。充分灌注直至腹壁下静脉中无浓稠血性液流出。继续沿髂外血管暴露阴部腹壁血管干(该血管干由三条血管组成:腹壁下动脉，上腹尾浅动脉和阴部外动脉)和股动脉(图1左)。沿腹直肌前表面剥离腹直肌前鞘，沿后表面剥离腹横筋膜(弓状线下方)和腹直肌后鞘(弓状线上方)，直至脐水平(第3或第4腱划)，特征是可见腹壁下深动脉穿支(Deep inferior epigastric perforator, DIEP)。沿耻骨弓表面切断腹直肌腱和耻骨接头，切断髂外动静脉、股动静脉、阴部外动静脉和上腹尾浅动静脉，沿脐水平切断腹直肌，完成下腹直肌的获取和准备(图1右)。 [0021]前置处理:获取的猪下腹直肌置于灌注反应器中，髂外动脉插管连通灌注泵，低压(约60mmHg)灌注IX的磷酸盐缓冲液(PBS)。使用染料明确腹壁下动脉支配范围，检查有无供应下腹直肌的异常血管，若有，则需置管入该血管用于灌注(图2左)。进一步清除肌组织表面的脂肪组织，结扎髂外动脉除腹壁下动脉以外的所有分支，包括上腹尾浅动脉、阴部外动脉和股动脉，确保经髂外动脉灌注液完全流入腹壁下动脉。结扎髂外静脉除腹壁下静脉(有2支)以外的所有分支，包括上腹尾浅静脉(2支)、阴部外静脉和股静脉，髂外静脉内置入套管。
[0022]脱细胞处理:将髂外动静脉套管接入生物反应器，灌注时注意标本须同时浸没于与灌注液同样的液体中。附表1和表2示出了常用的2种优化的脱细胞方案，其中方案I操作时间长于方案2，但更容易实现超大体积(如大于50 X 40 X 5cm)的原材料骨骼肌的脱细胞。骨骼肌脱细胞后呈透明状，可清晰显示其内的血管、神经网络(图2右)，染色灌注确认其结构完整、无液体渗漏(图3)。除表1和表2所示脱细胞方案外，本发明还可使用其它任何使用上述描述的试剂及不同处理时间的合适的脱细胞方案。
[0023]消毒和保存:自0.1%PAA/4%ET0H灌注后,所有灌注的液体,包括去离子水,均为已灭菌液体。最终获得骨骼肌WOACM保存于组织保存液中，Y射线辐射灭菌。组织保存液成分为:乳糖醒酸IOOmmol,磷酸氢钾25mmol,硫酸镁5mmol,氢氧化钠(5mmol/L) 5ml,氢氧化钾(5mmol/L) 20ml,鹿糖 60mmol, pH 7.45±0.10,渗透压(310±10) m0sm/L。
[0024]骨骼肌WOACM的超微结构:HE染色和扫描电镜确认骨骼肌WOACM保留了天然骨骼肌细胞外基质三维平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌内膜超微结构，骨骼肌基底膜成分贴附于肌内膜内面(图4)，这样的结构最利于肌源性干细胞的粘附、迁移、增殖、分化和融合。可见清晰的保留的毛细血管网络(终末动脉和伴行的2条终末静脉，图5)。
[0025]脱细胞彻底性测定:组织学染色未见细胞核结构，DAPI染色阴性。提取骨骼肌WOACM中的全部DNA，使用Picogreen法测定骨骼肌WOACM干重中残留DNA的含量低于50ng/mg。残留DNA链的长度200-500bp。
[0026]生物活性测定:经ELISA法测定，骨骼肌WOACM干重中GAGs含量是645土 40ng/mg、VEGF 含量是 186 ±22ng/mg，bFGF 含量是 1375 ±230ng/mg，TGF-β 含量是 293±8ng/mg。骨骼肌基底膜主要成分蛋白免疫组化染色证实骨骼肌WOACM中含有IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白(图6和图7)。
[0027]骨骼肌WOACM较其他ECM和合成高分子材料更趋化血管和肌源性干细胞:所制备的骨骼肌WOACM流体化组合物经中性化后，以不同浓度(1000 μ g/ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml UOO μ g/ml,50 μ g/ml,25 μ g/ml UOy g/ml,5 μ g/ml)比较与 SIS、UBM、PLGA 对骨骼肌成肌细胞、MJK/PJK的趋化作用(Boyden chamber法)，结果发现骨骼肌WOACM具有最佳的促干细胞趋化作用，且在浓度25 μ g/ml时即达到最佳作用。
[0028]骨骼肌WOACM较其他ECM和合成高分子材料更促进血管和肌源性干细胞增殖:使用 BrdU 法检测不同浓度(1000 μ g/ml>500 μ g/ml、250 μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml)的骨骼肌 WOACM、SIS、UBM、PLGA 对骨骼肌成肌细胞、MJK/PJK的促增殖作用，结果发现骨骼肌WOACM具有最佳的促干细胞增殖作用，且在浓度50 μ g/ml时即达到最佳作用。
[0029]骨骼肌WOACM较其他ECM和合成高分子材料更促进血管和肌源性干细胞分化:接种5X IO5骨骼肌成肌细胞至I X Icm骨骼肌WOACM薄片、SIS、UBM、PLGA支架表面，使用全培养液(DMEM+10%胎牛血清)培养7天后改用诱导培养液(DMEM+10%马血清)培养3天，比较骨骼肌成肌细胞的分化和肌生成，检测骨骼肌调节因子的表达(MyoD，Myogenin, MRF4, Myf5),激光共聚焦显微镜检测新生肌管的量、尺寸和有序性。结果发现在骨骼肌WOACM表面成肌细胞最容易形成新生肌管，且新生肌管排列最为有序。
[0030]残留化学物测定:脱细胞方案I制备的骨骼肌WOACM采用亚甲蓝结合残留物中的十二烷基硫酸钠，Picogre en法测定吸光度,测定骨骼肌WOACM干重中残留十二烷基硫酸钠的含量低于100ng/mg，未检测到Triton-X残留；脱细胞方案2制备的骨骼肌WOACM中未检测到Triton-X和脱氧胆酸残留。
[0031]生物负载测定:经常规方法测定，脱细胞方案I和脱细胞方案I制备的骨骼肌WOACM均不携带真菌、病毒在内的生物负载。
[0032]灭菌测定:经常规方法测定，脱细胞方案I和脱细胞方案I制备的骨骼肌WOACM均灭菌彻底，内毒素含量<15Eu/mg干重。
[0033]机械强度和韧性、弹性测定:经常规方法测定，脱细胞方案I和脱细胞方案I制备的骨骼肌W0ACM，保留有其来源骨骼肌30%以上的机械强度，以及90%以上的韧性和弹性。
应用领域
本发明制备的骨骼肌WOACM及其衍生医疗产品的应用领域包括用于组织工程和再生医学领域体外构建、体内再生骨骼肌，可修复各种范围的骨骼肌缺损包括覆盖骨骼肌创面、填充肌缺损、注射治疗肌营养不良、解剖修复大范围缺损，也可用于心肌梗死的治疗。
以上公开的仅为本申请的一个具体实施例,但本申请并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。
附表、【专利附图】

【附图说明】
[0034]表1.脱细胞方案1:
【权利要求】
1.一种骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤:取材对象的选择、原材料的获取和准备、前置处理、脱细胞、消毒保存、体外评估。
2.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述取材对象的选择为，选择血供明显的异种异体骨骼肌；取材范围包括骨骼肌支配血管的上级血管；取材时间为取材部位骨骼肌仍具备有效血液循环时取材。
3.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述原材料的获取和准备，其标准是确保骨骼肌内动静脉系统均得到充分灌注、血液成分被排出而不会在骨骼肌小血管中凝结致微循环阻塞，此外灌注未导致骨骼肌内血管网络破坏。
4.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述前置处理指明确所插管动脉支配的骨骼肌范围、支配动脉有无解剖学变异，插管支配动脉的伴行静脉，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪组织。
5.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述脱细胞步骤包括:将插管血管接入生物反应器，经支配血管按序列分批灌注不同处理液，标准是达到脱细胞要求、保留骨骼肌细胞外基质中80%以上的生物活性成分；其中，所述处理液包括酶处理液和化学药物处理液。
6.根据权利要求5所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述酶处理液选自胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶或核酸外切酶/核酸内切酶中的一种或几种；所述化学药物处理液选自离子型、非离子型和两性表面活性剂、螯合剂、高低渗溶液的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述核酸外切酶/核酸内切酶为脱氧核糖核酸酶，所述脱氧核糖核酸酶的终浓度为30-50U/ml ;所述胰蛋白酶的终浓度为0.01~0.25% ； α -半乳糖苷酶的终浓度为10-25U/ml ； 所述化学药物处理液选自乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸的一种或几种，其中所述乙二胺四乙酸或乙二醇双四乙酸的终浓度为0.02~0.5%，所述十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01~0.1%，所述聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.1~1%，所述脱氧胆酸的终浓度为0.5~2%。
8.根据权利要求7所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述分批灌注的处理液选自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇双四乙酸、脱氧核糖核酸酶/ α -半乳糖苷酶、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚和脱氧胆酸的几种，其中所述胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇双四乙酸的作用时间为1-3小时，脱氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶的作用时间为0.4-1小时，十二烷基硫酸钠的作用时间为4-24小时、聚乙二醇辛基苯基醚的作用时间为8-24小时、脱氧胆酸的作用时间4-24小时。
9.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述消毒保存中的消毒方法选自全灌注系统预灭菌、全程使用灭菌液体灌注、制备后消毒液灌注，或辐射灭菌的一种或几种；所述消毒保存中的保存技术选自水化保存或干燥体保存。
10.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述体外评估包括:检测骨骼肌全器官脱细胞基质的组织学、超微结构，检测残留核酸、内毒素含量和残留核酸链的长度，测定生物负载以及残留脱细胞化合物含量，检测骨骼肌基底膜特异性成分的存在，测定促干细胞粘附、增殖和分化成分的含量。
11.根据权利要求10所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述骨骼肌基底膜特异成分包括IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白，所述促干细胞粘附、增殖和分化成分包括透明质酸、糖胺聚糖、硫酸类肝素和生长因子。
12.一种骨骼肌全器官脱细胞基质，是一种骨骼肌再生支架，其特征在于， A.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留了骨骼肌复杂的、具有启动功能的三维平行排列、周期性的肌内膜管超微结构，该超微结构特别利于肌源性干细胞定向迁移、延伸和融合，也能引导新生肌管的方向；和 B.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留了骨骼肌完整的血管基质网络，包括终末动脉、静脉和毛细血管系统；和 C.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有用于维持肌源性干细胞活性的生物信号的生物活性成分，所述生物活性成分包括骨骼肌基底膜特异成分，以及促干细胞粘附、增殖和分化成分；和 D.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有肌肉-肌腱接头结构，以直接传导力学；和 E.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有其来源骨骼肌30%以上的机械强度，以及90%以上的韧性和弹性；和 F.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有神经通路，以达到较其他材料更容易实现新生骨骼肌的再神经化；和 G.所述骨骼肌全器官脱细胞基质脱细胞彻底，其DNA含量低于50ng/mg干重，残留DNA链长度为200-500bp，不携带真菌、病毒在内的生物负载；灭菌彻底，内毒素含量<15Eu/mg干重，植入后无免疫排斥反应、不传播疾病，可异体异种移植。
13.由权利要求12所 述的骨骼肌全器官脱细胞基质或权利要求1-11中任一所述的制备方法制备的骨骼肌全器官脱细胞基质制备的衍生医疗产品。
【文档编号】A61P21/00GK103805555SQ201410067736
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】张剑, 斯蒂芬·巴迪拉克, 胡志前, 王强, 职康康, 王妍妍, 周海洋 申请人:中国人民解放军第二军医大学