一种抗菌肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种抗菌肽及其应用。抗菌肽为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。将抗菌肽用于制备鱼类的抗细菌或病毒感染的抑制剂，即能显著增强鱼类的抗病毒和抗细菌能力。
【专利说明】一种抗菌肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种抗菌肽及其应用。
【背景技术】
[0002]抗菌肽(antimicrobial peptide)是一种具广谱抗菌、抗病毒甚至抗寄生虫活性的阳离子短肽。抗菌肽通过其特有的两性分子结构结合于细胞膜上，从而破坏细胞膜，杀死细菌。不同于传统的抗生素药物，抗菌肽这种独特的杀菌机制不会使靶细菌产生耐药性，并且大部分抗菌肽具有热稳定性高的特点，所以抗菌肽越来越引起人们的重视。抗菌肽广泛存在于微生物以及动植物体内，目前已发现的抗菌肽有1800多种。至今在鱼类中鉴定出的抗菌月太包括 hepcidin, defensins, pleurocidin, piscidin, moronecidin, misgurain, par daxin, paras in, LEAP-2和NK-1ysin等数十种。检测发现，这些抗菌肽具广谱的抗菌活性，有些还具有抗病毒活性。抗菌肽是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分，在鱼类抵御病原感染过程中发挥着重要作用。因此，抗菌肽在水产动物病害防治中具有巨大的应用潜力和良好的应用前景。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种抗菌肽及其应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种抗菌肽，抗菌肽为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
[0006]所述抗菌肽的应用，所述抗菌肽用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。
[0007]本发明具有如下优点:本发明的抗菌肽能够明显提高鱼类抗病毒和抗细菌感染能力。
【具体实施方式】
[0008]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0009]实施例1
[0010]本发明的抗菌肽(命名为NKLP27)为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。
[0011]序列表SEQ ID N0.1 为:
[0012]KVKARLIKICNKIGFLKSRCHKFVITH
[0013](a)序列特征:
[0014]籲长度:27
[0015]?类型:氨基酸序列
[0016]籲链型:单链
[0017]籲拓扑结构:线性
[0018](b)分子类型:蛋白质[0019](C)假设:否
[0020](d)反义:否
[0021 ] (e)最初来源:半滑舌鳎
[0022]结构特点:富含碱性氨基酸
[0023]实施例2
[0024]抗菌肽的应用
[0025]步骤I)抗菌肽的合成
[0026]上述实施例1的抗菌肽NKLP27由“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成，纯度>90%。
[0027]步骤2)抗菌肽注射
[0028]将上述步骤I)的合成抗菌肽在PBS中稀释至20ug/ml，即为抗菌肽稀释液。将20条半滑舌鳎(重约10.1g)随机分为4组，每组5条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别注射50ul抗菌肽稀释液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别注射50ul PBS0
[0029]所述PBS 组成成分按重量百分比计:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0? 024%NaH2P04，余量为水。
[0030]步骤3)细菌和病毒悬液制备
[0031]在LB培养基中培养鳗弧菌C312至OD6tltl为0.8，然后离心(5000g，4 °C，IOmin),收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为106cfu/ml，即为鳗弧菌悬液。将细胞肿大病毒RBIV-Cl (具体制备方法见Zhang M, Xiao Z, Hu Y, SunL.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012; 43:556 - 64)于 PBS 中稀释至105copies/ml,即为病毒悬液。
[0032]所所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为=CGMCC N0.6250，保藏日期2012.6.21,分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
[0033]步骤4)攻毒感染
[0034]在上述步骤2)注射后lh，将A和B组的每条鱼注射IOOul上述步骤3)的鳗弧菌悬液，将C和D组的每条鱼注射IOOul上述步骤3)的病毒悬液。在细菌感染后第I天，取A和B组鱼肾脏和脾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将IOOul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30°C培养48h，计算出现的菌落数。在病毒感染后第5天，利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从C和D组鱼肾脏和脾脏组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明A组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为2.1xlO2和7.3xl02)显著(P〈0.01)低于B组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为4.2xl02和2.5x103)；C组鱼肾脏和脾脏的病毒数(分别为2.5xl03和8.7xl05)显著(Ρ〈0.01)低于D组鱼肾脏和脾脏的病毒数(分别为3.1xlO5和4χ106)。
[0035]这些结果表明，本发明的抗菌肽NKLP27能够显著增强鱼类抵抗细菌和病毒的侵染。
【权利要求】
1.一种抗菌肽，其特征在于:抗菌肽为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
2.—种权利要求1所述抗菌肽的应用，其特征在于:所述抗菌肽用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。
【文档编号】A61P31/04GK103804482SQ201410067697
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】孙黎, 张敏 申请人:中国科学院海洋研究所