人工抗菌肽pr39-r1t的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体设及人工抗菌肤PR39-R1T的制备方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素长期在临床治疗上广泛地不恰当应用，使得许多病原菌产生了明显耐药 性，现已成为威胁人类和动物健康的重大问题。更为严重的是临床上出现了多重耐药菌株， 2010年发现的超级病菌NDM-1更是对绝大多数抗生素均不敏感。目前，开发一种新的抗生 素一般需要10年左右，而产生一代耐药菌只需2年。抗感染形势非常严峻，开发设计新型 抗菌药物已迫在眉睫。
[0003]抗菌肤是一类由宿主产生的能够抵抗外界病原体感染的小分子多肤，是生物天然 免疫防御系统的重要组成部分，由特定基因编码产生。其生物功能具有多样性，除了具备广 谱抗菌活性外，还具备抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫等生物活性。抗菌肤广泛存在于各 种生物体内，在微生物、植物和动物中均有发现并成功分离获得。在适当的浓度下，抗菌肤 能够与生物膜/壁组成成分或胞内细胞器等多种微生物祀位相互作用，前者破坏细胞质膜 的完整性，后者干扰细胞的正常代谢活动，最终导致细菌死亡。更重要的是抗菌肤能作为免 疫效应分子，启动和调节宿主免疫防御体系，保护宿主免受病原微生物侵害。抗菌肤独特的 作用机理，使得其具有抗菌谱广泛、不易产生耐药性等特点，且对目前已产生耐药性的菌株 同样可发挥作用。因此，抗菌肤或能替代传统抗生素药品，扭转抗生素应用的恶性循环，是 一类具备广阔的市场前景和发展潜力的新型抗菌药物。
[0004] 各类动物基于适应生存环境的需要，在长期的自然选择中，逐渐形成了防御机制， 即分泌多种结构特殊、功能多样的抗菌肤类物质，用W抵抗病原微生物的侵袭。在猪肠道内 发现的抗菌肤PR-39,具有39个氨基酸残基，分子量约为4. 2kD;在林蛙皮肤上发现的抗菌 肤Rana化erin-lT，具有33个氨基酸残基，分子量约为3. 6kD。W上两种抗菌肤的天然分离 物可对多种细菌、真菌和原生生物表现出杀伤作用。
[0005] 生物体内抗菌肤含量较低，直接提取的工艺要求高，难度大，无法应用于规模化生 产。人工化学合成虽可获得与天然抗菌肤一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正确的空 间结构，且因存在昂贵的成本，使其目前仅停留在实验室试验阶段。通过基因工程途径合 成人工抗菌肤是规模化生产制备的理想选择。除此之外，天然抗菌肤的生物活性不强、存 在细胞毒性和溶血活性使其推广应用受到一定的限制。研究表明，杂合不同抗菌肤分子可 W有效改善其生物活性，消除或降低其细胞毒性和溶血活性。迄今尚无将抗菌肤PR-39和 Ranatuerin-IT杂合并进行高效表达的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于解决现有天然抗菌肤生物活性低，且存在溶血活性的问题，提 供一种具有高生物活性、无溶血活性的人工抗菌肤PR39-R1T，W及适用于规模化生产的基 于大肠杆菌表达系统的高效制备方法，同时提供人工抗菌肤PR39-R1T针对多种细菌的应 用。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案予W实现。
[0008]根据GenBank中的抗菌肤PR-39 (No.AAB20869. 1)和Ranatuerin-IT(No. P82740. 1)成熟肤氨基酸序列，人工设计出本发明人工抗菌肤PR39-R1T的氨基酸序列SEQ IDNo. 1，采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肤的核巧酸序列，并在两端分别添加 核酸限制性内切酶识别位点，形成目的基因序列SEQIDNo. 2。
[0009] 采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因。设计两两互补的6条PCR引物， 所述引物？1、？2、？3、？4、？5和？6分别具有56910齡.3、56910齡.4、56910齡.5、569 IDNo. 6、SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8所示的核巧酸序列，通过多步PCR获得目的基因。
[0010] 将获得的目的基因与原核表达质粒祀T-32a(+)连接，构建原核表达载体，并转化 至大肠杆菌化21或Rosetta中，筛选基因工程阳性菌。添加IPTG诱导基因工程菌表达，超 声波裂解菌体后进行SDS-PAGE，检测蛋白表达量。
[0011] 使用肠激酶酶切处理表达产物后，通过镶离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌 肤PR39-R1T。
[0012] 通过微量稀释法测定人工抗菌肤PR39-R1T对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽抱杆菌、绿脈杆菌、猪链球菌2型和炭痘杆菌的最小抑菌浓度（MIC)和最低杀菌浓度 (MBC)。
[0013] 通过测定抗菌肤PR39-R1T针对小鼠红细胞的溶血率，判断其溶血性。
[0014] 本发明具有积极有益的效果。
[0015] 本发明依据GenBank中的抗菌肤PR-39和Ranatuerin-IT成熟肤氨基酸序列，人 工设计出本发明人工抗菌肤PR39-R1T，并采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肤的 核巧酸序列，通过原核表达系统大量获取人工抗菌肤PR39-R1T。经实验证明本发明人工抗 菌肤PR39-R1T具备较强的广谱抗菌活性，可抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，同时不具 有溶血活性。因此，其可作为一类新型抗菌药物，在食品防腐、疾病治疗等方面具有良好的 应用前景，极具开发潜力。
[0016] 本发明制备方法表达效率高，分离纯化过程简单，生产成本低，稳定性好，可应用 于规模化生产。
【附图说明】
[0017] 图1人工抗菌肤PR39-R1T溶血活性检测。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1;构建原核表达载体和基因工程菌。
[0019]根据GenBank中的抗菌肤PR-39 (No.AAB20869. 1)和Ranatuerin-IT(No. P82740. 1)成熟肤氨基酸序列，将抗菌肤Ranatuerin-IT第22位的甲硫氨酸（Met)替换成 色氨酸（T巧），人工设计出本发明人工抗菌肤PR39-R1T的氨基酸序列SEQIDNo. 1，其中 DDDDK为肠激酶酶切位点。之后采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肤的核巧酸序 列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶义和化;?仍识别位点，形成目的基因，序列如 沈QIDNo. 2所示。
[0020]设计的目的基因序列为5'-cacctcgaggatgatgatgataaacatcatcgtcgtcgtccgcgtc cgccgtatctgccgcgtccgcgtccgccgccgttttttccgccgcgtctgccgccgcgtattccgccgggttttccg ccgcgttttccgccgcgttttccgcatcatggtctgctgagcggtctgaaaaaagttggtaaacatgttgcaaaaaa tgttgC3gtt3gCCtgtggg3t3gCCtg333tgt3333tt3gCggtg3ttgtC3tC3tg3tg3tg3tg3t333^g^ 巡aat-3'，总序列共有28化p，下划线分别为核酸限制性内切酶ZAoJ和化細仍识别位点。
[0021] 采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因。设计两两互补的6条PCR引物，其 中P1、P2之间，P2、P3之间，P3、P4之间，P4、P5之间和P5、P6之间均含有10个重叠碱基。 所述引物？1、？2、？3、？4、？5和？6分别具有56910齡.3、56910齡.4、56910齡.5、569 IDNo.6、SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的核巧酸序列，由广州英駿生物有限公司合成。
[0022] 使用上述引物进行多步PCR获得目的基因。先WP1和P2为引物扩增目的基因 前面1/3部分序列，然后WP3和P4为引物扩增目的基因中间1/3部分序列，再WP5和P6 为引物扩增目的基因后面1/3部分序列，最后W前S次PCR产物为模板，P1和P6为引物扩 增获得目的基因的完整序列。反应体系（50yL)如下；2X化qPCRMastermix25yL，上游 引物和下游引物各1.0化，dd&O23化。PCR程序如下；95°C预变性5min;94°C变性30s， 58