专利名称：从诸葛菜中提取抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种从诸葛菜中提取对真菌有抑制效果的抗菌肽的方法。
背景技术：
目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。另一方面，长期以来，人们一直通过在动物饲料中添加抗生素、抗菌药物类生长促进剂来控制腹泻、维持健康、促进生长及提高饲料利用率。但是大量使用抗生素、抗菌药物在抑制病原微生物的同时，也抑杀了动物体内生理性微生物，破坏了微生物种群或群落间相互制约的微生态平衡，从而导致动物，特别是幼龄动物对病原微生物的易感性，因此，寻找全新类型的抗生素替代品，生产出既能防止畜禽疾病发生，促进生长，副作用又小、无残留、无耐药性的绿色饲料添加剂和药品，是解决现有化学抗生素副作用的一条有效途径。研究发现，抗菌肽具有代替传统抗生素的潜力，其优点表现在抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变；无免疫原性，对人畜无毒副作用；具有良好的溶解性和热稳定性；对较高的离子强度或较大的PH变化具有较好的耐受性，甚至有抵抗消化道多肽酶水解的能力。因此，抗菌肽越来越受到研究人员的关注，而被认为将会在医药工业和饲料添加剂上有着广阔的应用
前景。天然抗菌肽是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽， 通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右，是一种非特异性免疫分子，同时也是体液免疫防卫系统中的重要成员，在抵御外来病原体致病过程中起重要作用。具有明显的对真菌、病毒、原虫的杀伤作用，同时又可以促进伤口的愈合(可能是加速了创伤处细胞的分裂增殖)，能攻击肿瘤细胞而对正常细胞没有作用。根据抗菌肽的来源可将其分为三类动物抗菌肽、植物抗菌肽和细菌抗菌肽。自1972年瑞典科学家Baman首先发现抗菌肽以来，科学家们已经在昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人类等多种生物体中发现并分离得到了 300 多种内源性抗菌肽。经过十几年的努力，华南农业大学教授黄自然及其研究组从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物(溶菌酶)一抗菌肽，取得了首创性科研成果。
南开大学、天津大学和大港油田联手攻关，成功地从苍蝇体内分离出抑制多种病源菌和病毒的抗菌肽。目前多种抑菌实验已经完成，科研人员正在着手进一步纯化从苍蝇幼虫体内提取出的抗菌肽。中国水稻所黄大年教授主持的蚕抗菌肽B基因转化水稻的研究，抗菌肽 B基因转化植株表现出对白叶枯病合细条病的抗性有明显提高，为水稻白叶枯病的抗性育种提供了一条新的途径.目前，已有多种抗菌肽抗生素正在进行临床前的可行性研究，其中magainins已经进入三期临床试验阶段。但抗菌肽要大量生产应用，目前还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而通过基因工程，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，虽然可以克服这一缺点，但CN 102382183 A
说明书
2/4页 融合表达后抗菌肽独特的N-端和C-端结构很难保持完整的天然的空间构象，使活性受到较大影响。因此提取天然的活性抗菌肽仍是最切实可行的方法。另一方面，国内的抗菌肽研究主要集中在动物和微生物源抗菌肽上，对植物源抗菌肽研究相对较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合提取诸葛菜中的抗菌肽的高效分离纯化方法。本发明诸葛菜抗菌肽提取及分离方法通过以下步骤实现
(1)诸葛菜蛋白粗提液的制备。将诸葛菜研磨成浆，加入可溶蛋白提取缓冲液，在3— 5°C浸提、过滤、离心分离滤液，弃沉淀，取上清液；
(2)粗蛋白沉淀、脱盐。将上清液边搅拌边加入(NH4)2S04至饱和度35—45%、3—5°C 静置、离心分离，再得上清液，加入(NH4MS04至饱和度75— 85%，静置，离心分离，将沉淀溶于离子交换层析缓冲液I中，得蛋白质粗提液；
(3)离子交换层析。将蛋白质粗提液上用洗脱液平衡好的离子交换层析柱，用离子交换层析缓冲液I淋洗至基线，再用离子交换层析缓冲液II进行洗脱，检测抑菌活性收集活性组分；
(4)抗菌肽的纯化。将活性组分用离子交换层析缓冲液I透析，再用凝胶过滤缓冲液作透析，然后抽真空浓缩，将浓缩液上分子筛层析柱，用凝胶过滤缓冲液洗脱，检测抑菌活性收集活性组分，冷冻干燥得抗菌活性物质干粉。离子交换层析缓冲液I为20mol/LPH6. 2磷酸缓冲液，离子交换层析缓冲液II为每升离子交换层析缓冲液I中加入lmol NaCl，洗脱液和凝胶过滤缓冲液为50mol/LPH7. O 磷酸缓冲液加0. Imol/LNaCI，可溶蛋白提取缓冲液为50mol/LPH7. 0磷酸缓冲液加0. Imol/ LKCl和2mMEDTA，离子交换层析柱分别为CM—52，分子筛层析柱为kphadexG—50。所述的诸葛菜为其茎和叶。抗菌肽检测、鉴定。(1)抗菌活性检测在90mmX 15mm的培养皿中倒入IOmLPDA固体培养基，待凝固后在培养基中央分别接种小麦赤霉病菌、葡萄炭疽病菌、黄瓜镰刀孢菌。然后在28度培养至菌落直径为2-3cm时，在距离菌落边缘0. 5cm处用直径0. 6cm的打孔器打孔。然后在小孔中加入提取的抗菌物质，浓度分别为0. 32mg/ml, 0. 63 mg/ml, 1. 25 mg/ml, 2. 5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml,在23度下培养48-72小时，观察抑菌圈的大小。结果显示当抗菌物质浓度在2.5 mg/ml以上时即表现出明显的抑菌活性。固体PDA培养基马铃薯汁200克，20克葡萄糖，15克琼脂，加水至IOOOmL, 121 度灭菌30分钟。(2)分子量检测用1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)检测所提取抗菌物质，用考马斯亮蓝R-250染色，经纯化后的抗菌物质在SDA-PAGE上显示单一条带，用低蛋白分子量蛋白质Marker估测其表观分子量约为10KD。而据长期研究发现，诸葛菜具有很好的抗病性，其抗病菌能力超过了其它很多植物，包括油菜，其抗菌肽的提取目前还未见报道。而诸葛菜易栽培，对条件要求不高，材料来源易得，因此从中提取抗菌肽是一种较好的办法。本发明与现有的抗菌肽制备方法相比，其优点和效果可概括为
1.本方法适合对诸葛菜植株的抗菌肽提取，能特异性地高效提取诸葛菜抗菌肽，目前的其他方法多数为动物抗菌肽的提取，少数其他植物抗菌肽的提取方法不适合诸葛菜这种材料.
2.用本发明提供的方法所提取的抗菌肽纯度高、效果好，收获率高达万分之三，高于从油菜等其它植物中提取抗菌肽的其它方法。3.用本发明提供的方法所提取的诸葛菜抗菌肽抑制真菌效果好，抑菌实验表明 2. 5 mg/ml以上时能有效抑制多种真菌，小麦赤霉病菌、葡萄炭疽病菌、黄瓜镰刀孢菌。抗菌能力与其它现有提取的植物抗菌肽作用相当。4.用本发明提供的方法所提取的诸葛菜抗菌肽来源广泛。诸葛菜易栽培成活，生长条件无苛刻要求，材料易得。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的具体描述。有必要指出的是，以下的实施例只用于对本发明做进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟悉人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。
实施例1)诸葛菜蛋白粗提液的制备。将200g的诸葛菜茎、叶洗净研磨成浆，每450mL诸葛菜可溶蛋白提取缓冲液，在 4°C下浸提过夜，纱布过滤，4°C下IOOOOrpm冷冻离心lOmin，弃沉淀，上清液即为诸葛菜蛋白粗提液。可溶蛋白提取缓冲液配方为50mol/L ρΗ7· O磷酸缓冲液；0. lmol/L KCl ； 2mMEDTA.
2)粗蛋白沉淀、脱盐。将上述所得蛋白粗提液边搅拌边加入固体(NH4) #04至饱和度40%，4度静置 2h, IOOOOrpm离心lOmin，弃沉淀，上清再加固体(NH4) 2S04至饱和度80%，4度静置2h，后 IOOOOrpm离心20min，将沉淀溶于少量离子交换层析缓冲液I中，并用透析袋进行透析。离子交换层析缓冲液I配方为20mol/L pH6. 2磷酸缓冲液
3)诸葛菜抗菌肽的分离纯化。(1)离子交换层析。将CM-52按常规处理后装柱(Φ2Χ18(3Π )，将脱盐的蛋白质初提液上预先用洗脱液平衡好的CM-52柱，然后用离子交换层析缓冲液I淋洗至基线，再用离子交换层析缓冲液II进行洗脱，流速30ml/h，紫外检测波长254nm，得到2个主峰，收集这2个吸收峰的溶液，按后面步骤(5)中的方法用黄瓜镰刀孢菌检测各峰物质抑菌活性，结果显示峰2物质有抑菌活性，将峰2活性组分进一步纯化。离子交换层析缓冲液II配方为20mol/LpH6. 2磷酸缓冲液；lmol/L NaCl。(2)分子筛柱层析。将离子交换层析所得峰2活性物质用离子交换层析缓冲液I 作透析，再用凝胶过滤缓冲液作透析，抽真空浓缩。将上一步产物上预先平衡好的kphadex G-50柱(c52X80cm)，流速18ml/h，洗脱液为凝胶过滤缓冲液，紫外检测波长254nm，又得到2个主峰，收集这2个吸收峰的溶液，按后面步骤(5)中的方法用黄瓜镰刀孢菌检测各峰物质抑菌活性，结果显示第二个吸收峰的物质有抑菌活性，将此活性组分进行冷冻干燥，得到IOmg淡黄色粉末。凝胶过滤缓冲液配方为50mol/L ρΗ7· 0磷酸缓冲液；0. lmol/L NaCl。最后本发明中所得诸葛菜抗菌物质用高效液相色谱分析了纯度，样品只出现了一个峰，结果表明所得抗菌物质已是纯品。4)诸葛菜抗菌物质的肽属性测定
经kphadex G-50柱层析纯化的活性组分，用链霉蛋白酶E处理4小时，分解肽链后处理液呈黄色深沉量增加，其抑菌活性明显下降(见表一)，因此可以确定所分离组分的抗菌活性物质是肽类物质。表一链霉蛋白酶E对所得抗菌物质抑菌活性的影响
权利要求
1.从诸葛菜中提取抗菌肽的方法，其特征在于如下步骤(1)将诸葛菜研磨成浆，加入可溶蛋白提取缓冲液，在3 — 5°C浸提、过滤、离心分离滤液，弃沉淀，取上清液；(2)将上清液边搅拌边加入(NH4) 2S04至饱和度35—45%、3—5°C静置、离心分离，再得上清液，再加入(NH4) 2S04至饱和度75—85%，静置，离心分离，将沉淀溶于离子交换层析缓冲液I中透析，得到蛋白质粗提液；(3)离子交换层析，将蛋白质粗提液上预先用洗脱液平衡好的离子交换层析柱，用离子交换层析缓冲液I淋洗至基线，再用离子交换层析缓冲液II进行洗脱，检测抑菌活性收集活性组分；(4)将上述所得活性组分用离子交换层析缓冲液I透析，再用凝胶过滤缓冲液作透析， 再抽真空浓缩，将浓缩液上分子筛层析柱，用凝胶过滤缓冲液洗脱，检测抑菌活性，收集活性组分，将活性组分冷冻干燥得抗菌活性干粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于离子交换层析缓冲液I为20mol/LpH6. 2 磷酸缓冲液，离子交换层析缓冲液II为每升离子交换层析缓冲液I中加入lmol NaCl，洗脱液和凝胶过滤缓冲液为50mol/L pH7. O磷酸缓冲液加0. lmol/L NaCl，可溶蛋白提取缓冲液为50mol/L pH7. O磷酸缓冲液加0. lmol/L KCl和2mM EDTA,离子交换层析柱为CM — 52 ； 分子筛层析柱为kphadexG — 50。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的诸葛菜为其茎和叶。
全文摘要
本发明为从诸葛菜中提取抗菌肽的方法，解决从动物和微生物源提取抗菌肽成本高，从其它植物提取抗菌物质提取率低的问题。(1)将诸葛菜研磨成浆，加入可溶蛋白提取缓冲液，浸提、过滤、离心分离，取上清液；(2)将上清液加入(NH4)2SO4至饱和度35—45%、离心分离，再得上清液，加入(NH4)2SO4至饱和度75—85%，离心分离，将沉淀溶于离子交换层析缓冲液Ⅰ中透析，得蛋白质粗提液；(3)将蛋白质粗提液上离子交换层析柱，用离子交换层析缓冲液Ⅰ淋洗，再用离子交换层析缓冲液Ⅱ进行洗脱，检测各洗脱峰的抑菌活性收集活性组分；(4)将活性组分用离子交换层析缓冲液Ⅰ透析，再作透析，抽真空浓缩，将浓缩液上分子筛层析柱，洗脱检测抑菌活性，收集活性组分，将活性组分浓缩得诸葛菜抗菌肽。
文档编号C07K14/415GK102382183SQ20111034585
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者冯雷, 周丽蓉, 陈文清 申请人:四川大学