专利名称：一种提取纯化4-雄烯二酮的方法
技术领域：
本发明属于植物化学技术领域。具体地说，涉及一种从植物留醇发酵液中提取纯化4-雄烯二酮(4-AD)的方法。
背景技术：
4-雄烯二酮(AndrostenedioneJ-AD)是甾体类激素药物的重要中间体，可用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素等100余种药物。微生物转化留醇产生4-AD的发酵系统很多，其中分枝杆菌油水两相发酵系统可高效降解植物留醇侧链产生4-AD，并具有较高的甾醇加入量和较低的底物及产物抑制性等优点。但微生物发酵系统目前普遍存在目标产物4-AD难于提取分离的问题，4-AD的纯度较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何提取并纯化得到高纯度4-AD。为了解决上述技术问题，本发明提供一种提取纯化4-雄烯二酮的方法。本发明的植物留醇发酵液的来源可以为采用本领域常用菌种对植物留醇进行常规发酵后所得的发酵液，例如采用分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)直接发酵植物甾醇原料，得到植物留醇发酵液。本发明提取纯化4-雄烯二酮的方法为采用乙酸乙酯溶解植物留醇发酵液的油相以去除菌体，经减压蒸馏后用甲醇萃取，经脱色重结晶后得到4-雄烯二酮纯品。具体地，该方法包括如下步骤1)取植物留醇发酵液加热，加入中性盐使分层，收集上层，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上层，加热减压蒸馏，得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上层，加热减压浓缩，降温结晶，得4-雄烯二酮粗品；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加热溶解，加水搅拌，静置分层，取乙酸乙
酯层，降温结晶；5)向步骤4)所得结晶中加入甲醇溶解，脱色，结晶，得到4-雄烯二酮纯品。其中步骤1)所述加热的温度为70-90°C，优选78-85°C，更优选80°C ；所述中性盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾等，优选氯化钠，中性盐的加入量为植物留醇发酵液的 l-5w/v %，优选 2-4w/v %，更优选 3w/v % ；步骤2)所述乙酸乙酯的加入体积为所述第一油相体积的1-5倍，优选2-4倍，更优选3倍；所述加热的温度为50-70°C，优选58-62°C，更优选60°C ；步骤3)所述甲醇的加入体积为所述第二油相体积的1-5倍，优选2-3倍；所述浓缩为浓缩至甲醇体积的1/8-1/5，优选1/7-1/6 ；所述加热的温度为50-70°C，优选58-62°C， 更优选60°C ；所述降温为降至15-35°C，优选20-30°C，更优选25°C ；
步骤4)所述乙酸乙酯的加入量为4-雄烯二酮粗品的3-6倍，优选4-6倍，更优选 5倍；所述水的加入量为4-雄烯二酮粗品的1-4倍，优选1-3倍，更优选2倍；所述加热温度为55-70°C，优选60-65°C，更优选62°C ；所述降温为降至15_35°C，优选20_30°C，更优选 25 0C ；步骤5)中，将步骤4)所得结晶用甲醇溶解后加热至55-70°C，优选60_65°C，更优选62°C ；采用活性炭进行脱色，脱色后的溶液在50-70°C、优选58-62°C减压浓缩至甲醇体积的1/3-2/3、优选浓缩至1/2 ；然后降温至3-10°C、优选4-8°C结晶，更优选5°C结晶；离心，得到4-雄烯二酮纯品；步骤5)中，所述甲醇的加入量为4-雄烯二酮粗品的6-12倍，优选8_12倍，所述活性炭的加入量为4-雄烯二酮粗品的0. 2-0. 6w/w%,优选0. 4-0. 6w/w%。在一个实施方案中，提取纯化4-雄烯二酮的方法包括如下步骤1)将植物留醇发酵液加热至80°C，加入3w/v%的氯化钠，搅拌溶解30min，静置分层后，使发酵液中的水相与油相分离，收集上层，得到第一油相(含大量4-AD、菌体、留醇及杂质)，备用；2)将上述得到的第一油相按1 3 (ν/ν)加入乙酸乙酯，搅拌，静置分层，收集上层乙酸乙酯相(下层为菌体及少量水)；将上述得到的乙酸乙酯相在60°C减压蒸馏，得到第二油相(含4-AD、留醇及少量杂质)，蒸出的乙酸乙酯可回收利用；3)将上述得到的第二油相按1 2(v/v)加入甲醇，常温下经萃取塔萃取，得到上层轻相和下层重相，轻相为甲醇相，重相经60°C减压蒸馏后得到澄清油(主要为植物油脂， 发酵时的原料，可重复利用发酵)；将上层甲醇相在60°C减压浓缩，浓缩至原甲醇相体积的 1/6 ；将浓缩后的溶液进行降温结晶，降温至室温，离心，加少量甲醇洗涤，得到4-AD粗品；4)将上述得到的4-AD粗品按1 5 (v/m)加入乙酸乙酯，搅拌，加热至60°C完全溶解，按1 2(v/m)加水洗涤除杂，静置30min分层，分去水相后，将乙酸乙酯层降温结晶， 降温至室温，离心，加入少量乙酸乙酯洗涤，得到初精制4-AD结晶；5)将上述得到的初精制4-AD结晶按前述4_AD粗品1 10 (v/m)的比例加入甲醇溶解，加热至62°C加入活性炭脱色，活性炭加量为前述4-AD粗品的0. 5% (m/m)，脱色 30min后，抽滤，滤液在60°C减压浓缩至原体积的1/2，降温至5°C结晶，离心，加少量甲醇洗涤后得到精制4-AD纯品；将4-AD纯品在45°C鼓风干燥8h，每一小时翻一次盘。本发明的方法采用乙酸乙酯溶解植物留醇发酵液的油相以去除菌体，经减压蒸馏后用甲醇萃取，经脱色重结晶后得到4-雄烯二酮纯品。与化学合成法相比，该方法至少具有工艺简单、反应条件温和、所需生产设备少，且提取收率高和产品纯度高等优点之一，所用提取试剂乙酸乙酯、甲醇等经回收后，可循环使用，回收油也可重复利用，减少废弃物排放，对环境污染小，符合循环经济发展方向，适用于工业化大规模生产。所生产的4-雄烯二酮作为重要原料药，社会需求量巨大，经济效益十分明显。具体实施方法以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1采用分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)直接发酵植物甾醇原料，得到植物甾醇发酵液(4-AD含量0. 76 %，留醇含量0.27%，总糖含量1.37%，还原糖含量0. 54 %，氨基氮含量0. 34%,溶磷63mg/L)。1.取50L植物留醇发酵液，加热至80°C，加入1.5kg氯化钠，搅拌溶解30min，静置2h分层后，分去下层水相，收集上层油相①15L(4-AD含量2. 48%，留醇含量0. 86% )待用。2.将上述得到的15L油相①加入45L乙酸乙酯，搅拌lh，静置2h后分层，收集上层乙酸乙酯相(4-AD含量0.82%，留醇含量0.28% )；将上述得到的乙酸乙酯相60°C减压蒸馏，得到油相②12L(4-AD含量3. 04%，留醇含量1. 03% )。3.将上述得到的油相②加入25L甲醇常温下经萃取塔萃取，得到轻相和重相，轻相为甲醇相26L(4-AD含量1. 49%，留醇含量0. 12% )，重相经60°C减压蒸馏后得到澄清油可重复利用；将上述得到的26L甲醇相60°C减压浓缩，浓缩至4L。将浓缩后的甲醇溶液进行降温结晶，降温至250C，离心，加IOOmL甲醇洗涤，得到350g 4-AD粗品(4-AD含量63%， 甾醇含量7. 64%)。4.将上述得到的350g 4-AD粗品加入1. 8L乙酸乙酯，搅拌，加热至60°C完全溶解粗品后，加700mL水洗杂，搅拌30mim，静置30min分层，分去水相后，乙酸乙酯相降温结晶， 降温至室温，离心，加入50mL乙酸乙酯洗涤，得到初精制4-AD 245g(4_AD含量87. 5%，甾醇含量 3. 02% )。5.将上述得到的初精制4-AD加入3. 5L甲醇溶解后加热至62°C加入1. 75g活性炭脱色，脱色30min后，抽滤，甲醇溶液60°C减压浓缩至1. 5L，降温至5°C结晶，离心，加50mL 甲醇洗涤后在45°C鼓风干燥8h，每一小时翻一次盘。得到精制4-AD 150g(4-AD含量99%， 甾醇未检出)。实施例2采用分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)直接发酵植物甾醇原料，得到植物甾醇发酵液(4-AD含量1. 26 %，留醇含量0. 43 %，总糖含量1.27%，还原糖含量0. 47 %，氨基氮含量0.31%，溶磷57mg/L)。1.取500L植物留醇发酵液，加热至85°C，加入18kg氯化钾，搅拌溶解30min，静置 2h分层后，分去下层水相，收集上层油相①200L(4-AD含量3. 13%，留醇含量1. 05% )待用。2.将上述得到的200L油相①加入800L乙酸乙酯，搅拌lh，静置2h后分层，收集上层乙酸乙酯相(4-AD含量1.02%，留醇含量0.34%)；将上述得到的乙酸乙酯相62°C减压蒸馏，得到油相②190L(4-AD含量3. 28%，甾醇含量0. 95% )03.将上述得到的油相②加入400L甲醇常温下经萃取塔萃取，得到轻相和重相，轻相为甲醇相400L(4-AD含量1. 55%，留醇含量0. 09% )，重相经60°C减压蒸馏后得到澄清油可重复利用；将上述得到的400L甲醇相62°C减压浓缩，浓缩至65L。将浓缩后的甲醇溶液进行降温结晶，降温至30°C，离心，加1.5L甲醇洗涤，得到6. 25kg 4-AD粗品(4-AD含量 65%，甾醇含量5.5% )。4.将上述得到的6. 25kg 4-AD粗品加入32L乙酸乙酯，搅拌，加热至65°C完全溶解粗品后，加1.3L水洗杂，搅拌30mim，静置30min分层，分去水相后，乙酸乙酯相降温结晶， 降温至室温，离心，加入800mL乙酸乙酯洗涤，得到初精制4-AD 4. lkg(4_AD含量87. 5%，甾醇含量2. 11% )0
5.将上述得到的初精制4-AD加入63L甲醇溶解后加热至65°C加入313g活性炭脱色，脱色30min后，抽滤，甲醇溶液62°C减压浓缩至30L，降温至8°C结晶，离心，加500mL甲醇洗涤后在45°C鼓风干燥8h，每一小时翻一次盘。得到精制4-AD 2. 5kg(4_AD含量99. 1%, 甾醇未检出)。实施例3采用分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)直接发酵植物甾醇原料，得到植物甾醇发酵液(4-AD含量1. 04%，留醇含量0. 36 %，总糖含量1.18%，还原糖含量0. 41 %，氨基氮含量0. 36 %，溶磷48mg/L)。1.取200L植物留醇发酵液，加热至78°C，加入6. 8kg硫酸钠，搅拌溶解30min，静置2h分层后，分去下层水相，收集上层油相①70L(4-AD含量2. 94%，留醇含量0. 97% )待用。2.将上述得到的70L油相①加入240L乙酸乙酯，搅拌lh，静置2h后分层，收集上层乙酸乙酯相(4-AD含量0.72%，留醇含量0.34%)；将上述得到的乙酸乙酯相58°C减压蒸馏，得到油相②53L(4-AD含量3. 26%，留醇含量1. 17%).3.将上述得到的油相②加入93L甲醇常温下经萃取塔萃取，得到轻相和重相，轻相为甲醇相115L(4-AD含量1. 54%，留醇含量0. 16% )，重相经60°C减压蒸馏后得到澄清油可重复利用；将上述得到的115L甲醇相58°C减压浓缩，浓缩至15L。将浓缩后的甲醇溶液进行降温结晶，降温至20°C，离心，加IOOmL甲醇洗涤，得到1.9kg 4-AD粗品(4-AD含量 68%，甾醇含量6.41% )。4.将上述得到的1. 9kg 4-AD粗品加入8. IL乙酸乙酯，搅拌，加热至60°C完全溶解粗品后，加2. 5L水洗杂，搅拌30mim，静置30min分层，分去水相后，乙酸乙酯相降温结晶， 降温至室温，离心，加入150mL乙酸乙酯洗涤，得到初精制4-AD 1. 05kg(4-AD含量88. 1%， 甾醇含量2. 65% )05.将上述得到的初精制4-AD加入12. 8L甲醇溶解后加热至60°C加入3. 95g活性炭脱色，脱色30min后，抽滤，甲醇溶液58°C减压浓缩至3. 8L，降温至4°C结晶，离心，加 50mL甲醇洗涤后在45°C鼓风干燥8h，每一小时翻一次盘。得到精制4_AD 780g(4_AD含量 99%，甾醇未检出)。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种从植物留醇发酵液中提取纯化4-雄烯二酮的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)取植物留醇发酵液加热，加入中性盐使分层，收集上层，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上层，加热减压蒸馏，得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上层，加热减压浓缩，降温结晶，得4-雄烯二酮粗Pm ；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加热溶解，加水搅拌，静置分层，取乙酸乙酯层，降温结晶；5)向步骤4)所得结晶中加入甲醇溶解，脱色，结晶，得到4-雄烯二酮纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述加热的温度为70-90°C，优选 78-85 "C。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述中性盐选自氯化钠、氯化钾、 硫酸钠或硫酸钾，其加入量为植物留醇发酵液的l-5w/v%，优选2-4w/v%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述乙酸乙酯的加入体积为所述第一油相体积的1-5倍，优选2-4倍；所述加热的温度为50-70°C，优选58_62°C。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述甲醇的加入体积为所述第二油相体积的1-5倍，优选2-3倍；所述浓缩为浓缩至甲醇体积的1/8-1/5，优选1/7-1/6。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述加热的温度为50-70°C，优选 58-620C ；所述降温为降至15-35°C，优选20_30°C。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述乙酸乙酯的加入量为4-雄烯二酮粗品的3-6倍，优选4-6倍，所述水的加入量为4-雄烯二酮粗品的1-4倍，优选1-3 倍。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述加热温度为55-70°C，优选 60-65°C，所述降温为降至15-35°C，优选20_30°C。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中将步骤4)所得结晶用甲醇溶解后加热至55-70°C，优选60-65°C ；采用活性炭进行脱色，脱色后的溶液在50-70°C减压浓缩至甲醇体积的1/3-2/3，降温至3-10°C结晶，离心，得到4-雄烯二酮纯品。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述甲醇的加入量为4-雄烯二酮粗品的6-12倍，优选8-12倍；所述活性炭的加入量为4-雄烯二酮粗品的0. 2-0.，优选 0. 4-0. 6w/w%。
全文摘要
本发明涉及一种从植物甾醇发酵液中提取纯化4-雄烯二酮的方法。该方法采用乙酸乙酯溶解植物甾醇发酵液的油相以去除菌体，经减压蒸馏后用甲醇萃取，经脱色重结晶后得到4-雄烯二酮纯品。该方法具有提取率高、产品纯度高等优点，回收的油可重复利用，对环境污染小，适用于工业化大规模生产。
文档编号C07J1/00GK102432657SQ20111034489
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者张雪锋, 李倩, 李荣杰 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司