一种雄烯二酮的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种雄烯二酮的制备方法，属于生物转化技术领域，制备方法是通过分枝杆菌转化植物甾醇生成雄烯二酮，在生物转化的体系中添加原凹土及改性凹土，其中原凹土及改性凹土的添加量为0.5～10g/L，本发明方法是在原凹土及改性凹土介质中，利用分枝杆菌催化植物甾醇侧链降解反应，生成雄烯二酮，能够有效提高底物在水溶液中的分散度，提高底物的利用率和反应速率，并在一定程度上解除底物和产物抑制，提高产物的转化率，反应条件温和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本低，对环境污染危害小，同时可以降低生产成本。
【专利说明】
-种雄稀二酬的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物催化领域，尤其设及到一种雄締二酬的制备方法。
【背景技术】
[0002] 酱体激素类药物是一类重要的医药产品，在世界范围内其产值仅次于抗生素，居 第二位。大部分的酱体激素类药物的生产都是W雄締二酬（雄酱-4-締-3 ,17-二酬， Amlrostenedione，简称AD)为起始原料的，AD是合成酱体激素类药物不可替代的中间体。既 可W用化学方法从野生药材"穿地龙"中植物提取合成AD，也可W通过降解自然界丰富的动 植物酱醇用微生物发酵的方法获得AD。微生物选择性降解植物酱醇侧链生成AD，能替代复 杂的多步化学合成法，并减轻目前由于馨葫皂素为原料造成的资源紧缺。但植物酱醇 (phytosterol，PS)为疏水性化合物，溶解度很低，易聚集在水相表面，而酱体转化酶属于胞 内酶，底物只有扩散进入细胞才能与酶接触而进行转化反应，运就导致植物酱醇与转化酶 不能很好接触，造成转化率偏低，发酵时间长等问题。
[0003] 凹凸棒±又称凹±(attapulgite，AT)，别名坡缕石(palygorskite)，是一种W含 水富儀娃酸盐为主层链状过渡结构的粘±矿物质，是一种具链层状结构的含水富儀娃酸盐 粘±矿物。AT独特的链层状晶体结构，赋予了AT许多性质，主要包括吸附性、载体性、催化 性、分散性和流变性等。用热活化、酸化、碱化、有机改性、混合法对原凹±进行改性可W使 其疏松多孔，比表面积增加，吸附性能和分散性能也随之提高，因而对其改性有较高的社会 效益和经济效益。
[0004] 本发明首先提出了将凹±及改性凹±，运用到微生物降解植物酱醇侧链生成AD的 反应模型中，利用凹±的分散性、吸附性和载体性来提高底物转化速率和转化率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种在凹±及改性凹±介质中利用 分歧杆菌催化降解酱体化合物植物酱醇侧链生成AD的新方法，该方法在一定程度上提高了 底物转化速率和转化率，具有操作简便，绿色环保，价格低廉的优点。
[0006] 本发明采用的技术方案是：一种雄締二酬的制备方法，利用分枝杆菌对植物酱醇 进行微生物转化生成雄締二酬，微生物转化体系中添加凹±。
[0007] 优选的，凹±是原凹±或改性凹±。
[000引优选的，改性凹±为酸改性凹±、硅烷偶联剂改性凹±、碱改性凹±和表面活性剂 改性凹±中的一种。
[0009] 其中，酸改性凹±的改性步骤为:将原凹±加入到酸溶液中，酸溶液为硫酸、盐酸、 硝酸、憐酸中的一种，超声振荡，离屯、水洗至中性，干燥后研磨成细粉。
[0010] 其中，硅烷偶联剂改性凹±的改性步骤为：将原凹±加入到pH3.5的醋酸水溶液 中，再加入0.1 %的硅烷偶联剂，硅烷偶联剂为3-氨基丙基二乙氧基硅烷KH550，超声振荡， 离屯、水洗至无硅烷偶联剂，干燥后研磨成细粉。
[0011] 其中，碱改性凹±的改性步骤为:将原凹±加入到碱溶液中，碱溶液为氨氧化钢或 氨氧化钟，超声振荡，离屯、水洗至中性，干燥后研磨成细粉。
[0012] 其中，表面活性剂改性凹±的改性步骤为:将原凹±加入到含有0.1 g/L的表面活 性剂改性溶液中，表面活性剂为十六烷基=甲基漠化锭，超声振荡后，离屯、水洗至无表面活 性剂，干燥后研磨成细粉。
[0013] 优选的，所述凹±的添加量为0.5~lOg/L。
[0014] 优选的，凹±的最适添加量为1~5g/L。
[0015] 优选的，微生物转化体系包括:转化培养基，活化的菌种种子培养液，植物酱醇和 凹±;其中，植物酱醇投料量为0.5~30g/L，活化的菌种种子培养液接种量为7% ;微生物转 化条件为:转化溫度为29~30°C，摇床转速为120~14化/min，转化时间为120~16化。
[0016] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0017] 1、本发明方法是在原凹±及改性凹±介质中，利用分枝杆菌催化植物酱醇侧链降 解反应，生成雄締二酬，制备过程中无需加入有机溶剂，降低了对环境具有严重破坏作用的 有机溶剂的使用，反应条件溫和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本 低，对环境污染危害小，同时可W降低生产成本。
[0018] 2、本发明提供了在原凹±及改性凹±介质中AD制备的工艺，能够有效提高底物在 水溶液中的分散度，提高底物的利用率和反应速率，并在一定程度上解除底物和产物抑 审IJ，提高产物的转化率，具有一定的工业化应用前景，对于我国制药行业有重要意义。
[0019] 3、本发明提供的在原凹±及改性凹±介质中AD制备的工艺，AD几乎可W合成所有 的酱体药物，对推动我国制药行业的发展有着重要意义。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，W下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能W此限定本发明的保护范围。
[0021 ] W下实验所用主要材料来源:Mycobacterium neoaurum TCCC11979,天津科技大 学微生物菌种保藏管理中屯、。
[0022] 缩写词含义：
[0023] AT--凹±
[0024] PS--植物酱醇
[00 巧]AD--雄締二酬（雄酱-4-締-3,17-二酬，An 化 OStenedione)
[00%] A 孤--雄酱二締二酬（雄酱-1,4-二稀-3,17-二酬，An 化 os1:a-diene-dione)
[0027] 1.改性凹±的制备：
[002引（1)酸改性凹±:将4g原凹±加入到lOOmL的4mol/L的酸溶液中，酸溶液为硫酸、盐 酸、硝酸、憐酸中的一种，超声振荡30min，离屯、水洗至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，备用。
[0029] (2)硅烷偶联剂改性凹±:将4g原凹±加入到IOOmL的抑3.5的醋酸水溶液中，再 加入0.1血硅烷偶联剂，硅烷偶联剂为3-氨基丙基二乙氧基硅烷K册50，超声振荡30min，罔 屯、水洗至无硅烷偶联剂，60°C干燥化，研磨成细粉，备用。
[0030] (3)碱改性凹±:将4g原凹±加入至IjlOOmL的4mol/L的碱溶液中，碱溶液为氨氧化 钢溶液、氨氧化钟溶液或其他碱溶液中的一种，超声振荡30min，离屯、水洗至中性，60°C干燥 8h，研磨成细粉，备用。
[0031] (4)表面活性剂改性凹±:将4g原凹±加入到IOOmL的含有0.0 lg表面活性剂改性 溶液中，表面活性剂为十六烷基=甲基漠化锭，超声振荡后，离屯、水洗至无表面活性剂，60 °C干燥化，研磨成细粉，备用。
[0032] 2.菌种活化培养:将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979菌种转接于新鲜斜面培 养基上，29°C培养2~4d，用0.5 %的TweenSO无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使 种子菌液ODsoo值控制在1.0±0.2，将种子菌液W2%的接种量接种到装有30mL种子液体培 养基的S角瓶中，于29°C，220r/min培养3加左右，测菌体ODsoo值为1.0±0.2得到种子培养 液。
[0033] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0034] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0035] 3 .植物酱醇微生物转化:将活化的种子培养液W7 %的接种量转接于装有含有 0.5-30g/L植物酱醇及0.5-lOg/L改性凹±的5〇1111^发酵培养基的250mL挡板瓶中，于29~30 °C，120~14化/min振荡培养120~16化得到发酵液。
[0036] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.0~抑7.4。
[0037] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[003引用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0039] 实施例1:添加酸改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0040] 1酸改性凹±的制备：
[0041 ] 将4g原凹±加入到IOOmL硫酸溶液中，硫酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离屯、后 弃上清，将下层固体水洗至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，即为硫酸改性凹±出5〇4-八1'。
[0042] 2菌种活化培养：
[0043] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 30血种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsoo值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0044] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0045] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0046] 3植物酱醇微生物转化：
[0047] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有5g/L植物酱醇及5g/L的硫酸 改性凹±出5〇4-41'的50血发酵培养基的250血挡板瓶中。
[0048] 其中发酵培养基成分为（g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸亚铁按0.05,硫酸儀 0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，pH7.2。
[0049] 添加硫酸改性凹±出5〇4-41'的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣 酸亚铁锭0.05,硫酸儀0.5,憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,植物酱醇5,硫酸改性凹± 出S04-AT 5，pH 7.2。
[(K)加]为了验证改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0051]其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇5，pH 7.2。
[0化2] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，140r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0化3] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0054] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0化5] 5比对结果：
[0化6] 如表1所示，7化后，添加酸改性凹±出5〇4-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为25.18±0.99%，是对照组（6.49±0.31%)的3.88倍；12化后，添加酸改性凹± 出S04-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为34.84±0.62%，是对照组（10.29± 0.12% )的3.38倍；16她后，添加酸改性凹±出5〇4-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为37.15± 1.07%，是对照组（15.07±0.15%)的2.46倍。
[0化7] 表1微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率
[0化引
[0059] 实施例2:添加酸改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0060] 1酸改性凹±的制备：
[0061 ] 将4g原凹±加入到IOOmL盐酸溶液中，盐酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离屯、后 弃上清，将下层固体水洗至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，即为盐酸改性凹±W1-AT。
[0062] 2菌种活化培养：
[0063] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5 %的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 30mL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0064] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0065] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0066] 3植物酱醇微生物转化：
[0067] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有3g/L植物酱醇及5g/L的盐酸 改性凹±肥1 -AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
[0068] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0069] 添加盐酸改性凹±肥1-41'的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸 亚铁锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇3，盐酸改性凹±W1-AT 5?pH 7.2O
[0070] 为了验证改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0071] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇3，pH 7.2。
[0072] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，120r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0073] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0074] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[00巧]5比对结果：
[0076] 如表2所示，7化后，添加酸改性凹±肥1-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为29.21±0.11%，是对照组（8.43±0.41%)的3.46倍；12化后，添加酸改性凹± HCl-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为37.85±0.44%，是对照组（12.94± 0.19% )的2.92倍；16她后，添加酸改性凹±肥1-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为41.11 ±0.78%，是对照组（15.97±0.04% )的2.57倍。
[0077] 表2微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率 [007引
[0079] 实施例3:添加酸改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0080] 1酸改性凹±的制备：
[0081 ] 将4g原凹±加入到IOOmL憐酸溶液中，憐酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离屯、后 弃上清，将下层固体水洗至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，即为憐酸改性凹±出口〇4-八1'。
[0082] 2菌种活化培养：
[0083] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌）菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0084] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0085] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[00化]3植物酱醇微生物转化：
[0087] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有5g/L植物酱醇及3g/L的憐酸 改性凹±出?化-41'的50血发酵培养基的250血挡板瓶中。
[0088] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0089] 添加憐酸改性凹±出?〇4-41'的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣 酸铁锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇5，憐酸改性凹上出口化-AT 3袖 7.2。
[0090] 为了验证改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0091] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇5，pH 7.2。
[0092] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，140r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0093] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0094] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000Xg，2 min),取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[00巧]5比对结果：
[0096] 如表3所示，7化后，添加酸改性凹±出?〇4-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为21.42±1.02%，是对照组（6.49±0.31%)的3.30倍；12011后，添加酸改性凹± 出P04-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为29.76± 1.11 %，是对照组（10.29± 0.12% )的2.89倍；16她后，添加酸改性凹±出?〇4-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为33.08±0.28%，是对照组（15.07±0.15% )的2.19倍。
[0097] 表3微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率
[009引
[0099] 实施例4:添加酸改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0100] 1酸改性凹±的制备：
[0101] 将4g原凹±加入到IOOmL硝酸溶液中，硝酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离屯、后 弃上清，将下层固体水洗至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，即为硝酸改性凹±HN03-AT。
[0102] 2菌种活化培养：
[0103] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌）菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0104] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0105] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0106] 3植物酱醇微生物转化：
[0107] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有Ig/L植物酱醇及3g/L的硝酸 改性凹±HN03-AT的50血发酵培养基的250血挡板瓶中。
[0108] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0109] 添加硝酸改性凹±歷化-41'的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣 酸铁锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇1，硝酸改性凹±11化)3-AT 3袖 7.2。
[0110] 为了验证改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0111] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇1，pH 7.2。
[0112] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，140r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0113] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0114] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[011引5比对结果：
[0116] 如表4所示，7化后，添加酸改性凹±歴化-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为30.07 ± 0.60 %，是对照组（13.01 ± 0.41 % )的2.31倍；120h后，添加酸改性凹± HN03-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为41.89 ±0.89%，是对照组(25.87 ± 0.19% )的1.62倍；16她后，添加酸改性凹±HN03-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为45.12 ± 0.40 %，是对照组(28.34 ± 0.04 % )的1.59倍。
[0117] 表4微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率 [01181
[0119] 实施例5:添加碱改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0120] 1碱改性凹±的制备：
[0121] 将4g原凹±加入到IOOmL的4mol/L的氨氧化钢溶液中，超声振荡30min，离屯、水洗 至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，即为氨氧化钢改性凹±NaOH-AT。
[0122] 2菌种活化培养：
[0123] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5 %的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0124] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0125] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0126] 3植物酱醇微生物转化：
[0127] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有Ig/L植物酱醇及Ig/L的氨氧 化钢改性凹±NaOH-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
[0128] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10，巧樣酸化，巧樣酸铁按0.05，硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0129] 添加氨氧化钢改性凹±^0H-AT的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2， 巧樣酸铁锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇1，碱改性凹± NaOH-AT 1，pH 7.2。
[0130] 为了验证改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0131] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇1，pH 7.2。
[0132] 将两组微生物转化体系一起放置于30°C环境下，120r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0133] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0134] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:陆enomenex C18柱，流动相为甲醇:水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0135] 5比对结果：
[0136] 如表5所示，7化后，添加氨氧化钢改性凹±化細-41'的微生物转化体系中雄締二酬 AD摩尔生成率为25.19±0.87%，是对照组（13.01±0.41%)的1.93倍；120h后，添加氨氧化 钢改性凹上化OH-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为34.88± 0.62%，是对照 组(25.87 ± 0.19 % )的1.35倍；16她后，添加氨氧化钢改性凹±化細-41'的微生物转化体系 中雄締二酬AD摩尔生成率为39.62 ± 1.07 %，是对照组(28.34 ± 0.04 % )的1.39倍。
[0137] 表5微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率 [01381
[0139] 实施例6:添加碱改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0140] 1碱改性凹±的制备：
[0141] 将4g原凹±加入到lOOmL的4mol/L的氨氧化钟溶液中，超声振荡30min，离屯、水洗 至中性，60°C干燥化，研磨成细粉，即为碱改性凹上KOH-AT。
[0142] 2菌种活化培养：
[0143] 将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0144] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0145] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0146] 3植物酱醇微生物转化：
[0147] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有5g/L植物酱醇及3g/L的碱改 性凹上KOH-AT的SOmL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
[0148] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0149] 添加碱改性凹±K0H-AT的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁 锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇5，碱改性凹±1(0护4了 3，pH 7.4。
[0150] 为了验证碱改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0151] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫 酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇5，pH 7.2。
[0152] 将两组微生物转化体系一起放置于30°C环境下，120r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0153] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0154] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0155] 5比对结果：
[0156] 如表6所示，7化后，添加碱改性凹±1(0护41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔 生成率为20.94 ± 0.91 %，是对照组（6.49 ± 0.31 % )的3.23倍；120h后，添加碱改性凹± KOH-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为29.32 ±0.22%，是对照组（10.29 ± 0.12% )的2.84倍；16她后，添加碱改性凹±1((^-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生 成率为：34.17± 1.37%，是对照组（15.07±0.15%)的2.26倍。
[0157] 表6微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率 [015 引
[01
[0160] 实施例7:添加硅烷偶联剂改性凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0161] 1硅烷偶联剂改性凹±的制备：
[0162] 将4g原凹±加入至IjlOOmL的抑3.5的醋酸水溶液中，再加入0.1 mL 3-氨基丙基S 乙氧基硅烷KH550，超声振荡30min，离屯、水洗至无硅烷偶联剂，60°C干燥化，研磨成细粉，即 为硅烷偶联剂改性凹±Iffl550-AT。
[0163] 2菌种活化培养：
[0164] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0165] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0166] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0167] 3植物酱醇微生物转化：
[0168] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有Ig/L植物酱醇及5g/L的硅烷 偶联剂改性凹±Iffl550-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
[0169] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸化，巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0170] 添加硅烷偶联剂改性凹±K册50-AT的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸 2，巧樣酸铁锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇1，硅烷偶联剂改 性凹上K册50-AT 5，pH 7.0。
[0171] 为了验证硅烷偶联剂改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实 验：
[0172] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇1，pH 7.0。
[0173] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，140r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0174] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[01巧]用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:陆enomenex C18柱，流动相为甲醇:水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0176] 5比对结果：
[0177] 如表7所示，7化后，添加硅烷偶联剂改性凹±1(册50-AT的微生物转化体系中雄締 二酬AD摩尔生成率为34.88±0.20%，是对照组（13.01±0.41%)的2.68倍；120h后，添加娃 烧偶联剂改性凹±础550-41'的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为47.03 ± 0.95 %，是对照组（25.87 ± 0.19 % )的1.82倍；16她后，添加硅烷偶联剂改性凹±1(册50-AT 的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为52.81 ±0.88 %，是对照组(28.34± 0.04% ) 的1.86倍。
[0178] 表7微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率
[01701
[0180」实施例8:添加表面活性剂改性凹王制备雄筛二剛的方法，实验妊程如下：
[0181] 1表面活性剂改性凹±的制备：
[0182] 将4g原凹±加入到IOOmL的含有0.Olg十六烷基S甲基漠化锭溶液中，超声振荡 后，离屯、水洗至无表面活性剂，60°C干燥8h，研磨成细粉，即为表面活性剂改性凹±CTAB- ATo
[0183] 2菌种活化培养：
[0184] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0185] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0186] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[0187] 3植物酱醇微生物转化：
[0188] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有3g/L植物酱醇及5g/L的表面 活性剂改性凹上CTAB-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
[0189] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖lOg/L，巧樣酸2g/L，巧樣酸铁按0.05g/L，硫 酸儀0.5g/L，憐酸氨二钟0.5g/L，憐酸氨二锭3.5g/L，pH 7.2。
[0190] 添加表面活性剂改性凹±圳48-41'的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸 2，巧樣酸铁锭0.05，硫酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇3，表面活性剂改 性凹±CTAB-AT 5，pH 7.2。
[0191] 为了验证表面活性剂改性凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实 验：
[0192] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10L，巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫 酸儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇3，pH 7.2。
[0193] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，130r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0194] 4.雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[01巧]用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0196] 5比对结果：
[0197] 如表8所示，7化后，添加表面活性剂改性凹±CTAB-AT的微生物转化体系中雄締二 酬AD摩尔生成率为30.22 ±0.79%，是对照组(8.43 ±0.41 % )的3.58倍；120h后，添加表面 活性剂改性凹±CTAB-AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为38.39± 1.32%，是 对照组（12.94 ± 0.19 % )的2.96倍；16化后，添加表面活性剂改性凹±CTAB-AT的微生物转 化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为42.83±0.27%，是对照组（15.97±0.04% )的2.68倍。
[0198] 表8微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率
[0199]
[0200] 实施例9:添加原凹±制备雄締二酬的方法，实验过程如下：
[0201] 1菌种活化培养：
[0202] 将Mycobacterium neoaurum TCCCl 1979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面 培养基上，29°C培养2~4d，用0.5 %的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子， 使种子菌液ODsoo值控制在1.0 ±0.2，在250mLS角瓶中将种子菌液W2%的接种量接种到 SOmL种子液体培养基中，29 °C条件下，220r/min培养36h，测菌体ODsqq值为1.0 ± 0.2得到种 子培养液。
[0203] 其中，斜面培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、硫酸儀0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧 樣酸2、硝酸锭2、碳酸巧10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
[0204] 种子液体培养基成分为(g/L):憐酸氨二钟0.5、巧樣酸铁锭0.05、巧樣酸2、甘油 20、硫酸儀0.5、硝酸锭2、葡萄糖5、碳酸巧10。
[02化]2植物酱醇微生物转化：
[0206] 将活化的种子培养液W7%的接种量转接于装有含有5g/L植物酱醇及5g/L的原凹 上AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
[0207] 其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁按0.05,硫酸儀0.5， 憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,pH 7.2。
[0208] 添加原凹±41'的微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10，巧樣酸2，巧樣酸铁锭0.05， 硫酸儀0.5,憐酸氨二钟0.5,憐酸氨二锭3.5,植物酱醇20,原凹±AT 5，pH 7.2。
[0209] 为了验证原凹±对制备雄締二酬AD的促进效果，同时设立对照组实验：
[0210] 其中，对照组微生物转化体系为(g/L):葡萄糖10,巧樣酸2,巧樣酸铁锭0.05,硫酸 儀0.5，憐酸氨二钟0.5，憐酸氨二锭3.5，植物酱醇5，pH 7.2。
[0211] 将两组微生物转化体系一起放置于29°C环境下，140r/min振荡培养16化得到两组 发酵液。
[0212] 3雄締二酬AD摩尔生成率的检测：
[0213] 用ImL的乙酸乙醋超声萃取发酵液0.化，离屯、（12000 Xg, 2min)，取乙酸乙醋相 0.1 mL于1.5mL邱pendorf管中，自然风干后加 ImL的流动相，离屯、（12000Xg，2min)后进行 HPLC分析。色谱条件:Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为ImL/min，柱溫为 30°C，检测波长为254nm。
[0214] 4比对结果：
[0215] 如表9所示，7化后，添加原凹±AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为 18.34 ± 1.08 %，是对照组(6.49 ± 0.31 % )的2.82倍；12化后，添加原凹±AT的微生物转化 体系中雄締二酬AD摩尔生成率为23.45±0.61 %，是对照组（10.29±0.12%)的2.27倍； 168h后，添加原凹±AT的微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率为25.37±0.77%，是对 照组（15.07±0.15% )的1.68倍。
[0216] 表9微生物转化体系中雄締二酬AD摩尔生成率
[0217]
[0218] W上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施 例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进 等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种雄烯二酮的制备方法，利用分枝杆菌对植物留醇进行微生物转化生成雄烯二 酮，其特征在于:微生物转化体系中添加凹土。2. 根据权利要求1所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述凹土是原凹土或改性 凹土。3. 根据权利要求2所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述改性凹土为酸改性凹 土、硅烷偶联剂改性凹土、碱改性凹土和表面活性剂改性凹土中的一种。4. 根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述酸改性凹土的改性步 骤为:将原凹土加入到酸溶液中，所述酸溶液为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种，超声振荡， 离心水洗至中性，干燥后研磨成细粉。5. 根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述硅烷偶联剂改性凹土 的改性步骤为:将原凹土加入到pH 3.5的醋酸水溶液中，再加入0.1 %的硅烷偶联剂，所述 硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷KH550,超声振荡，离心水洗至无硅烷偶联剂，干燥 后研磨成细粉。6. 根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述碱改性凹土的改性步 骤为:将原凹土加入到碱溶液中，所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，超声振荡，离心水洗 至中性，干燥后研磨成细粉。7. 根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述表面活性剂改性凹土 的改性步骤为:将原凹土加入到含有〇.lg/L的表面活性剂改性溶液中，所述表面活性剂为 十六烷基三甲基溴化铵，超声振荡后，离心水洗至无表面活性剂，干燥后研磨成细粉。8. 根据权利要求1-7中任意所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述凹土的添加 量为0.5~10g/L。9. 根据权利要求8所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述凹土的最适添加量为 1~5g/L〇10. 根据权利要求8所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于:所述微生物转化体系包 括:转化培养基，活化的菌种种子培养液，植物留醇和凹土;其中，所述植物留醇投料量为 0.5~30g/L，所述活化的菌种种子培养液接种量为7 % ;微生物转化条件为:转化温度为29 ~30 °C，摇床转速为120~140r/min，转化时间为120~168h。
【文档编号】C12P33/00GK105861612SQ201610278447
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】王敏, 申雁冰, 刘晶晶, 苏立秋, 郑宇 , 骆健美
【申请人】天津科技大学