°C退火30s，72°C延伸30s，循环30次；72°C终延伸lOmin。反应结束后使用1. 0%琼脂糖 凝胶进行DNA电泳分析。产物经深圳华大基因科技服务有限公司测序，确认与设计完全一 致，置于-20°C保存。
[0023] 使用ZAoJ和化;?公J核酸限制性内切酶对获得的目的基因和原核表达质粒 祀T-32a(+)同时进行双酶切操作。纯化酶切产物后，将目的基因片段与祀T-32a(+)质粒连 接，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌化21 0E3)pLysS或Rosetta中，利用氨节西林鉴 定筛选基因工程阳性菌。在200mL的LB液态培养基中添加IPTG大规模诱导基因工程菌表 达目的蛋白，于4°C下5000r/min离屯、lOmin收集菌体，使用PBS清洗S次后超声波裂解菌 体，12000r/min离屯、15min后收集上清液进行SDS-PAGE，检测目的蛋白表达量。
[0024] 实施例2;获取和纯化人工抗菌肤PR39-R1T。
[00巧]使用肠激酶按下述酶切体系对表达产物进行酶切处理；lOXBuffer10. 0yL dd&O38. 0化，目的蛋白50. 0化，肠激酶2. 0化，置于23°C下20h。
[0026]利用ThermoScientific公司的HisPurNi-NTASpinPurificationKit,通过 镶离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌肤PR39-R1T。按说明书预处理树脂柱后，加入 与化曲-capacitynickel-IMACresin等量的酶切处理过的上清液，置于4°C环境中结合 比后，洗脱蛋白，收集洗脱液进行SDS-PAGE检测，结果可见4. 6-10.OkD之间有明显的蛋 白条带，符合实验设计大小，即为人工抗菌肤PR39-R1T。通过化a壯ord法测定其浓度为 362.50Ug/mL。
[0027] 实施例3;人工抗菌肤PR39-R1T生物活性检测。
[0028] 通过微量稀释法测定人工抗菌肤PR39-R1T对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽抱杆菌、绿脈杆菌、猪链球菌2型和炭痘杆菌的最小抑菌浓度（MIC)和最低杀菌浓度 (MBC)。具体实验步骤如下；将实验菌株制备成106c化/血的菌液，分别加入96孔细胞培养 板内，每孔90yL。使用PBS将人工抗菌肤PR39-R1T溶液分别稀释成40. 0、20. 0、10. 0、8. 0、 6. 0、4. 0、2. 0、1. 0、0. 5yg/mU并加入96孔细胞培养板内，每孔10yL。设置空白对照组仅 含LB液态培养基，条件对照组仅含有实验菌株的菌液，酶切对照组添加有未经肠激酶处理 的目的蛋白溶液和实验菌株的菌液。置于37°C培养箱中过夜，翌日测定每孔的0化。。J直。 可完全抑制细菌生长的最低溶液浓度即为人工抗菌肤PR39-R1T针对该实验菌株的MIC。将 MICW上的组按1:100比例接种LB液态培养基，并取其中100化均匀涂布在LB固态培养 基上，置于37°C培养箱中1化后，进行菌落计数。固态培养基上少于5个菌落的最高溶液浓 度即为人工抗菌肤PR39-R1T针对该实验菌株的MBC。人工抗菌肤PR39-R1T对W大肠杆菌 为代表的革兰氏阴性菌、W猪链球菌2型为代表的革兰氏阳性菌和目前耐药性最严重的金 黄色葡萄球菌均具有生物活性，说明其具有广谱抗菌活性。
[0029] 各实验菌株的MIC和MBC单位；yg/mL
未经肠激酶处理的目的蛋白针对所有实验菌株不能表现出生物活性。
[0030] 实施例4 ;人工抗菌肤PR39-R1T溶血活性检测。
[0031] 对健康小鼠进行眼球采血，将获得的小鼠血液与阿氏液等比例混合，200化/min离 屯、5min后弃去上清液。使用10倍体积的生理盐水洗漆小鼠红细胞3次后，使用生理盐水 将其稀释成2%浓度的红细胞悬液。将人工抗菌肤PR39-R1T制备成不同浓度的稀释液，与 红细胞悬液混合，37 °C解育30min后，200化/min离屯、5min，测定上清液于540皿的吸收值。 使用生理盐水作为阴性对照组，使用1%TritonX-100作为阳性对照组，按照540皿吸收值 计算人工抗菌肤溶血率。人工抗菌肤PR39-R1T浓度为300yg/mL时，溶血率仅为10. 31%， 推测其针对小鼠红细胞的肥W值应远远超出300yg/mU而人工抗菌肤PR39-R1T发挥生物 活性的浓度仅需1. (T10. 0yg/mU由此可W认为其不表现溶血活性。
[0032] 上述实施例为本发明较佳的实施方法，但本发明的实施方法并不受上述实施例的 限制，其他任何未背离本发明精神实质与原理的改变、修饰、替代、组合、简化均为等效的置 换方法，包含在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种人工抗菌肽PR39-R1T，其特征在于，其是如序列表中SEQ ID No. 1所示氨基酸 序列的多肽，或由SEQ ID No. 1所示氨基酸序列经过环化、N末端和/或C末端修饰、L-型 氨基酸和D-型氨基酸互相转变、序列末端缺失中的至少一种处理而得到的功能等同的多 肽。2. -种多核苷酸，其特征在于，其是如序列表中SEQ ID No. 2所示核苷酸序列或与之互 补的多核苷酸，可编码SEQ ID No. 1所示氨基酸序列。3. -种载体，其特征在于，具备权利要求2所述的多核苷酸。4. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，具备权利要求3所述的载体。5. 权利要求1所述的人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法，包括如下步骤： (1) 根据GenBank中的抗菌肽PR-39和Ranatuerin-IT成熟肽氨基酸序列，人工设计出 本发明人工抗菌肽PR39-R1T的氨基酸序列SEQ ID No. 1，之后采用大肠杆菌偏好性密码子 设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶识别位点，形成目 的基因序列SEQ ID No. 2 ; (2) 采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因，设计两两互补的6条PCR引物，通 过多步PCR获得的目的基因； (3) 将获得的目的基因与原核表达质粒pET-32a(+)连接，构建原核表达载体，并转化 至大肠杆菌BL21或Rosetta中，筛选基因工程阳性菌； (4) 添加IPTG诱导基因工程菌表达，超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE，检测蛋白表达 量； (5) 使用肠激酶酶切处理表达产物后，通过镍离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌 肽 PR39-R1T。6. 根据权利要求5所述的人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法，其特征在于，所述目的基 因序列如SEQ ID No. 2所示。7. 根据权利要求5所述的人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法，其特征在于，所述6条PCR 引物序列如SEQ ID No. 3~8所示。8. 权利要求1所述的人工抗菌肽PR39-R1T的应用，其特征在于，应用于制备抗菌剂。9. 权利要求8所述的人工抗菌肽PR39-R1T应用于制备抗菌剂，其特征在于，针对大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、猪链球菌2型和炭疽杆菌。
【专利摘要】本发明涉及人工抗菌肽PR39-R1T的制备方法及其应用。本发明人工设计出人工抗菌肽PR39-R1T的氨基酸序列，并采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列；采用重叠区扩增基因拼接法合成目的基因，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中诱导表达；表达产物经肠激酶酶切处理和镍离子亲和层析纯化后，即可获得本发明人工抗菌肽PR39-R1T。该抗菌肽具备较强的广谱抗菌活性，可抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，同时不具有溶血活性。因此，其可作为一类新型抗菌药物，在食品防腐、疾病治疗等方面具有良好的应用前景，极具开发潜力。本发明制备方法表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，稳定性好，可应用于规模化生产。
【IPC分类】C12N15/70, A61P31/04, C07K14/00, C12N15/11, A61K38/16, C12N1/21
【公开号】CN104987367
【申请号】CN201510499798
【发明人】刘诚
【申请人】刘诚
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年8月16日