一种牛蛙缓激肽及其编码的核酸和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种牛娃（Rana catesbeiana缓激肽及其编码的核酸和应用，属于生 物医学技术领域。
【背景技术】
[0002] 缓激肽是激肽释放酶--激肽系统中的一种主要的激肽类物质，既可引起病理生 理反应，又可发挥生理保护作用，参与多系统器官的功能调节和病理生理过程，如心血管、 肾脏、中枢神经系统的调节，葡萄糖代谢、细胞增殖、平滑肌收缩、炎症、疼痛、休克和组织 损伤过程等。近年来很多试验通过动物模型和人体，以及分子生物学，对缓激肽研宄日益 深入，尤其在心血管系统中。已证实血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管紧张素 AT，受体诘抗剂（ARB)在高血压病、心肌梗死、 心力衰竭中对心脏具有强大的保护作用，其机制一方面通过作用于肾素一血管紧张素系 统（RAS)，另一方面即近来研宄的热点，还通过作用于激肽-缓激肽系统而发挥作用，其中 ACEI主要通过减少缓激肽的降解，而ARB则主要通过影响心肌细胞缓激肽受体数目的上调 发挥作用。
[0003] 目前已经从蛙属（Rana)和铃蟾属（Bombina)两栖类动物皮肤中得到了 10多种缓 激肽（bradykinin)，缓激肽参与许多生理和病理反应，比如血管舒张、血管渗透性、血压控 制、疼痛产生和炎症反应等，除此之外缓激肽还有对血管或非血管平滑肌的强效收缩或舒 张效应。近年来很多试验通过动物模型和人体，以及分子生物学方法，对缓激肽生物活性研 宄日益深入，尤其在心血管系统中的生理作用。
[0004] 我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研宄主要 集中于生物碱等有机小分子，对皮肤活性蛋白肽类物质的研宄还较少。牛蛙，原产于北美 洲，1959年从古巴、日本引进我国内陆。目前我国主要靠养殖生产，全国各地均产，主要集中 于湖北、湖南、江西、新疆、四川等地。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种牛蛙缓激肽及其编码的核酸和 应用，用于开发心脑血管系统药物的牛蛙缓激肽基因及其技术。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种牛蛙缓激肽，所述牛蛙缓 激肽由9个氨基酸组成，分子量为1043. 2道尔顿，等电点为9. 50,其氨基酸序列为SEQ ID NO. 4 ：Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg〇
[0007] 所述牛蛙缓激肽的编码基因，其序列为SEQ ID NO. I所示序列的第156-183位核 苷酸。
[0008] -种牛蛙缓激肽，所述牛蛙缓激肽由16个氨基酸组成，分子量为1759. 0道尔顿， 等电点为 10. 35,其氨基酸序列为 SEQ ID NO. 6 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg He Ala Pro Ala Ser Tyr Leu〇
[0009] 所述牛蛙缓激肽的编码基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示序列的第156-204位核 苷酸，
[0010] 所述的牛蛙缓激肽，在制备心血管系统药物和促进肠道收缩药物中的应用。
[0011] 本发明的有益效果：由牛蛙缓激肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的牛蛙缓 激肽RR9和RL16具有很强的促进大鼠离体回肠肌收缩的活性，该牛蛙缓激肽具有结构简 单、人工合成方便的特点。，因此可以作为心脑血管药物以及促进肠道收缩药物的应用。 Kininogen-ICa的发现不仅为缓激肽家族增加了新成员，也为缓激肽结构与组成的研宄提 供了有益的参考。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明牛娃缓激肽kininogen-ICa RR9和RL16对离体回肠肌收缩能力的 检测（A. RR9 B. RL16 C. 0. 1%。乙酰胆碱对照组D.生理盐水对照组）。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0014] 本发明的牛蛙缓激肽，所述牛蛙缓激肽由9个氨基酸组成，分子量为1043. 2道尔 顿，等电点为9. 50,其氨基酸序列为SEQ ID NO. 4 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg0
[0015] 所述牛蛙缓激肽的编码基因，其序列为SEQ ID NO. I所示序列的第156-183位核 苷酸。
[0016] -种牛蛙缓激肽，所述牛蛙缓激肽由16个氨基酸组成，分子量为1759. 0道尔顿， 等电点为 10. 35,其氨基酸序列为 SEQ ID NO. 6 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg lie Ala Pro Ala Ser Tyr Leu0
[0017] 所述牛蛙缓激肽的编码基因，其序列为SEQ ID NO. I所示序列的第156-204位核 苷酸，
[0018] 所述的牛蛙缓激肽，在制备心血管系统药物和促进肠道收缩药物中的应用。
[0019] 牛蛙缓激肽，是从牛蛙皮肤cDNA文库中筛选得到的一种由牛蛙缓激肽基因编码 的生物活性肽。它是由16个氨基酸（RL16)和9个氨基酸（RR9)组成的多肽片段，分子量分 别为1759. 0道尔顿和1043. 2道尔顿，等电点为9. 50和10. 35。多肽氨基酸全序列一级结 构为：精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨 酸-异亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-亮氨酸（RPPGCNPFRIAPASYL); 精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-异 亮氨酸（RPPGCNPFR)。
[0020] 本发明牛蛙缓激肽的制备过程，包括以下步骤：
[0021] 1)牛蛙缓激肽基因的克隆
[0022] 牛蛙皮肤总RNA的提取，mRNA的纯化，cDNA第一链的合成及cDNA文库构建，设 计引物利用PCR方法筛选牛蛙丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。扩增引物长度为20个核苷酸， 上游引物为 5 ' -ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3 '，下游引物为 CL0NTECH 公司 SMART? cDNA Library Construction Kit 中的 3 ' PCR Primer 引物，其序列为 5 ' -ATTCTAGAGGC CGAGGCGGCC-3 '。所获阳性克隆进行核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码牛蛙丝氨酸 蛋白酶抑制剂的基因由458个核苷酸组成（SEQ ID NO. I)，从5 '端至3 '序列为：
[0023]
[0024] 编码牛蛙缓激肽的为第156-183,156-204位核苷酸片段，其氨基酸序列为Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg和Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg I Ie Ala Pro Ala Ser Tyr Leu。（见 SEQ ID NO. 3-6)
[0025] 2)牛蛙缓激肽的合成
[0026] 根据编码牛蛙缓激肽的基因推断牛蛙缓激肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪 APEX396合成其全序列（见SEQ ID NO. 2)。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用 高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测 定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0027] 实施例1 :牛蛙缓激肽基因克隆
[0028] I .牛蛙皮肤总RNA提取
[0029] A.活体牛蛙用双蒸水清洗干净，灭菌针从牛蛙的延髓腔毁髓，取50~IOOmg牛蛙 皮肤组织放入干烤过的研钵中，加入ImL TRIZOL Reagent(Invitrogen公司产品）迅速在 冰水浴中研磨。
[0030] B.充分混匀后，移入I. 5mL离心管中（DEPC管）15~30°C放置5min，加入等体积 氯仿旋涡混匀158,4°〇12000\8离心151^11。
[0031] (1取上清加入50(^1^异丙醇，15~30°〇放置51^11，旋涡158混匀，4°〇12000\ 8 离心10min。弃上清，加入ImL 75 %乙醇漂洗沉淀，7500 Xg离心5min，重复1次。超净工 作台中干燥90s，用30 μ L RNase-free water溶解，即得到牛娃皮肤组织总RNA0
[0032] II .牛蛙皮肤mRNA的分离纯化，采用操作步骤按照德国QIAGEN公司的 Oligotex ? mRNA Mini Kit试剂盒说明书进行。
[0033] III.牛蛙皮肤cDNA文库的构建
[0034] 采用 CLONTECH 公司的 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit 文库 构建试剂盒。
[0035] A. cDNA第一链合成（mRNA反转录）
[0036] 以纯化的mRNA为模板，利用cDNA构建试剂盒提供的CDS III/3 ^ Primer :5， -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-lN-3 ; (N = A, C, G or T ；N-1 = A,G or C)和 SMARTTM IV oligonucleotide ：5 ; -AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GT GG CC ATTACG GCCGGG-3^，在PowerScript?逆转录酶的作用下，合成cDNA第一链。反应体系为IOyL: IyL SMART IV Oligonucleotide，IyL CDS III 引物混匀，72°C2min，冰浴 2min。离心 后分别加入以下试剂：2. OyL 5X First-Stand Buffer、1.0 yL DTT(20mM)、LOyL dNTP Mix (IOmM)、1.0 yL PowerScript 逆转录酶，反应总体积为 10.0 yL。42°C 反应 60min，冰浴 放置5min，终止第一链合成。-20°C保存。
[0037] B. LD-PCR方法扩增第二链
[0038] L 95 °C 预热 PCR 仪。
[0039] 2.以第一链cDNA为模板，向反应管中依次加入以下试剂：2 μ L cDNA第一链合成 产物、80yL 去离子水、IOyL 10*Advantage 2PCR 缓冲液、2yL 50*dNTP 混合物、2yL 5' PCR 引物、2yL CDS 111/3 ' PCR 引物以及 2yL 50*Advantage 2Polymerase Mix，反应体 系为100 μ L。
[0040] 3.在PCR仪中按以下程序扩增：
[0041] ① 95 XM 分钟；
[0042] ②24个循环：95 °C 15秒钟，68 °C复性