核酸转移载体、含有它们的组合物及其应用的制作方法

专利名称：核酸转移载体、含有它们的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的载体及其转移核酸的应用。具体讲，本发明涉及能够引导核酸至特定细胞或细胞腔室的新载体。
核酸转移是主要生物技术应用的一项基础技术，核酸转移效率的提高构成了这些应用发展的很重要的赌注。核酸转移效率取决于多种因素，其中包括核酸到达靶细胞的能力、其跨越浆膜的性能及其被转运至细胞核中的性能。
核酸转移效率的一个主要障碍是遗传信息常不能导向目标靶器官或效果差。另外，一旦核酸穿透到靶细胞中，其还应该被导向细胞核以在其中表达。而在分化或静息细胞中转移核酸时，细胞核被限于核膜内，这又构成了核酸通过的另一屏障。
用作载体的重组病毒具有保证核酸进入细胞核的成熟有效的机制。但病毒载体具有病毒固有的一些缺点，遗憾的是无法完全排除它们。因而另一策略就是要么转移裸DNA、要么使用能够促进DNA在真核细胞中转移的非病毒试剂。但这些非病毒载体不具有对亚细胞或核的靶向信号。因此，裸DNA或与非病毒试剂一起在胞浆中向细胞核的转移是一个效率很低的阶段(Zabner等，1995)。
已进行了附加靶向信号的各种尝试。具体讲，在一种反义寡核苷酸靶向转运策略中寡核苷酸上共价连接了靶向肽片段[Eritja等，含核转运信号序列的特定肽-寡核苷酸杂合体的合成，四面体(Tetrahedron)，Vol．47，No．24，4113-4120页，1991]。这样形成的复合物作为内源基因表达之潜在抑制剂的良好候选物。
在专利申请WO95／31557中还公开了含有与DNA序列以静电作用偶联的合成多肽的转染载体，所述多肽由一个碱性氨基酸多聚链、一个NLS肽和一个连接NLS肽和多聚链并可避免立体相互作用的铰链区构成。但这类结构具有稳定性问题，因为DNA和靶的信号间起作用的作用力是静电性质的。
另外专利申请WO 95／34664中公开了核酸-特异性靶向肽的嵌合体，两者之间的键是化学性质的。但这种方法已过时，特别因为酶步骤难以控制，而且不能产生大量的核酸。
最后，已证明可能借助于环丙烷吡咯并吲哚将NLS序列(“核定位信号”)连在质粒DNA上(自然生物技术(Nature Biotechno1ogy)，Vol．16，80-85页，1998年1月)。还观察到目标基因转录的完全抑制现象，这是由于几百个NLS序列偶然连在了一个质粒上。其他人提出了解决这一问题的一种方法，即将NLS序列连在DNA的线性片段上，然后将这些修饰的片段与其他未修饰片段偶联。但这一技术具有前述的不能通过至少一个酶步骤的缺点。
因此，迄今提出的所有方法不能满意地解决与双链DNA靶向转移相关的困难。
本发明提出了对这些问题的有利的方案。具体讲，本发明提供了与靶向信号缀合并能够与存在于双链DNA分子中的特定序列形成三螺旋的寡核苷酸。
这种载体具有由靶向信号带来的能够引导双链DNA至特定的细胞或细胞腔室中的优点，而遗传表达不被抑制。申请人证明，由于位点特异性的稳定三螺旋的形成，可能以位点特异性方式在双链DNA上连接靶向信号。结果，可以在待转基因表达盒之外固定靶向信号。申请人从而证明尽管有DNA的化学修饰，细胞中遗传表达不会被抑制。另外，三螺旋的存在作为在DNA上连接靶向信号的工具是特别有利的，因为这可以保留适于转染的DNA大小。
所获载体还有靶向信号与双链DNA连接很稳定的优点，特别是当易于形成三螺旋的寡核苷酸在烷化剂存在下被修饰时。
本发明的另一个优点是可以在连接待转移DNA和靶向信号时，同时控制后者的数量和性质。实际上可以通过向所述双链DNA分子引入对形成三螺旋有利的适当数目的特异序列来控制连接在每个双链DNA分子上的靶向信号的数目。同样，可以在同一双链DNA分子上引入与不同靶向信号(细胞内和／或细胞外)连接的几种寡核苷酸，在此情形下也可能预先确定各自的比例。此外，这些不同的靶向信号可以与双链DNA分子以或高或低的稳定性连接，这取决于三螺旋的形成中有或无共价键(即有无使用烷化剂)。
最后，所获功能性三螺旋只来自化学转化步骤，因而可以以简单、可重复的方式获得很大的量，特别是工业规模。
因此，本发明的第一个主题涉及一种能靶向特定细胞和／或细胞腔室的转染用载体。具体讲，本发明的载体包含一个双链DNA分子和至少一个与靶向信号偶联并能够通过杂交与所述双链DNA分子中特定序列形成三螺旋的寡核苷酸。
本发明中的“双链DNA”指双链脱氧核糖核苷酸，其来源于人、动物、植物、细菌、病毒等。它可以通过本领域技术人员已知的任何技术获得，特别是通过文库筛选、文库筛选所获序列的化学或酶合成。它还可以经化学或酶法修饰。
该双链DNA可以呈线性或环状。对于后一种情况，双链DNA可以是超级缠绕状态或松弛状态。优选DNA分子是环形的并呈超级缠绕构象。
双链DNA还可以带有一个在靶细胞中有或无功能的复制起点、一个或多个标志基因、转录或复制调节序列、治疗性目标基因、经修饰或否的反义序列、与其他细胞成分结合的区域等。优选双链DNA包含一个表达盒，其由一个或多个在靶细胞中有活性的启动子和一个转录终止子控制下的一个或多个目标基因构成。
本发明的“目标基因表达盒”指可被插入在载体的特定限制酶位点的DNA片段。该DNA片段包含编码目标RNA或多肽的核酸序列，另外还含有所述序列表达所需的序列(增强子、启动子、多腺苷酸化序列等)。设计该表达盒和限制位点以保证该表达盒以适于转录和翻译的方式插入在读框中。
所述DNA分子还可以是带有一个或多个治疗性目标基因的质粒或附加体。例如可以举出专利申请WO 96／26270和WO 97／10343(并入本文作为参考)中描述的质粒。
在本发明中，关于“有治疗意义的基因”尤其应该理解为任何具有治疗作用的蛋白质产品的编码基因。如此编码的蛋白质产品可以是一种蛋白质、肽等。这种蛋白质产品对靶细胞可以是同源的(即当靶细胞不存在任何病理性问题时，在该细胞中正常表达的产品)。在这种情况下，蛋白质的表达例如能够克服在该细胞中表达不充分或因修饰失活或低活性的蛋白质的表达，或超量表达所述蛋白质。治疗基因还可以编码细胞蛋白质的突变体，其稳定性提高、活性改变等。蛋白质产品对靶细胞还可以是异源的。在这种情况下，表达的蛋白质例如可以补足或提供在该细胞中缺失的活性，使它们能够抵抗疾病，或刺激免疫应答。
在本发明有治疗意义的产品中，更具体地可列举酶、血液衍生物、激素、淋巴因子[白介素、干扰素、TNF等(FR92／03120)]、生长因子、神经递质或它们的前体或合成酶、营养因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP／多效因子等)、肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(minidystrophine)(FR91／11947)，与先天性粘液稠厚症相关的CFTR蛋白质、肿瘤抑制基因[p53，Rb，Rapl A，DCC，k-rev等(FR93／04745)]、凝血相关因子的编码基因(因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ)、参与DNA修复的基因、自杀基因(胸腺嘧啶核苷激酶、胞嘧啶脱胺酶)、血红蛋白基因或其他转运蛋白的基因、参与脂质代谢的蛋白选自载脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、B、C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、F、G、H、J和apo(a)的载脂蛋白类的相应基因、代谢酶如像脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、7-α-胆固醇羟化酶、磷脂酸磷酸酶，或脂质转移蛋白如胆固醇酯转移蛋白和磷脂转移蛋白、HDL结合蛋白质或例如选自LDL受体、乳靡微粒-遗余物受体和清除剂受体等的受体。
有治疗意义的核酸还可以是这样一种基因或一种反义序列，它们在靶细胞中的表达能够控制基因表达或细胞mRNA的转录。根据专利EP140 308中描述的技术，这样的序列例如可以在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，并因此阻断它们转译成蛋白质。治疗基因还包括核酶编码序列，这些核酶能够选择性地破坏靶RNA(EP 321 201)，或包括编码单链细胞内抗体如ScFv的序列。
如前面所指出的，脱氧核糖核酸还可以含有一个或多个编码抗原性肽的基因，这种肽在人体或动物中能够造成免疫应答。在这种特定实施方式中，本发明因此使得有可能制备用于人体或动物的疫苗或进行免疫治疗，尤其是用于抗微生物、病毒或癌。特别涉及对E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP 185 573)、伪狂犬病病毒、“合包体形成病毒”、流感病毒、巨细胞病毒(CMV)或其他病毒特异的、或对肿瘤特异的抗原性肽(EP 259 212)。
优选地，脱氧核糖核酸还含有能够使有治疗意义的基因和／或抗原肽编码基因在细胞或所希望的器官中表达的序列。可以涉及天然负责所考虑的基因表达的序列，只要这些序列在感染的细胞中能够起作用。还涉及不同来源的序列(负责其他蛋白质的表达，或甚至是合成的)。具体地，可以涉及真核细胞或病毒基因的启动子序列。例如，可以涉及来自人们希望感染的细胞基因组的启动子序列。同样地，可以涉及来自病毒基因组的启动子序列。为此，例如可以列举基因E1A、MLP、CMV、RSV等的启动子。另外，这些表达序列可以通过加入活化序列、调节序列等进行修饰。也可以涉及可诱导的或可抑制的启动子。
三螺旋相当于经修饰或否的寡核苷酸与双链DNA通过第三条链的碱基和双螺旋区域的碱基间所谓的“de Hoogsteen”氢键的结合。这种配对发生在双螺旋的大沟纹中并对所述序列是特异性的[Frank-Kamenetski，M．D．，DNA三螺旋结构，Ann．Rev．Biochem．，1995，64，65-95页]。双螺旋的特异性序列特别可以是一种全嘌呤-全嘧啶序列。根据第三条链的碱基的性质将三螺旋分为两类[Sun，J．和C．Hélène，寡核苷酸引导的三螺旋形成，Curr．Opin．Struct．Biol．1993，3，345-356页]嘌呤碱基可获得C-G*G和T-A*A的配对，嘧啶碱基可获得C-G*C+和T-A*T的配对(符号*相当于与第三条链的配对)。
已通过许多NMR(核磁共振)、杂交温度或抗核酶保护的研究从物理化学角度表征了这些结构，从而得以确定它们的特性和稳定化条件。对嘌呤第三链的三螺旋，该第三链与DNA的嘌呤链是反平行的，三螺旋的形成很大程度上取决于二价离子的浓度诸如Mg2+等的离子可以稳定与第三链形成的这种结构。对于全嘧啶第三链的三螺旋，该第三链与嘌呤链是平行的，三螺旋的形成取决于pH低于6的酸性pH可以使胞嘧啶质子化并形成稳定C-G*C+三联体的额外氢链。还存在“混合”三螺旋，其第三条链带有嘌呤和嘧啶碱基。这种情况下，第三条链的方向取决于全嘌呤区的碱基序列。
本发明所用的寡核苷酸是直接与双链DNA杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以含有以下碱基-胸腺嘧啶(T)，它能与双链DNA的二联体A．T形成三联体(Rajagopal等，Biochem 28(1989)7859)，-腺嘌呤(A)，它能与双链DNA的二联体A．T形成三联体，-鸟嘌呤(G)，它能与双链DNA的二联体G．C形成三联体，-质子化胞嘧啶(C+)，它能与双链DNA的二联体G．C形成三联体，-尿嘧啶(U)，它能与碱基对A．U或A．T形成三联体。
为了通过杂交形成三螺旋，寡核苷酸与DNA上存在的特定序列互补是很重要的。因此，为了获得最好的结合和最好的选择性，对于本发明的载体使用一种寡核苷酸和完全互补的特异序列。特别可能使用聚一CTT寡核苷酸和聚-GAA特异性序列。例如可以使用如下序列的寡核苷酸5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(GAGG(CTT)7，SEQ ID N°1)，其中碱基GAGG不形成三螺旋但其可以将偶联臂与寡核苷酸隔开。还可以举出序列(CTT)7(SEQ ID No．2)。这些寡核苷酸能够与带有互补基元(GAA)的特异性序列形成三螺旋，特别是含有7、14或17个GAA基元的区域。另一个特异性目标序列是如下序列5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’(SEQ ID No．3)。该序列与下列寡核苷酸形成三螺旋5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID N°4)或5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3’(SEQ ID N°5)。
此时寡核苷酸以反向平行方向结合在聚嘌呤链上。这些三螺旋只在Mg2+存在下稳定，这如前所述(Vasquez等，生物化学(Biochemistry)，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，科学(Science)，1991，251，1360-1363)。
特异性序列可以是双链DNA中天然存在的一种序列，或者人工插入其中的天然来源的或合成的序列。使用能与双链DNA上天然存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸是特别有利的。实际上，这样就可以从未经修饰的质粒、特别是pUC、pBR322、pSV等类型的商业质粒来有利地获得本发明的载体。在双链DNA中存在的天然全嘌呤-全嘧啶序列中，可以举出含存在于大肠杆菌复制起点中的5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’(SEQ ID No．6)之全部或部分的序列。此时形成三螺旋的寡核苷酸具有如下序列5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3’(SEQ ID No．7)并交替地与双螺旋的两条链结合，如Beal和Dervan(J．Am．Chem．Soc．1992，114，4976-4982)和Jayasena和Johnston(核酸研究(Nucleir Aeids Res．)，1992，20，5279-5288)所述。还可以举出质粒pBR322 β-内酰胺酶基因的序列5’-GAAAAAGGAAGAG-3’(SEQ ID No．8)(Duval-Valentin等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1992，89，504-508)。另一序列是存在于具有条件性复制起点的质粒如pCOR的γ复制起点中的AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID No．9)。
虽然优选完全互补的序列，但应认识到可以容忍寡核苷酸序列和DNA上所存在序列间一定的错配，只要不导致太大的亲和力损失。可以举出大肠杆菌β-内酰胺酶基因中存在的序列5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’(SEQ ID No．10)。此时打断聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可被第三条链的鸟嘌呤识别，形成三联体ATG，当被夹在两个三联体TAT之间时是稳定的(kiessling等，生物化学，1992，31，2829-2834)。
所用的寡核苷酸可以是天然的(由天然碱基组成，未经修饰)或是经化学修饰的。更具体地讲，寡核苷酸可以带有一些有利的化学修饰，以提高其抗性、对抗核酶的保护、其对特异序列的亲和性或带来其他额外的特性(J．Goodchild，寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的缀合其合成和特性的综述，生物缀合物化学(Bioconjugate Chemistry)，Vol．1，No．3，1990，165-187页)。
在本发明中，寡核苷酸还包括已进行了骨架修饰的任何核苷的链。在可能的修饰中可以举出，能够与DNA形成三螺旋的硫代磷酸酯寡核苷酸(Xodo等，核酸研究，1994，22，3322-3330)，及具有甲缩醛或甲基膦酸酯骨架的寡核苷酸(Matteucci等，J．Am．Chem．Soc．，1991，113，7767-7768)。还可以使用用核苷酸的α-端基异构体合成的寡核苷酸，它也与DNA形成三螺旋(Le Doan等，核酸研究，1987，15，7749-7760)。另一种骨架修饰是氨基磷酸酯键。例如可以举出Gryaznov和Chen描述的核苷酸间N3’-P5’氨基磷酸酯键，这样给出了与DNA形成特别稳定的三螺旋的寡核苷酸(J．Am．Chem．Soc．，1994，116，3143-3144)。对于骨架的其他修饰，还可以提到使用核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖、磷酸三酯等(Sun和Hélène，Curr．Opinion Struct．Biol．，116，3143-3144)。含磷骨架最终可以被聚酰胺骨架代替，如PNA中(肽核酸)，它也可以形成三螺旋(Nielsen等，科学，1991，254，1497-1500；Kim等，J．Am．Chem．Soc．，1993，115，6477-6481)，或被基于胍的骨架所替代，如在DNG中(脱氧核糖核胍，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，92，6097-6101)，DNA的聚阳离子类似物，它们也形成三螺旋。
第三条链的胸腺嘧啶还可以被5-溴尿嘧啶替代，从而提高寡核苷酸对DNA的亲和力(Povsic和Dervan，J．Am．Chem．Soc．，1989，111，3059-3061)。第三条链还可以含有非天然碱基，其中可举出7-脱氮-2’-脱氧黄苷(Milligan等，核酸研究，1993，21，327-333)、1-(2-脱氧-b-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan，J．Am．Chem．Soc．，1992，114，1470-1478)、8-氧代腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2’-O-甲基-假异胞苷或本领域已知的任何其他修饰(见Sun和Hélène的综述，Curr．OpinionStruct．Biol．，1993，3，345-356)。
另一种类型的寡核苷酸修饰更特异地涉及对寡核苷酸和特异序列间的相互作用和／或亲和性。具体讲，一种特别有利的修饰是在寡核苷酸上连接烷化剂。这种连接可以是化学的，或通过一种光活性功能团进行光化学连接。有利的烷化剂特别有可光活化的烷化剂，例如补骨脂素。在光作用下，它们在DNA的嘧啶碱基上形成共价键。当这些分子被插入在双链DNA片段中的序列5’ApT-3’或5’-TpA-3’中时，它们形成与双链的连接。这种由光诱发的连接反应可发生在质粒的特定位点上。
如前文已强调过的，本发明的一个优点是由于通过烷化剂形成共价键，因而可以在寡核苷酸和双链DNA的特异序列之间形成很稳定的位点特异性的三螺旋。
本发明方法中所用的寡核苷酸的长度为至少3个碱基，优选5-30个碱基。优选使用10-30个碱基长度的寡核苷酸。当然本领域技术人员可以根据所寻求的选择性和相互作用的稳定性具体调节该长度。
本发明的寡核苷酸可通过任何已知技术合成。具体讲，它们可利用核酸合成仪来制备。也可以使用本领域技术人员已知的任何其他方法。
本发明中，“靶向信号”指各种性质的靶向分子。在大多数情况下涉及已知的靶向肽。当进行基因治疗基因的非病毒转移时，它们可被用于与细胞外基质的成分、与浆膜受体相作用，用于靶向细胞内腔室或用于改善DNA的细胞内路径。
这些靶向信号包括例如生长因子(EGF、PDGF、TGFb、NGF、IGFI、FGF)、细胞因子(IL-1、IL-2、TNF、干扰素、CSF)、激素(胰岛素、生长激素、催乳素、胰高血糖素、甲状腺激素、类固醇激素)、识别凝集素的糖、免疫球蛋白、ScFv、转铁蛋白、脂蛋白、维生素如维生素B12、肽激素或神经肽(速激肽、神经降压素、VIP、内皮素、CGRP、CCK等)、或被整联蛋白识别的任何基元，例如RGD肽，或由细胞膜非固有的其他蛋白识别的基元。
可以使用完整蛋白、或来自这些蛋白的肽序列、或结合其受体并经“噬菌体展示”技术或组合合成获得的肽。
还可以考虑细胞内靶向信号。已鉴别出了许多由不同氨基酸组成的核定位信号序列(NLS)，使得可以靶向于参与蛋白或核酸核转运的不同蛋白。这些序列中可特别指出短序列(例如SV40 T抗原的NLS(PKKKRKV，SEQ ID No．11))、二分序列(含有两个核转运必需结构域的核质蛋白(nucleoplasmine)的NLSKRPAATKKAGQAKKKKLDK，SEQ ID No．12)、或hnRNPA1蛋白的M9序列(NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY，SEQ ID No．13)。带有这些NLS序列的蛋白与特异性受体结合，如输入蛋白(importine)或核周蛋白(karyopherine)家族的受体。这些序列的作用是引导DNA至核内，在其中DNA立即就可被转录机器所利用，并可以表达。
“混合”靶向信号，即可以同时用于细胞外和细胞内靶向的信号，也在本发明的范围内。例如可以指出靶向凝集素的糖，所述凝集素处于细胞膜上也存在于核孔中。因此这些糖的靶向作用不仅涉及细胞外靶向也涉及核输入。
另一些信号参与靶向线粒体(如大鼠鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的T-末端部分)或在内质网中的定位。最后，一些信号可以进行核保留或内质网中的保留(如KDEL序列)。
本发明的靶向信号可以有利地特异性引导双链DNA进入某些细胞或某些细胞腔室。例如，本发明的靶向信号可以靶向于细胞表面的受体或配体，特别是该细胞表面或邻近的细胞外基质上特有的胰岛素、转铁蛋白、叶酸、或任何其他生长因子、细胞因子或维生素或多糖的受体。
寡核苷酸-靶向信号嵌合体的合成以固相或液相进行，并考虑到寡核苷酸和靶向信号差异很大的化学稳定性特征[Erijita，R等，含核转运信号序列的特定肽-寡核苷酸杂合体的合成，四面体，1991，47(24)，4113-4120页]。对于液相合成，可以设想一步偶连例如可以用带有二硫键、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧、溴代氰或醛的基团合成靶向信号，并与经末端基团硫醇、胺或羧基在3’或5’位修饰的寡核苷酸偶连。通过在寡核苷酸和靶向信号之间建立二硫键、硫醚键、酯键、酰胺或胺发生这些偶连。也可以使用本领域技术人员已知的任何其它方法，如用双功能偶联反应物。
本发明的另一主题是含有如上所定义载体的组合物。
最好，本发明的载体还可以与已知用于转移DNA的一种或多种试剂结合。可以举出具有有利特性的阳离子脂类。这些载体由与核酸作用的阳离子极性部分、与能够保护生成的复合物不受外部环境影响的疏水脂部分构成。作为实例可以列举单阳离子脂类(DOTMALipofectin_)、某些阳离子去污剂(DDAB)、脂多胺，特别是双十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)或棕榈酰基磷脂酰乙醇胺的5-羧基精胺基酰胺(DPPES)，在专利申请EP 394 111中描述过它的制备方法。另一类有益的脂多胺家族以在专利申请WO97／18185(作为参考文献列于本文)中列出的化合物为代表。已开发出许多其他阳离子脂类试剂，可与本发明的载体一起使用。
在已开发的合成转染试剂中，聚赖氨酸和DEAE葡聚糖类型的阳离子聚合物也是有利的。还可能使用聚乙烯亚胺(PEI)聚合物和聚丙烯亚胺(PPI)聚合物，它们可以在市场上购得也可以按专利申请WO96／02655中描述的方法制备。
一般而言，已知用于核酸转染的任何合成试剂都可与本发明的载体结合。
本发明的组合物还可以含有能够与本发明载体／转染试剂复合物结合并能够改善其转染能力的添加剂。在另一实施方案中，本发明因而涉及含有如上定义的载体、一种或多种如上所述转染试剂和一种或多种能够与本发明载体／转染试剂复合物结合并能够改善其转染能力的添加剂的组合物。这种类型添加剂(如脂类、肽或蛋白)可以有利地提高化合物的转染能力。
在这种选择中，本发明的组合物可以含有一种或多种中性脂作为添加剂，使用这样一些组合物是特别有利的。申请人已证明加入一种中性脂能够改善核脂颗粒的生成，还通过使膜失稳定有利于该颗粒的细胞穿透。
更优选地，在本发明范围内使用的中性脂是具有两个脂肪链的脂类。特别有利地，使用在生理条件下为两性离子或无离子电荷的天然或合成脂类。更具体地，它们可以选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-、二棕榈酰基-、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂(具体如半乳糖脑苷脂)、鞘脂(具体如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂(具体如脱唾液酸GM1和GM2)。
这些不同的脂类可采用本技术领域的技术人员熟知的方法用合成方法，或者从器官(例如脑)或蛋提取的方法得到。具体地，采用有机溶剂的方法可以提取天然脂类(也可参见Lehninger Biochemistry)。
申请人已证明，使用干预或非直接地干预DNA浓集(condensation)的化合物作为添加剂也是特别有利的(WO96／25508)。在本发明组合物中，这样一种化合物的存在，能够降低转移化合物的量，在毒理学方面由此获得有益结果，对转染活性不会带来任何损害。关于干预核酸浓集的化合物，应该定义为直接或非直接地压紧DNA的化合物。更确切地，这种化合物或者直接作用于待转染DNA，或者作用于直接参与核酸浓集作用的其它化合物。优选地，直接作用于DNA。这种直接作用于DNA的试剂特别可以是任何多阳离子物，例如聚赖氨酸。根据一种优选实施方式，这种试剂可以是完全或部分地从鱼精蛋白、组蛋白、核仁蛋白和／或它们的衍生物得到。这种试剂还可以全部或部分地由肽基元(KTPKKAKKP)和／或(ATPAKKAA)构成，基元数可以是2-10。在本发明化合物结构中，这些基元可以连续地或不连续地重复。因此它们可以通过生物化学性质的连接(例如一个或多个氨基酸)隔开，或通过化学性质的连接隔开。
本发明还涉及如上定义的载体在制备用于通过转染DNA至初级细胞或已建细胞系中治疗疾病的药物中的应用。涉及的细胞可以是成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞(神经元、星形胶质细胞、胶质细胞)、肝细胞、造血细胞系(淋巴细胞、CD34、树状细胞等)、上皮细胞等，它们呈分化形式或多潜能形式(前体)。
本发明的载体例如可用于编码蛋白或多肽之DNA的体外、离体或体内转染。
对于体内应用，即用于治疗或用于研究基因调节或疾病动物模型的建立，本发明组合物经配制可以采用局部、皮肤、口、直肠、阴道、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内、皮内、气管内、腹膜内等方式用药。优选地，本发明的药物组合物含有下述药学上可接受的赋形剂，该赋形剂适用于注射剂，尤其是用于在所希望器官中直接注射的注射剂，或适于用局部方式(皮肤和／或粘膜上)用药。特别涉及等渗的无菌溶液，或干的尤其是冻干的组合物，这些组合物可根据情况加入无菌水或生理盐水配制成注射溶液。注射使用的核酸剂量以及用药次数可以根据不同的参数而变化，特别是根据用药方式、涉及的疾病、待表达基因或所进行治疗的时间长短。更具体地对于用药方式，可以在组织或循环通路中直接注射，或者处理培养细胞接着采用注射或移植方法将它们再植入。
本发明还涉及在细胞中转染DNA的方法，其包括以下步骤(1)按前述方法合成寡核苷酸-靶向信号嵌合体，(2)将(1)中合成的嵌合体与双链DNA接触以形成三螺旋，(3)必要时，将(2)中获得载体与一种或多种转染剂和／或一种或多种添加剂复合，及(4)将细胞与(2)或(3)中形成的复合物接触。
细胞与复合物的接触可通过细胞与所述复合物一起保温(对于体外或离体应用)，或通过将复合物注射入机体中(对体内应用)来实现。
因此本发明提供一种用于治疗疾病的特别有利的方法，包括给予含有适于治疗所述疾病之核酸的本发明载体。更具体地讲，该方法可用于由蛋白或肽产物缺陷造成的疾病，所给予的DNA编码所述蛋白或肽产物。本发明也包括本发明载体对体内、离体或体外细胞转染的应用。
本发明还涉及含有如上定义载体的任何重组细胞，优选真核细胞，如酵母、动物细胞等。这些细胞通过能在给定的细胞中引入DNA的为本领域技术人员所知的任何技术获得。
以下实施例用于说明本发明而不限制其范围，其将显示本发明的其他特征和优点。
附1寡核苷酸(ODN)和马来酰亚胺-NLS肽的偶连。
图2经胰蛋白酶蛋白酶水解作用的寡核苷酸-肽嵌合体(Pso-GA19-NLS)在15％聚丙烯酰胺凝胶上的分析。
1=寡核苷酸Pso-GA19-SH2=寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA19-NLS3=胰蛋白酶消化后的寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA19-NLS。
图3质粒pXL2813的图示。
图4质粒pXL2652的图示。
图5在15％聚丙烯酰胺凝胶上分析质粒pXL2813和寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA19-NLS间的三螺旋形成。
寡核苷酸Pso-GA19-NLS和质粒混合在含有100mM MgCl2的缓冲液中。寡核苷酸与质粒相比过量0-200M。在37℃过夜后将该混合物光活化，然后用分别切割质粒和三螺旋形成区的两种限制酶消化。
1=无寡核苷酸2=寡核苷酸过量质粒15M3=寡核苷酸过量质粒50M4=寡核苷酸过量质粒100M5=寡核苷酸过量质粒200M6=仅有光活化的寡核苷酸7=仅有未光活化的寡核苷酸8=寡核苷酸过量质粒30M，混合物未被光活化。
图6用单独质粒pXL2813、载体pXL2813-Pso-GA19-NLS及无质粒时进行试验，转基因(β-半乳糖苷酶)的体外表达。
图7通过与输入蛋白60-GST的作用鉴定寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA19-NLS的肽部分(在15％聚丙烯酰胺凝胶上分析)。
1=寡核苷酸Pso-GA19(1μg)2=寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA19-NLS(1μg)3=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸Pso-GA19的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
4=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸Pso-GA19的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的沉淀。
5=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA10-NLS的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
6=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合体Pso-GA19-NLS的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的元件)和上清液后收集的沉淀。
图8在15％聚丙烯酰胺凝胶上分析胰蛋白酶蛋白水解作用下的寡核苷酸-肽嵌合体(GA19-NLS)。
1=寡核苷酸GA19-SH(200μg)2=高压液相色谱纯化前的寡核苷酸-肽嵌合体GA19-NLS(1μg)3=纯化后的寡核苷酸-肽嵌合体GA19-NLS(1μg)4=胰蛋白酶消化后的寡核苷酸-肽嵌合体GA19-NLS(1μg)。
图9质粒pXL2813和嵌合体GA19-NLS间三螺旋形成动力学的图示(被占据的三螺旋位点百分数随时间的变化)。


图10通过与输入蛋白60-GST的相互作用鉴定寡核苷酸-肽嵌合体GA19-NLS的肽部分。
1=寡核苷酸=肽嵌合体GA19-NLS，2=寡核苷酸GA19’3=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合体GA19-NLS的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
4=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合体GA19-NLS的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的沉淀。
5=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸GA19的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
6=保温包被输入蛋白60和寡核苷酸GA19的小珠-谷胱甘肽并分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的沉淀。
图11质粒pXL2997的图示。
图12质粒pXL2997和嵌合体pim-NLS间三螺旋形成动力学的图示(被占领三螺旋位点百分率随时间的变化)。
图13以RLU(相对光单位)／肿瘤表示的质粒pXL2813(在图中以Bgal表示)和pXL2813-Pso-GA19-NLS(在图中以NLS-Bgal表示)在人肺肿瘤H1299中的体内β-半乳糖苷酶活性棒图。
利用诸如专利申请WO 99／01157和WO 99／01158中描述的电转移技术实现转染。材料和方法1．寡核苷酸和肽的偶连寡核苷酸所用的寡核苷酸要么是19个碱基长的序列5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID No．4)，在下文中称其为“GA19”，要么是13个碱基长的序列5’-GGGGAGGGGGAGG-3’(SEQ ID No．15)，在下文中称其为“pim”(因为它与原癌基因pim-1的序列有关)。
称为GA19-SH或pim-SH的寡核苷酸具有分别与GA19和pim相同的序列，在5’端带有巯基，在巯基和5’端的磷酸之间有一个6碳间隔基。称为Pso-GA19-SH的寡核苷酸在3’端有一巯基(SH)，另外在5’端有一补骨脂素(Pso)，在补骨脂素和5’-端磷酸之间有一6碳间隔基。称为Pso-GA19的寡核苷酸没有巯基。
所用的名称汇总在下表Ⅰ中。
表Ⅰ
将这些冻干的寡核苷酸溶入醋酸三乙铵100mM，pH7缓冲液中。肽用于偶连的肽是经固相自动合成的，包括-SV40T抗原的核定位序列(PKKKRKV，SEQ ID No．11)，-不能靶向也不能进行核转运(由于突变)的突变序列(PKNKRKV，SEQ ID No．14)。
这些肽还在N端带有4个氨基酸的间隔臂KGAG。N-末端的赖氨酸被化学修饰其ε碳上含有马来酰亚胺基团，在α碳的胺上含有保护基9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。该Fmoc基团在260nm处吸光，这使得可以用反相高压液相色谱跟踪该肽。C-末端基团也被保护(CONH2基团)，为了肽合成而引入保护。
这些肽的结构示于下表Ⅱ中表Ⅱ
将这些冻干的肽溶于100mM醋酸三乙铵(pH7)缓冲液中。浓度为0．4mg／ml。偶连对于与寡核苷酸的偶连，所用的策略是让寡核苷酸所带巯基与肽所带马来酰亚胺基团反应[Eritja，R．等，含核转运信号序列的特定肽-寡核苷酸杂合体的合成，四面体，1991，47(24)，4113-4120页]。
以等摩尔方式向肽溶液中加入寡核苷酸，室温静置反应液2小时。在含直径5μm孔隙率300_之球形二氧化硅的Vydac C8柱上高压液相色谱纯化寡核苷酸-肽嵌合体。使用0．1M醋酸三乙铵(TEAA)缓冲液和35分钟内5％至50％乙腈的梯度。在260nm处检测产物。胰蛋白酶消化嵌合体的分析将缀合的寡核苷酸-肽用胰蛋白酶进行蛋白水解作用，这可以证明嵌合体的肽部分[Reed，M．W．等，核定向肽-反义寡核苷酸缀合物的合成和评价，生物缀合物化学，1995，6，101-108页]。含有1μg寡核苷酸-肽的7μl0．1M醋酸三乙铵(TEAA)纯化缓冲液中的溶液与1μl胰蛋白酶溶液(5mg／ml)混合。向其中加入1μl100mM Tris，HCl pH=9的缓冲液和1μl 500mM EDTA。消化一小时后将样品置于15％聚丙烯酰胺凝胶(7M脲)孔中。在100mM Tris、90mM硼酸、1mM EDTA(pH=8．3)中进行电泳。用Biorad试剂盒银染后取下核酸。2．与嵌合体形成三螺旋质粒用于研究与嵌合体GA19-肽形成三螺旋的质粒称为pXL2813(7257bp，见图3)。该质粒表达巨细胞病毒(CMV)早熟基因强启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。
在启动子的上游，7238和7256位之间按分子生物学常规方法克隆了序列GA19(5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’，SEQ ID No．4)。
已将它克隆在质粒pXL2652中(7391bp，其结构示于图4中)，该质粒表达巨细胞病毒(CMV)早熟基因强启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。该启动子来自pCDNA3，LacZ基因和其polyA来自pCH110，其余来自pGL2。
这些序列被克隆在启动子上游单一酶切位点MunI和XmaI之间。为此，将含有待克隆序列6651(5’-AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3’)和6652(3’-CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5’)的两个互补寡核苷酸95℃加热5分钟，然后让温度缓缓降低而杂交。然后质粒pXL2652用酶MunI和XmaI于37℃消化2小时，该双消化的产物在1％琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色。
用于随后克隆的目标片段按Jetsorb方法(Genomed)洗脱，将200ng这种片段与10ng杂交寡核苷酸混合物在T4连接酶作用下16℃再连接16小时。
感受态大肠杆菌DH5α株铺在含LB培养基和氨苄青霉素的培养皿中，用反应混合物经电穿孔转化。挑选氨苄青霉素抗性克隆，通过碱溶解提取DNA，在1％琼脂糖上分析。对一个大小相应的克隆测序，产物与预期相符。
在寡核苷酸是pim的情况下，用于研究三螺旋形成的质粒是图11所示的pXL2997。该质粒表达巨细胞病毒(CMV)早熟基因强启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。
在启动子上游，按分子生物学常规方法克隆了pim序列(SEQ IDNo．15)。三螺旋的形成通过质粒pXL2813(3pmol质粒，即15μg)或pXL2997和不同量的寡核苷酸或嵌合体在100mM Tris，HCl pH=7．5和100mM MgCl2中混合进行三螺旋的形成。三螺旋的光活化保温过夜后，在冰中用365nm波长的单色灯(Biorad)照射15分钟。光活化产物用限制酶MfeI和SpeI消化，并在15％聚丙烯酰胺凝胶(7M脲)上用100mM Tris、90mM硼酸、1mM EDTA、pH=8．3的迁移缓冲液进行分析。通过用Biorad试剂盒银染取下核酸[Musso，M．J．C．Wang和M．W．V．Dyke，含连有补骨脂素之寡脱氧核苷酸的DNA三螺旋的体内存留，核酸研究，1996，24(24)，4924-4932页]。三螺旋的研究方法该方法基于含待形成三螺旋之质粒及寡核苷酸溶液的排阻色谱的原理。所用的排阻柱(Columus，Linkers 6，Boehringer Mannheim)由Sepharose珠组成，并具有194碱基对的排阻限，这得以将没有与质粒配对的寡核苷酸保留在柱中。
首先，用dATPα35S经末端转移酶对寡核苷酸3’末端放射标记。所用的程序来自Amersham在50μl体积的含二甲胂酸钠的缓冲液中在10单位末端转移酶存在下将10pmol寡核苷酸与50μCi dATPα35S保温2小时。按如下方法评价标记寡核苷酸的百分比将标记后溶液1／100稀释的样品1μl点在两张Whatman DE81纸上。一张纸用2×SSC洗2次5分钟，用水洗30秒钟，用乙醇洗2分钟。比较两张纸的放射活性。经洗涤的纸放射活性相应于有效掺入的35S。
在35μl体积中实现三螺旋的形成。质粒浓度(40nM)和寡核苷酸浓度(20nM)、所用缓冲液(100mM Tris HCl pH=7．5，50mM MgCl2)和温度(37℃)是固定的，而保温时间在1-24小时间。在使用前，Sepharose柱用反应缓冲液平衡，以2200转／分离心4分钟以将它们压紧。将25μl反应液上样于该柱上，在前述相同条件下离心。然后将25μl反应缓冲液上样于这些柱上，再次离心。收集洗脱液。
测定5μl反应液中所含的放射活性，称为cpm(样品)，和洗脱液中所含放射活性，称为cpm(洗脱液)，从而得出洗脱寡核苷酸的百分比％洗脱的寡核苷酸=cpm(洗脱液)／[5×cpm(样品)]×100通过测定洗脱液和样品在260nm处的光密度评价实验过程中有效洗脱的质粒百分比，从而可以计算结合在总质粒上的寡核苷酸的百分比％结合的寡核苷酸=[％洗脱的寡核苷酸／％洗脱的质粒]×100在考虑三螺旋形成反应中所用质粒浓度(称为[质粒])和寡核苷酸浓度(称为[oligo])的基础上，该参数可用于评价被有效占据的三螺旋形成位点百分比％占据的三螺旋位点=％结合的寡核苷酸×[oligo]／[质粒]3．与输入蛋白的作用重组蛋白用于研究与寡核苷酸-肽(NLS或突变NLS)缀合物相互作用的亚单位输入蛋白60来自鼠，并与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合。输入蛋白60的序列已克隆在载体pGEX-2T中以与GST融合。该重组蛋白已在大肠杆菌中生产[Imamoto，N．等，核孔定向复合物的58kDa成分参与核蛋白转入的体内证据，The EMBO Journal，1995，14(15)，3617-3626页]。与重组蛋白的相互作用所有相互作用实验在结合缓冲液中进行(20mM HEPES，pH=6．8，150mM醋酸钾，2mM醋酸镁，2mMDTT和100μg／mlBSA)。
首先，将重组蛋白与包被谷胱甘肽基团的Sepharose珠(PharmaciaBiotech)保温，10μg珠使用1μg重组蛋白。在500μl结合缓冲液中，室温保温30分钟后，以2000G离心混合物30秒，取上清液。通过将小珠重悬于500μl结合缓冲液中并如前所述离心，洗涤5次。将小珠重悬在结合缓冲液中以获得含50％重组蛋白包被小珠的悬浮液。
其次，将60μl该含50％重组蛋白包被小珠的悬浮液在500μl结合缓冲液中与2μg寡核苷酸或寡核苷酸-肽保温。室温保温30分钟后，以2000G离心混合物30秒，取上清液。收集30μl上清液用于分析不结合在小珠上的成分。通过重悬于500μl结合缓冲液并如前所述离心洗涤小珠5次。将小珠重悬于15μl上样缓冲液(0．05％溴酚蓝、40％蔗糖、0．1M EDTA，pH=8，0．5％月桂基硫酸钠)，90℃下加热10分钟。在15％聚丙烯酰胺凝胶(7M脲)上分析上清液和沉淀的内容，迁移缓冲液为100mM Tris，90mM硼酸，1mM EDTA，pH=8．3。通过用Biorad试剂盒银染取出核酸[Rexach，M和G．Blobel，蛋白的细胞核输入涉及转运底物、转运因子和核孔蛋白的结合及解离反应，细胞(Cell)，1995，83，683-692页]。4．细胞转染细胞培养所用细胞类型为NIH3T3(ATCC CRL-1658)，为小鼠的成纤维细胞。这些细胞培养在含4．5g／l葡萄糖(DMEM Gidco)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U／ml)和链霉素(100μg／ml)和10％胎牛血清(Gibco)的改良Dulbecco培养基中。于5％CO2孵箱中37℃培养。转染在转染前一天，在24孔板的孔中接种50000个细胞／孔。用150mMNaCl稀释载体，与阳离子脂(下式化合物H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2，如专利申请WO 97／18185中以序号(6)所示)混合，用150mM NaCl稀释。以每微克质粒6nmol脂的比例混合。该混合物在无血清培养基中稀释1／10，上样于细胞上。在37℃、5％CO2孵箱中培养2小时后，加入10％胎牛血清。β-半乳糖苷酶的定量培养48小时后，细胞用PBS洗2次，用250μl溶胞缓冲液(Promega)溶解。按“Lumigal β-半乳糖苷酶遗传报道系统”操作程序(Clontech)对β-半乳糖苷酶定量。在发光计Lumat LB9501(Berthold)上测定活性。用BCA试剂盒(Pierce)测量蛋白的量。
实施例实施例1本实施例证明寡核苷酸Pso-GA19-SH与肽马来酰亚胺-NLS偶连的可行性。
寡核苷酸Pso-GA19-SH，序列为5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’，在3’-末端带有巯基，按前文“材料与方法”部分“寡核苷酸与肽的偶连”一节中描述的方法将其与N-末端带有马来酰亚胺基团的肽NLS偶连。
通过反相高压液相色谱(HPLC)跟踪偶连反应。反应以等摩尔化学计量法进行，2小时内偶连完成，用HPLC纯化嵌合体。
偶连反应流程图示于图1中。
在胰蛋白酶蛋白水解作用后在聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分析嵌合体寡核苷酸-肽(Pso-GA19-NLS)，在变性聚丙烯酰胺凝胶上迁移并对核酸银染色后得以显示嵌合体的肽部分的存在(如“材料和方法”部分“胰蛋白酶消化嵌合体的分析”一节中所述)。
嵌合体Pso-GA19-NLS的电泳迁移相对于寡核苷酸Pso-GA19-SH要滞后，在Pso-GA19-NLS和Pso-GA19-SH的迁移水平之间显现并观察到了蛋白水解消化产物，如图2中所示。
嵌合体Pso-GA19-NLS含有可被胰蛋白酶水解的肽部分。这些结果清楚地证明了寡核苷酸和肽之间发生了偶连，而且偶连产率较高。实施例2本实施例证明质粒pXL2813和经可光活化烷基化试剂修饰的嵌合体Pso-GA19-NLS间三螺旋的形成。本实施例还指出了按寡核苷酸相对质粒的过量摩尔浓度所修饰质粒的比例。
质粒pXL2813(示于图3)含有与GA19互补的全嘌呤序列，其可与寡核苷酸GA19、Pso-GA19、Pso-GA19-SH或Pso-GA19-NLS形成三螺旋。二价阳离子如Mg2+可稳定这些三螺旋。将寡核苷酸Pso-GA19-NLS和质粒在含100mM MgCl2的缓冲液中混合。寡核苷酸相对质粒过量的摩尔浓度在0-200之间。
在37℃保温12小时后，将混合物光活化15分钟(如“材料和方法”部分“三螺旋的光活化”一节中所述)，然后用两种限制酶MfeI和SpeI消化，它们分别切割质粒部分和三螺旋形成区。这样未修饰的质粒pXL2813经消化后释放出含70个碱基对的核酸片段。用质粒和与双螺旋共价连接的形成三螺旋的寡核苷酸所得片段含有70个碱基对加上寡核苷酸的19个碱基。通过在变性聚丙烯酰胺凝胶上迁移，可以将这些不同大小的片段分离来自经三螺旋修饰之质粒的片段迁移距离短于来自未修饰质粒的片段。因而通过变性聚丙烯酰胺凝胶上的电泳，可以对根据寡核苷酸过量于质粒的摩尔浓度而不同的修饰质粒的比例进行定量。
结果如图5所示。对于寡核苷酸相对质粒过量的摩尔浓度大于50的，所有质粒均被修饰，与寡核苷酸Pso-GA19-NLS结合。在无光活化时，丧失了消化片段在变性凝胶上的迁移延迟。
看来与寡核苷酸Pso-GA19-SH或Pso-GA19-NLS形成的三螺旋在光活化后发生了与双螺旋良好的共价连接。
另外，如前所述消化质粒骨架的其余部分并分析，可以证实光活化不会导致寡核苷酸Pso-GA19-NLS在含形成三螺旋序列区域之外的非特异性共价连接。
这些结果清楚地显示了将肽序列与质粒特异性共价结合的条件，而这发生在调节转基因表达的启动子之外，这避免了转基因表达受到影响。实施例3本实施例证明尽管质粒被修饰转基因在体外被表达的能力。
通过转染NIH3T3细胞，比较了本修饰的或与寡核苷酸Pso-GA19-NLS结合的质粒pXL2813对β-半乳糖苷酶的表达。
结果报告在图6中，所得值的均值1±标准差)汇总在下表Ⅲ中表Ⅲ
可以看出通过在启动子上游共价结合三螺旋进行修饰后，转基因的表达提高了。
这些结果清楚地表明三螺旋的形成不影响转基因的体外表达。相反，由于连接了靶向序列NLS，质粒可进行核定位，更多的质粒达到了细胞核内，从而导致转染效率提高。实施例4本实施例的目的是验证以三螺旋形式结合于质粒上的靶向信号的存在不会抑制体内表达。
实验包括，按专利申请WO 99／01157和WO 99／01158中描述的电转移技术在人肺肿瘤H1299中转染pXL2813和pXL2813-Pso-GA19-NLS。实验在18-20g的雌性小鼠中进行。
给小鼠单侧移植20mm3的H1299肿瘤块。让肿瘤生长达到200-300mm3的体积。按肿瘤大小挑选小鼠并分成均匀的组。然后用氯胺酮／赛拉嗪混合物(有商业供应)将小鼠麻醉。用Hamilton注射器在肿瘤周围纵向注射质粒溶液(8μgDNA／40μl150mM氯化钠)。
在肿瘤侧面涂上导电凝胶，将肿瘤置于距离0．45-0．7cm的两块不锈钢电极板之间。在注射后20-30秒用商业方波脉冲发生器(Electro-pulsateur PSl5，Jouan，法国)施加电脉冲。用示波仪控制脉冲强度(伏)、持续时间(毫升)和频率(赫兹)，其应以500V／cm、20毫秒和1赫兹发射。
为了评价肿瘤的转染，在注射质粒2天后将分别注射质粒pXL2813和pXL2813-Pso-GA19-NLS的10只和7只小鼠无痛苦处死。取出肿瘤、称重并在加有抗蛋白酶(Complete，Boehringer)的裂解缓冲液(Promega)中研磨。将所得悬液离心以获得清澈的上清液。10μl该上清液与250μl反应缓冲液(Clontech)反应1小时至浑浊后，用商业发光计测定β-半乳糖苷酶活性。结果以每个肿瘤的总RLU(“相对光单位”)表示。
发现质粒pXL2813-Pso-GA19-NLS体内表达转基因的水平高于或等于用未修饰的质粒pXL2813所获得的水平(见图13)。实施例5本实施例阐明缀合物Pso-GA19-NLS肽部分的鉴定，即验证本发明构建物中结合的NLS肽的靶向特性。
所用的肽序列SV40 T抗原的NLS信号被α核周蛋白(karyopherin)家族的受体识别。其鼠等价物(称为输入蛋白60)以与谷胱甘肽S-转移酶融合形式已用于鉴定寡核苷酸-肽缀合物。按“材料和方法”部分“与输入蛋白的相互作用”一节中所述进行操作。
研究了包被输入蛋白60的小珠-谷胱甘肽与寡核苷酸GA19-NLS或Pso-GA19-NLS间的相互作用。室温保温30分钟后，分离小珠沉淀(含与输入蛋白相作用的成分)和上清液。
该鉴定的结果报告在图7中。该图表明，寡核苷酸Pso-GA19-NLS被结合在谷胱甘肽小珠上，而寡核苷酸Pso-GA19保持在上清液中。
这清楚地表明了寡核苷酸PSo-GA19-NLS与α输入蛋白间相作用的能力。因此寡核苷酸-肽嵌合体的肽部分可被其受体很好地识别，这表明肽有效地发挥了其靶向作用。实施例6本实施例证明了寡核苷酸GA19-SH与肽马来酰亚胺-NLS偶连的可能性。与实施例1不同，嵌合体没有经可光活化烷化剂修饰。
在与寡核苷酸Pso-GA19-SH相同的条件下(见实施例1)，将序列为5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID No．4)、5’-端有巯基的寡核苷酸GA19-SH与在N-末端具有马来酰亚胺基团的肽马来酰亚胺-NLS偶连。
用反相高压液相色谱(HPLC)跟踪该偶连。反应以等摩尔化学计量法进行，2小时内偶连完全。然后经HPLC纯化嵌合体。
按“材料和方法”部分所述经胰蛋白酶的蛋白水解作用分析寡核苷酸-肽嵌合体。
结果示于图8中，与用寡核苷酸Pso-GA19-SH获得的结果相似。实施例7本实施例证明了在无烷化剂存在下质粒pXL2813和嵌合体GA19-NLS间形成三螺旋的可能性。
按“材料和方法”部分“与嵌合体形成三螺旋”一节所述的技术，进行了质粒pXL2813和嵌合体GA19-NLS(如实施例5中所述获得)间三螺旋的形成和其动力学研究。
图9显示了三螺旋形成的动力学。
看来在40nM质粒和20nM寡核苷酸的浓度条件下，形成了稳定的三螺旋。实施例8本实施例说明嵌合体GA19-NLS肽部分的鉴定。
所用的肽序列SV40 T抗原的NLS信号被α核周蛋白家族的受体识别，实施例4中已提到了这一点。其鼠等价物称为输入蛋白60，后者以与谷胱甘肽S-转移酶融合的形式已用于鉴定寡核苷酸-肽缀合物。如“材料和方法”部分“与输入蛋白的相互作用”一节中所述进行操作。
研究了包被有输入蛋白60的小珠-谷胱甘肽和寡核苷酸GA19或GA19-NLS间的相互作用。在常温保温30分钟后，分离小珠沉淀(包括与输入蛋白相作用的成分)和上清液。
结果如图10中所示。可以看出，寡核苷酸GA19-NLS与谷胱甘肽的小珠结合，而寡核苷酸GA19保留在上清液中。
这清楚地表明了寡核苷酸GA19-NLS与α输入蛋白相作用的能力。因而寡核苷酸-肽嵌合体的肽部分被其受体很好地识别，发挥了其靶向信号的作用。实施例9本实施例证明寡核苷酸pim-SH与肽马来酰亚胺-NLS偶连的可能性。
在与寡核苷酸GA19-SH相同的条件下(见实施例5)，将序列为5’-GGGGAGGGGGAGG-3’(SEQ ID No．15)、5’端有巯基的寡核苷酸pim-SH与在N-末端带马来酰亚胺基团的肽马来酰亚胺-NLS偶连。
用反相高压液相色谱(HPLC)跟踪该偶连反应。该反应以等摩尔化学计量法进行，2小时内偶连完全。然后经HPLC纯化嵌合体。实施例10本实施例证明无烷化剂时质粒pXL2997和嵌合体pim-NLS间形成三螺旋的可能性。
按“材料和方法”部分“与嵌合体形成三螺旋”一节中所述技术进行并研究质粒pXL2997和嵌合体pim-NLS(如实施例8所述获得)间三螺旋形成的动力学。
图12显示了三螺旋形成的动力学。
可见在40nM质粒和20nM寡核苷酸的浓度条件下形成了稳定的三螺旋。
虽然以上对本发明进行了完全的描述，但显然可对本发明进行许多修改而不偏离本发明的精神和以下权利要求书的范围。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称RHONE POULENC RORER(B)街道Raymond Aron大街20号(C)城市安东尼CEDEX(E)国家法国(F)邮编92165(G)电话0155717326(H)传真0155717291(ⅱ)发明名称转移核酸的载体、含有它们的组合物及其应用(ⅲ)序列数15(ⅳ)计算机可读形式(A)载体软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS／MS-DOS(D)软件PatentIn Release＃1．0，＃1．30版(EPO)(2)SEQ ID No．1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．1GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25(2)SEQ ID No．2的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．2CTTCTTCTTC TTCTTCTTCTT 21(2)SEQ ID No．3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．3AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19(2)SEQ ID No．4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．4AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19(2)SEQ ID No．5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．5TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19(2)SEQ ID No．6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．6CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19(2)SEQ ID No．7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．7GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21(2)SEQ ID No．8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度13碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．8GAAAAAGGAA GAG13(2)SEQ ID No．9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．9AAGAAAAAAA AGAA14(2)SEQ ID No．10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．10AAAAAAGGGA ATAAGGG 17(2)SEQ ID No．11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．11Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val15(2)SEQ ID No．12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．12Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys15 10 15Leu Asp Lys(2)SEQ ID No．13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度38个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)构型线性
(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．13Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly1 5 10 15Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro20 25 30Arg Asn Gln Gly Gly Tyr35(2)SEQ ID No．14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．14Pro Lys Asn Lys Arg Lys Val1 5(2)SEQ ID No．15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度13碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．15GGGGAGGGGG AGG 1权利要求
1．核酸转移载体，其特征在于它含有一种双链DNA分子和至少一种与靶向信号偶连并能够与存在于所述双链DNA分子上的特定序列形成三螺旋的寡核苷酸。
2．根据权利要求1的核酸转移载体，其特征在于双链DNA载体是一种质粒或附加体。
3．根据权利要求2的核酸转移载体，其特征在于双链DNA分子是一种环状形式和超缠绕状态的质粒。
4．根据权利要求1-3的核酸转移载体，其特征在于双链DNA分子含有一种表达盒，该表达盒由一个或多个启动子及一个在哺乳动物细胞中有活性的转录终止子控制下的一个或多个目的基因构成。
5．根据权利要求4的核酸转移载体，其特征在于目的基因是编码一种治疗性产物的核酸。
6．根据权利要求1-5之一的核酸转移载体，其特征在于存在于双链DNA分子上的特定序列是全嘌呤-全嘧啶序列。
7．根据权利要求1-6之一的核酸转移载体，其特征在于存在于双链DNA分子上的特定序列是天然存在于双链DNA上的一种序列或人工引入双链DNA中的天然或合成序列。
8．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸包含多聚-CTT序列，存在于双链DNA分子上的特定序列为一种多聚-GAA序列。
9．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸包含序列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQ ID No．1)或序列(CTT)7(SEQ ID No．2)。
10．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于存在于双链DNA分子上的特定序列包含序列5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’(SEQ ID No．3)，寡核苷酸包含序列5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID No．4)或5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3’(SEQID No．5)。
11．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于存在于双链DNA分子上的特定序列包含大肠杆菌ColE1复制起点中存在的序列5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’(SEQ ID No．6)的全部或部分，寡核苷酸具有序列5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3’(SEQ IDNo．7)。
12．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于存在于双链DNA分子上的特定序列包含分别存在于质粒pBR322中的和大肠杆菌中的β-内酰胺酶基因中的序列5’-GAAAAAGGAAGAG-3’(SEQID No．8)或序列5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’(SEQ ID No．10)。
13．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于存在于双链DNA分子上的特定序列包含存在于具有条件性复制起点的质粒如pCOR的γ复制起点中的序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ IDNo．9)。
14．根据权利要求1-7之一的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸包含至少3个碱基。
15．根据权利要求14的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸包含5-30个碱基。
16．根据权利要求1-15之一的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸带有至少一种化学修饰，这种修饰使其对核酶有抗性或受保护、或提高其对双链DNA分子上存在的特定序列的亲和性。
17．根据权利要求1-16之一的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸是一种骨架经过修饰的核苷链。
18．根据权利要求1-16之一的核酸转移载体，其特征在于寡核苷酸与一种烷化剂相连，该烷化剂可与双链DNA的碱基形成共价连接。
19．根据权利要求18的核酸转移载体，其特征在于所述烷化剂是可光活化的。
20．根据权利要求18或19的核酸转移载体，其特征在于所述烷化剂是补骨脂素。
21．根据权利要求1-20的核酸转移载体，其特征在于靶向信号与细胞外基质成分、浆膜的受体相作用、靶向细胞内的腔室、和／或改善双链DNA的分子内途径。
22．根据权利要求21的核酸转移载体，其特征在于所述靶向信号包括生长因子(EGF、PDGF、TGFb、NGF、IGF I、FGF)、细胞因子(IL-1、IL-2、TNF、干扰素、CSF)、激素(胰岛素、生长激素、催乳素、胰高血糖素、甲状腺激素、类固醇激素)、识别凝集素的糖、免疫球蛋白、转铁蛋白、脂蛋白、维生素如维生素B12、肽激素或神经肽(速激肽、神经降压素、VIP、内皮素、CGRP、CCK等)、或被整联蛋白识别的任何基元，例如RGD肽，或由细胞膜非固有的其他蛋白识别的基元。
23．根据权利要求21的核酸转移载体，其特征在于靶向信号是一种细胞内靶向信号，如核定位信号(NLS)。
24．根据权利要求23的核酸转移载体，其特征在于所述核定位信号是SV40T抗原的NLS序列。
25．根据权利要求21的核酸转移载体，其特征在于所述靶向信号同时具有细胞外靶向作用和细胞内靶向作用。
26．根据权利要求1-25的核酸转移载体，其特征在于靶向信号与寡核苷酸的偶连是通过固相或液相合成获得的，特别是通过建立二硫键、硫醚、酯、酰胺或胺而实现的。
27．一种组合物，其特征在于它含有权利要求1-26之一中定义的至少一种载体。
28．根据权利要求27的组合物，其特征在于它另外含有一种或多种转染试剂。
29．根据权利要求28的组合物，其特征在于转染试剂是一种阳离子脂、脂多胺或阳离子聚合物。
30．根据权利要求27-29的组合物，其特征在于它还含有能够与如权利要求1-25之一所定义载体／转染试剂复合物结合的一种或多种添加剂。
31．根据权利要求30的组合物，其特征在于所述添加剂是选自在生理条件下为两性离子或不带离子电荷的天然或合成脂类的一种或多种中性脂。
32．根据权利要求30或31的组合物，其特征在于所述中性脂选自具有两条脂肪链的脂类。
33．根据权利要求30-32的组合物，其特征在于所述中性脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-、二棕榈酰基-、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂(具体如半乳糖脑苷脂)、鞘脂(具体如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂(具体如脱唾液酸GM1和GM2)。
34．根据权利要求30的组合物，其特征在于所述添加剂包含参与DNA浓集的化合物。
35．根据权利要求34的组合物，其特征在于所述化合物全部或部分来自组蛋白、核仁蛋白、和／或鱼精蛋白，或全部或部分由连续或非连续重复肽基元(KTPKKAKKP)和／或(ATPAKKAA)构成，基元数目可在2-10之间变化。
36．根据权利要求27-35任一项的组合物，其特征在于含有适于注射制剂的药物载体。
37．根据权利要求27-35任一项的组合物，其特征在于含有适于皮肤和／或粘膜施用的药物载体。
38．如权利要求1-26之一中所定义的核酸转移载体在制备用于治疗疾病的药中的用途。
39．在细胞中转染核酸的方法，其特征在于包括以下步骤(1)合成寡核苷酸-靶向信号嵌合体，(2)将(1)中合成的嵌合体与双链DNA接触以形成三螺旋，(3)必要时，将(2)中获得的载体与一种或多种转染试剂和／或一种或多种添加剂复合，及(4)将细胞与(2)或(3)中形成的复合物接触。
40．一种治疗疾病的方法，包括给予含有适于治疗该疾病的双链DNA的权利要求1-26之一定义的核酸转移载体。
41．含有如权利要求1-26之一定义的核酸转移载体的重组细胞。
42．根据权利要求41的重组细胞，其特征在于它是一种真核细胞。
全文摘要
本发明涉及新的载体和其转移核酸的用途。更具体地讲,本发明涉及能够引导核酸至特定细胞或细胞腔室的新载体。
文档编号A61P37/00GK1292827SQ9980393
公开日2001年4月25日 申请日期1999年3月19日 优先权日1998年3月24日
发明者C·乔里纳, D·舍尔曼, P·威尔斯 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司