基于pcr引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因snp快速、灵敏检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学、遗传学和核酸分子检测领域；更具体地，本发明涉及基于 PCR引物3'末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因 SNP快速、灵敏检测方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌作为女性癌症的第一大杀手，近些年在世界范围内已备受关注。据估计，仅 2007年，全球就有130万乳腺癌新发患者，有超过46万的患者死于该病。就中国而言，根据 2003~2007年全国32个肿瘤登记点的资料分析报告以及2008年世界卫生组织（WHO)国 际癌症研究中心发布的数据显示：近年来乳腺癌的发病率高居中国女性恶性肿瘤的首位， 并以3%以上的速度逐年递增；保守估计全国每年有4万多妇女死于此病，死亡率已居第6 位。
[0003] 已证实，乳腺癌的发生与遗传易感性、女性内分泌失调、哺乳过程中病毒的感染等 几大因素密切相关。这其中，遗传易感性（遗传背景）扮演了重要角色。因为据流行病学 研究显示，乳腺癌患者的一级亲属患此病的风险要显著高于普通人群，且年龄越小，风险越 大。因而该病具有明显的家族遗传倾向。而这种遗传倾向主要是由于基因突变造成的。这 其中，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)系主要组成部分。
[0004] 目前为止，研究已发现一系列与乳腺癌发生密切相关的乳腺癌易感基因 （breast cancer susc印tibility genes)，如 BRCA1、BRCA2、TP53、CHEK2、MAP3K1、T0X3、RAD50、ATM 等。这其中，BRCAl与BRCA2是最重要的2个易感基因。其突变，尤其是外显子的SNPs与 遗传性乳腺癌及早发性乳腺癌的高度相关性已被证实。
[0005] 由于这些基因中广泛存在的SNPs与乳腺癌的发生具有密切联系，再加上SNP已成 为继限制性片段长度多态性（RFLP)和微卫星标记（SSR)之后的第三代遗传标记，因此近年 来SNP检测技术领域的发展也十分迅速，已涌现出许多不同的SNP检测方法（技术），包括：
[0006] (1)直接测序法。通常采取的做法是对可能含有SNP的目标片段的PCR扩增产物 进行测序。由于这种方法最直接、可靠，因此也被认为是确认突变结果的"金标准"方法。但 其不可避免的缺点是通量低、耗时长；近年发展起来的高通量测序技术（如焦磷酸测序）虽 然具有高效、快速、可深度测序的优势，也被诸多研究机构广泛采用，但其配套仪器、试剂的 花费非常昂贵。
[0007] (2)限制性片段长度多态性（RFLP)。这是一种较早的SNP检测方法。其依据的原 理是每种限制性内切酶都具有严格、专一的酶切识别位点。如果基因某位点处的碱基发生 了改变而导致该处的若干个碱基恰好成为了某种限制性内切酶的切割识别位点，那么经该 酶作用并经电泳分离后，会检测到2个不同的DNA片段；反之若该位点处碱基没有发生改 变，则不会被此限制酶识别和作用，因此经电泳分离后，仍是原始的一个片段，不会产生两 个片段。这种方法原理简便、操作易行且结果可靠，也被人们认为是一种检测SNP的标准方 法。但其明显的缺陷是，一种酶往往只能针对性地检测一个或几个SNP位点，而且目前发现 的限制性内切酶的种类是有限的，并非每一个SNP都有对应的一种酶可以作用，限制了该 方法的应用。
[0008] (3)蛋白阻断实验（PTT)。这种方法主要是通过对基因表达产物--蛋白质片段 大小的分析来检测SNP的。由于这种方法只适用于检测SNP中，小片段的增添、缺失等可造 成翻译提前终止的移码突变，因此常作为其他SNP检测方法的一种辅助性验证手段，目前 已不单独用于SNP检测。
[0009] (4)基于DNA分子化学结构分析的方法。主要有单链构象多态性（SSCP)、异源双 链分析（HA)等。
[0010] (5)高分辨率熔解曲线分析。这是一种基于实时荧光定量PCR(real time quantitative-PCR)的分析方法。虽然检测准确度也令人满意，但实验当中为获得高分辨率 的熔解曲线，多数要用到饱和荧光染料，因而提高了实验的成本，一定程度上限制了该方法 的应用。
[0011] (6)引物延伸法。这种方法主要是一种基于PCR反应的检测方法。其主要原理是 针对涉及某SNP位点的两个等位基因分别设计两条不同的特异性辨别引物，使之3'末端恰 好位于SNP处，再在其上游（或下游）设计一条共用引物，这样一条共用引物与两条等位基 因特异性引物分别进行PCR反应，只有SNP位点与特异性引物的3'末端互补配对时，引物才 能顺利延伸，扩增得到片段。跟据PCR反应后的情况可以推测两个等位基因的SNP位点处 的突变情况。这种方法具备了常规PCR反应简便易行，应用广泛、无需昂贵的仪器设备等优 点。但值得一提的是，这种方法常会不可避免地产生假阳性结果，因此一定程度上影响了该 方法的准确度。此外，还有ddNTP单碱基延伸结合质谱检测法，也属于引物延伸法的范畴。
[0012] 以上是一些常用的早期SNP检测方法。目前发展起来的新方法还有：SNP基因芯 片技术，在一块很小的芯片上就可排列多达数十万个SNP特异性标记探针，可对大量DNA样 品同时检测；变性高效液相色谱法（DHPLC)、引物延伸结合飞行时间质谱分析（MALDI-T0F MS)、动态等位基因特异性杂交（DASH)等。它们与传统方法相比，在检测通量、准确度上有 了很大的提高，但与此同时，由于都用到了某些最新的仪器、技术，因此检测成本也相对较 高，尤其是当检测样品规模较少时，这一点更加突出。故短时间内还无法实现广泛的应用。
[0013] 由此可见，作为"金标准"的测序法虽然直接、准确，但耗时、耗力；其它传统方法虽 然简便易行，但或多或少都具有应用范围窄、准确度较低等不同的弊端；近年发展起来的一 些新方法，由于依托了最新的仪器设备，因此往往具有高通量、高准确度的优点，但成本昂 贵、原理复杂也是限制其广泛应用的一个主要原因。综合考虑，目前被各个实验室广泛采用 的仍以经过改进的传统方法为主。这其中，最有价值、应用最灵活的还属PCR引物延伸法。
[0014] 但是如上所述，早期的等位基因特异性PCR方法虽然简便易行，只需设计3条引 物，两个常规的PCR反应即可达到SNP检测与分型两个目的，但假阳性的产生却严重限制了 这种方法的准确度。因此这种原始方法现在已不常用，取而代之的是基于该理论的一系列 改进方法，如人为掺入错配碱基，加大区分度；增加外围引物进行巢式PCR，提高准确度等。 但是值得注意的是，假阳性的产生是由这种方法的原理决定的，因此这些诸多的改进，都不 能100%避免假阳性的产生。故而，一种简便易行、可操作性强，而又具有相当准确度、高效 经济的通过PCR反应检测SNP的方法对于核酸分子诊断、遗传学分析等领域是迫切需要的。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的在于提供基于PCR引物3'末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基 因 SNP快速、灵敏检测方法。
[0016] 在本发明的第一方面，提供一种乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测方法，所述 方法包括：
[0017] (1)针对一个单核苷酸多态性位点，以正向引物和反向引物为引物对，以同时含有 高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合体系进行PCR扩增；所述的正向或反向引 物中任一条为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-6位的任意1个或多个碱基对应待测 位点，但与野生型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3'末端核 苷酸经过2'，3' -双脱氧修饰，其长度为20~40mer ;
[0018] 所述的引物对中，辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与 相应区段上碱基序列完全匹配，其长度为20~40mer ;
[0019] (2)分析PCR扩增产物，若获得目的扩增产物，则表明待测基因的待测位点存在突 变，基因型为突变型；若未获得目的扩增产物，则表明待测基因的待测位点不存在突变，基 因型为野生型。
[0020] 在本发明的另一方面，提供一种乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测方法，所述 方法包括：
[0021] (1)针对一个单核苷酸多态性位点，以正向引物和反向引物为引物对，以同时含有 高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合体系进行PCR扩增；所述的正向或反向引 物中任一条为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-6位的任意1个或多个碱基对应待测 位点，但与突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3'末端核 苷酸经过2'，3' -双脱氧修饰，其长度为20~40mer ;
[0022] 所述的引物对中，辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与 相应区段上碱基序列完全匹配，其长度为20~40mer ;
[0023] (2)分析PCR扩增产物，若获得目的扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不 存在突变，基因型为野生型；若未获得目的扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在 突变，基因型为突变型。
[0024] 在一个优选例中，所述的突变包括：点突变、插入突变、缺失突变。
[0025] 在另一优选例中，所述的方法用于