用于癌症治疗的18,21-双脱氧麦克菌素衍生物的制作方法

专利名称：：用于癌症治疗的18,21-双脱氧麦克菌素衍生物的制作方法用于癌症治疗的18，21-双脱氧麦克菌素^f生物发明的背景90kDa热休克蛋白(Hsp90)是蛋白质折叠和装配中涉及的丰富的分子伴侣，它们中的许多也参与信号转导途径(综述参见Neckers，2002;Sreedhar等人，2004a;Wegele等人，2004和本文中的参考文献)。至今已经鉴别了近50种这些所谓的客户蛋白(clientproteins)，包括类固醇受体、非受体酪氨酸激酶例如src家族、细胞周期蛋白依赖性激酶例如cdk4和cdk6、嚢性跨膜调节子、一氧化氮合酶和其它(Donz6和Picard，1999;McLaughlin等人，2002;Chiosis等人，2004;Wegele等人，2004;http:〃www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf)。》匕夕卜,Hsp90在细胞对抗突变影响的应激反应和保护作用中发挥了关键作用(Bagatell和Whitesell，2004;Chiosis等人，2004)。Hsp90的功能是复杂的，涉及动态多酶复合体的形成(Bohen，1998;Liu等人，1999;Young等人，2001;Takahashi等人，2003;Sreedhar等人，2004;Wegele等人，2004)。Hsp90是导致客户蛋白降解、细胞周期失调和细胞凋亡的抑制剂的靶(Fang等人，1998;Liu等人，1999;Blagosklonny，2002;Neckers,2003;Takahashi等人，2003;Beliakoff和Whitesell,2004;Wegele等人，2004)。近来，已经确定Hsp卯是肿瘤侵入的重要的胞外介体(Eustace等人，2004)。已将Hsp90视为癌症治疗的新型主要治疗靶，这反映在对Hsp90功能的密集而详细的研究(Blagoskloimy等人，1996;Neckers，2002;Workman和Kaye,2002;Beliakoff和Whitesell,2004;Harris等人，2004;Jez等人，2003;Lee等人，2004)以及高通量篩选测定的研发中(Carreras等人，2003;Rowlands等人,2004)。Hsp90抑制剂包括化合物类型例如安莎霉素类、大环内酯类、噤呤、吡唑类、香豆素抗生素及其他(综述参见Bagatell和Whitesell,2004;Chiosis等人，2004和本文中的参考文献)。苯型安沙霉素是一大类化学结构，其特征是连接在芳香环结构任一侧的不同长度的脂肪环。天然存在的安沙霉素包括麦克菌素(macbecin)和18,21-二氢麦克菌素(也分别称为麦克菌素I和麦克菌素II)(1&2;Tanida等人，1980)、格尔德霉素(3;DeBoer等人，1970;DeBoer和Dietz，1976;WO03/106653和本文中的参考文献)，和除莠霉素家族(4;5，6，Omura等人，1979，Iwai等人，1980和Shibata等人，1986a，WO03/106653和本文中的参考文献)。o<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>格尔德霉素.3除莠霉素A,4RfOCHs,R2=CH3除莠霉素B,5RfH,R^H除莠霉iC，6Rt-OCH3，R2=H最初鉴别安沙霉素是出于它们的抗细菌和抗病毒活性，然而，目前，它们作为抗癌剂的潜在应用已经吸引了更大的兴趣(Beliakoff和Whitesell,2004)。目前，临床实验正在评估许多Hsp90抑制剂(Csermely和Soti，2003;Workman,2003)。特别的，格尔德霉素具有钠摩尔级效价，并且对依赖异常蛋白激酶的肿瘤细胞具有明显的特异性(Chiosis等人，2003;Workman,2003)。已经显示Hsp90抑制剂的治疗提高了放射对肿瘤细胞死亡的诱导作用，并且还已经证实，通过结合Hsp90抑制剂和细胞毒剂，增加了细胞杀伤能力(例如，乳癌、慢性髓性白血病和非小细胞肺癌)(Neckers，2002;Beliakoff和Whitese11，2004)。抗血管生成活性的潜力也是令人感兴趣的Hsp90客户蛋白HIF-la在实体肿瘤的;^中发挥了关键作用(Hur等人，2002;Workman和Kaye，2002;Kaur等人，2004)。Hsp卯抑制剂还具有免疫抑制剂的作用，涉及一些类型的肿瘤细胞在Hsp90抑制作用后的补体诱导裂解(Sreedhar等人，2004)。Hsp90抑制剂的治疗还可以导致与免疫细胞介导的裂解相关的诱导的过氧化物产生(Sreedhar等人，2004)。还讨论了Hsp90抑制剂作为潜在的抗痴疾药物的用途(Kumar等人，2003)。此外，还显示格尔德霉素干扰复杂糖基化的哺乳动物朊病毒蛋白Prpc的形成(Winklhofer等人，2003)。如上所述，安沙霉素还作为潜在的抗癌和抗B细胞恶性肺瘤化合物受到关注，然而目前可获得的安沙霉素表现出不佳的药理学和制药性质，例如它们表现出不佳的水溶解性、不佳的代谢稳定性、不佳的生物利用率或不佳的配制能力(Goetz等人，2003;Workman2003;Chiosis2004)。由于强烈的肝脏毒性(综述Workman,2003)，除莠霉素A和格尔德霉素都械_认为是临床实验的不良候选物，并且格尔德霉素还由于肝脏毒性被撤出了I期临床实验(Supko等人，1995;WO03/106653)。格尔德霉素是从吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的培养滤过物中分离的，表现出体外抗原生动物的强活性和抗细菌和真菌的弱活性。在1994年揭示了格尔德霉素与Hsp90的联系(Whitesell等人，1994)。克隆并测序了格尔德霉素的生物合成基因簇(Allen和Ritchie,1994;Rascher等人，2003;WO03/106653)。用NCBI登录号AY179507可获得DNA序列。近来也描述了来自吸水链霉菌二重霉素亚种(S.hygroscopicussubsp.duamyceticus)JCM4427的、遗传改造的格尔德霉素生产菌林的分离，以及4,5-二氢-7-0-脱氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素和4，5-二氢-7-0-脱氨曱酰基-7-羟基-17-0-去曱基格尔德霉素的分离(Hong等人，2004)。通过向除莠霉素生产菌林吸水链霉菌AM-3672饲喂格尔德霉素，分离到化合物15-羟基格尔德霉素、三环格尔德霉素类似物KOSN-1633和甲基-格尔德霉素(methyl画geldanamycinate)(Hu等人，2004)。自吸7jC链霉菌K279-78分离了两种化合物17-曱酰基-17-去甲氧基-18-0-21-0-二氢格尔德霉素和17-羟甲基-17-去甲氧基格尔德霉素。吸水链霉菌K279-78是含有黏粒pKOS279-78的吸水链霉菌NRRL3602，所述黏粒具有44kbp插入片段，其含有来自除莠霉素生产菌林吸7K链霉菌AM-3672的多个基因(Hu等人，2004)。在格尔德霉素生物合成簇的聚酮化合物合成酶模块中的四个中，已经对酰基转移酶结构域进行了取代(Patel等人，2004)。在模块1、4和5中进行的AT取代导致了全加工的类似物14-去曱基-格尔德霉素、8-去甲基-格尔德霉素和6-去甲氧基-格尔德霉素，以及未全加工的4，5-二氢-6-去甲氧基-格尔德霉素。模块7AT的取代导致了产生三种2-去曱基化合物，KOSN1619、KOSN1558和KOSN1559，其中之一(KOSN1559)，即格尔德霉素的2-去甲基-4，5-二氢-17-去甲氧基-21-脱氧衍生物，与Hsp90的结合具有比格尔德霉素高4倍的结合亲和力，比17-AAG高8倍的结合亲和力。然而，在使用SKBr3的ICs。测量中它并没有表现出改善。另一个类似物，被称为KOS-1806的新型非苯型格尔德霉素具有单酚结构(Rascher等人.，2005)。对KOS-1806没有给出活性数据。1979年，自吸水链霉菌菌林号AM-3672的发酵肉汤中分离了安沙霉素类抗生素除莠霉素A，并根据它的潜在的除草剂活性命名。通过使用感染了劳斯氏肉瘤病毒(RSV)温度敏感突变抹的大鼠肾系细胞建立了抗肿瘤活性，所述细胞用于筛选逆转这些细胞的转化形态的药物(综述参见Uehara，2003)。推断除莠霉素A主要通过与Hsp卯分子伴侣蛋白结合发挥作用，还讨论了与保守的半胱氨酸残基的直接结合，和随后的激酶的灭活(Uehara,2003)。已经分离了化学衍生物，与除莠霉素A相比，在在苯醌核C19处具有改变的取代基的化合物，和在安沙链(ansachain)中的卤代化合物表现出较低的毒性和更高的抗肿瘤活性(Omura等人，1984;Shibata等人，1986b)。WO03/106653和近期的文献中鉴别了除莠霉素生物合成基因簇的序列(Rascher等人，2005)。根据它们的抗真菌和抗原生动物活性来鉴别，自诺卡氏菌属物种(Nocardiasp)No.C-14919(珍贵束丝》文线菌珍贵亚种(j"/mw^"we附fl/^"/osw附/7f"/osi/附)ATCC31280)的培养上清液中分离了安沙霉素化合物麦克菌素(1)和18,21-二氢麦克菌素(2)(C-14919E-1和C-14919E-1)(Tanida等人，1980;Muroi等人，1980;Muroi等人，1981;US4，315，989和US4,187,292)。18，21-二氢麦克菌素的特征是含有二氢醌形式的核。麦克菌素和18,21-二氢麦克菌素都表现出具有相似的抗细菌和抗胂瘤活性，这是针对例如鼠白血病P388细胞系的癌细胞系(Ono等人，1982)。麦克菌素不抑制逆转录酶和末端脱氧核苷酸转移酶的活性(Ono等人，1982)。文献已经报道了麦克菌素的Hsp卯抑制功能(Bohen，1998;Liu等人，1999)。在专利US4，421，687和US4,512,975中描述了在添加到微生物培养肉汤后，麦克菌素和18,21-二氢麦克菌素转换为在一个或多个特定位置具有羟基基团而非甲氧基团的化合物。在大量土壤」微生物的筛选过程中，自属于链霉菌属的生产菌林中鉴别了化合物TAN-420A至E(7-11，EP0110710)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>TAN-420A,7R，H'R2=HTAN-420C,9R^H,R2《H3TAN-420E,11R^CHs,R2=CHNH2TAN-420B,8R^H,R2-HTAN-420D'10RfH'R2=CH在2000年，描述了自链霉菌属物种(&"印to附j;cMS/7.)S6699的细胞培养物中分离了格尔德霉素相关的、非苯醌安沙霉素代谢物利布拉霉素(reblastatin)，及其在治疗类风湿性关节炎中的治疗价值(Stead等人，2000)。另一个不同于化学不相关的苯醌安沙霉素的Hsp卯抑制剂是才艮赤壳素(单孢菌素)，其最初是由于抗真菌活性而自真菌波诺顿单孢菌(Mowos/7onVi/w^won/e")中发现(综述参见Uehara，2003),还发现其结构与自方文射丛赤壳菌(Nectriaradicicola)分离的14-元环大环内酯相同。除了它的抗真菌、抗细菌、抗原生动物和细胞毒性的活性外，随后还鉴别了它作为Hsp90分子伴倡蛋白的抑制剂(综述参见Uehara，2003;Schulte等人，1999)。还描述了根赤壳素的抗血管生成活性(Hur等人，2002)及其半合成的衍生物(Kurebayashi等人，2001)。目前，注意力集中在格尔德霉素的17-氨基衍生物作为新一代的安沙霉素抗癌化合物上(Bagatell和Whitesell,2004)，例如，17-(烯丙基胺基)-17誦去曱氧基格尔德霉素(17-AAG,12)(Hostein等人，2001;Neckers,2002;Nimmanapalli等人，2003;Vasilevskaya等人，2003;Smith-Jones等人,2004)和17-去甲氧基-17-N，N-二甲tt乙氨基-格尔德霉素(17-DMAG,13)(Egorin等人，2002;Jez等人，2003)。最近，格尔德霉素在17-位衍生出17-格尔德霉素酰胺、氨基甲酸酯、脲和17-芳基格尔德霉素(LeBrazidec等人,2003)。已经报道了超过60种17-烷基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素类似物的文库，并测试它们与Hsp90的亲和力和水溶性(Tian等人，2004)。另一种降低格尔德霉素毒性的方法是通过缀合肿瘤靶向的单克隆抗体，将活性的格尔德霉素化合物选择性的耙向和递送到恶性细胞中(Mandler等人，2000)。16虽然许多这些衍生物表现出降低的肝脏毒性，但是它们仍然仅具有有限的水溶性。例如，n-AAG需要使用增溶载体(例如，Cremophore⑧，DMSO-卵卵磷脂)，所述载体本身可能在一些患者中导致副作用(Hu等人，2004)。大多数安沙霉素类的Hsp90抑制剂享有共同的结构部分苯醌是迈克尔(Michael)受体，可以容易的与亲核物质例如蛋白质、谷胱甘肽等形成共价键。苯醌部分还与二氢醌进行氧化还原平衡，其间形成产生其它非特异毒性的氧自由基(Dikalov等人，2002)。例如，使用格尔德霉素治疗可以导致诱导性过氧化物产生(Sreedhar等人，2004a)。因此，仍然需要鉴别新型安沙霉素衍生物，其可用于癌症和/或B细胞恶性肿瘤的治疗，优选的此类安沙霉素的给药具有改善的水溶性，改善的药理学模式和/或降低的副作用模式。本发明公开了通过生物转化和/或任选地对亲代生产菌林进行遗传改造而产生的新型安沙霉素类似物。特别的，本发明公开了新型18，21-双脱氧麦克菌素类似物，其与目前可获得的安沙霉素相比，一般具有改善的药理学性质；特别的，预期它们在一个或多个以下性质中表现出改善抗不同癌症亚型的活性、毒性、水溶性、代谢稳定性、生物可利用率和配制能力。优选的，18,21-双脱氧麦克菌素类似物表现出改善生物可利用率。在本发明中，向麦克菌素生产菌林饲喂非天然的起始单元，任选地与负责麦克菌素的后-PKS修饰作用的基因的靶向灭活或缺失相结合，从而产生通过掺入非天然的起始单元而形成的新型麦克菌素类似物。特别地，我们描述了通过掺入起始单元形成的新型麦克菌素类似物，所述掺^始单元产生了这样的苯部分，所述苯部分或者在17、18和21位没有取代，或者在一部分或全部这些位置上被氟取代。任选地，可以通过耙向灭活或缺失，或者通过其它方法修饰(例如，将细胞暴露给UV辐射，并选择提示起始单元生物合成已经被破坏的表型)，来操纵负责起始单元生物合成的基因或调节子。可以通过多种机制产生后-PKS基因的选择性耙向，所述机制例如整合、靶向缺失麦克菌素簇区域(包括所有的或一些后-PKS基因)(任选地接着插入基因)，或者其它致使后-PKS基因或其编码酶无功能的方法，例如，化学抑制、定点诱变或如通过使用UV辐射的细胞诱变。结果，本发明提供了18，21-双脱氧麦克菌素类似物，制备这些化合物的方法，和在医学中或作为生产其它化合物的中间体中使用这些化合物的方法。因此，在第一个方面，本发明提供了麦克菌素类似物，其缺少普通的起始单元，并作为替代已经掺入了获得18，21-双脱氧麦克菌素类似物的起始单元，所述类似物或者在17、18和21位没有取代，或者在一部分或全部这些位置上被氟取代。在更特定的方面，本发明提供了根据下列式(I)的18,21-双脱氧麦克菌素类似物，或其可药用的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中Ri代表H、OH、OMe;R2代表H或Me;R3代表H或CONH2;R4和R5或者都代表H或一起代表键(即，C4至C5是双键)；R6代表H或F;R7代表H或F;和R8代表H或F。本文中，18，21-双脱氧麦克菌素类似物还被称为"本发明的化合物"，此类术语在本文中可互换的使用。上述结构表现出典型的互变异构体，本发明包括式(I)的化合物的所有互变异构体，例如，酮类化合物，其中可举例烯醇类化合物，反之亦然。发明包括上文显示的结构(I)定义的化合物的所有立体异构体。在另一方面，本发明提供了18，21-双脱氧麦克菌素的类似物例如式(1)的化合物，或其可药用的盐，用作为药物。定义本文所用的冠词"一个(a)"和"一种(an)"指冠词的一个或指超过一个(即至少一个)语法对象。例如，"类似物"意指一个类似物或超过一个类似物。如本文所用的，术语"类似物"指另一种化合物结构上相似的化学化合物，但其在组成上轻^:的不同(如由一个原子置换另一个，或者存在或缺少特定的官能团)。如本文所用的，术语"同源物"指基因的或由本文中公开基因编码的蛋白质的同源物，所述基因来自不同的麦克菌素生产菌林中的可选的麦克菌素生物合成簇，或者来自备选的安沙霉素生物合成基因簇的同源物，例如，来自格尔德霉素、除莠霉素或利布拉霉素(reblastatin)。此类同源物编码的蛋白质执行(可以自身执行)与所述基因或蛋白质在麦克菌素或相关的安沙霉素聚酮化合物的合成中相同的功能。优选的，此类同源物具有与本文中公开的特定基因的序列至少40%序列同一性、优选的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95。/。序列同一性(表3，SEQIDNO:ll，其是蔟中的所有基因的序列，可以从中推断特定基因的序列)。百分比同一性可以使用任何本领域技术人员已知的程序来计算，例如在NCBI网站可获得的BLASTn或BLASTp。如本文所用的，术语"癌症"指细胞在皮肤或身体器官中恶性或良性的新生长，例如但不限于在乳房、前列腺、肺、肾、胰腺、脑、胃或肠中。癌倾向于渗透到邻近组织并扩散(转移)到远处器官上，如转移到骨、肝、肺或脑中。本文所用的术语癌包括转移性肿瘤细胞类型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横紋肌肉瘤、和肥大细胞瘤)和组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、成胶质细胞瘤(gliobastoma)、原发性肝癌和卵巢癌。本文所用的术语"B-细胞恶性肿瘤"包括一组疾病，其包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤，和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。它们是血液和造血器官的瘤性疾病。它们造成骨髓和免疫系统功能障碍，其使宿主对于感染和出血高度易感。如本文所用的，术语"生物利用率"指施用后药物或其他物质;f皮吸收或变得在生物活性位点上可利用的程度或速率。该性质依赖于许多因素，包括化合物的溶解性、肠中的吸收率、蛋白质结合和代谢的程度等。本领域技术人员将熟知各种生物利用率测试，例如在Egorin等人(2000)中描述的。在本申请中使用的术语"水溶性"指在水介质例如pH7.3的磷酸緩冲的盐溶液(PBS)中的溶解度。在后述实施例中给出了示例性的水溶性测定。本申请中使用的术语"麦克菌素生产菌林"指菌林，例如珍贵束丝放线菌(A/7rW仍M柳)和奇迹束丝方文线菌(A/mVwM)示例的野生型菌株，其培养在合适的务降下时生产麦克菌素，例如当用天然的起始物3-M-5-羟基苯甲酸饲喂时。如本文所用的，术语"后-PKS基因"指聚酮化合物的后-聚酮化合物合Sl^饰作用需要的基因，例如但不限于单加氧酶、O-曱基转移酶和氨甲酰基转移酶。特别的，在麦克菌素系统中，这些修饰基因包括附6dV/、附6dV、如本文所用的，术语"起始单元生物合成基因"指生产天然掺入的起始单元(3-M-5-羟基苯曱酸(AHBA))所需要的基因。特别地，在麦克菌素系统中，这些起始单元生物合成基因包括AfTA:(AHBA激酶)、爿^(aDHQ脱氢酶)、爿/fc(AHBA合成酶)、(氧化还原酶)、Pi7(磷酸酶)。其它生产AHBA的菌林也包括AHBA生物合成基因。本发明的化合物，例如式(I)的化合物，的可药用的盐包括由可药用的无机或有机酸或碱形成的常规的盐以及季铵酸加成盐。合适酸式盐的更特定的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸(palmoic)、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、7JC杨酸、富马酸、甲M酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氬磺酸、苹果酸、steroic、单宁酸等的盐。其他酸，如草酸，它们本身不是可药用的，可用于制备盐，所述盐用作为中间体获得本发明的化合物和它们的可药用的盐。合适的碱式盐的更特定实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N，-二节基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。本发明以后谈及本发明的化合物时包括式(I)的化合物及其可药用的盐。如本文中使用的，术语"18，21-二氢麦克菌素"和"麦克菌素II"(麦克菌素的二氢醌形式)是可互换的使用的。附图的简要描述图1:麦克菌素的生物合成的示意，显示第一个推定的无酶中间体、前麦克菌素和后-PKS加工为麦克菌素。附图中的PKS加工步骤的列表不21是意在代表事件的顺序。下列缩写用于簇中的特定基因AL0-AHBA加栽结构域；ACP-酰基栽体蛋白质；KS-p-酮基合酶；AT-酰基转移酶；DH-脱水酶；ER-埽酰还原酶；KR-p-酮基还原酶。附图2:前麦克菌素的后-PKS加工以产生麦克菌素的位点的说明。附图3:产生改造的菌林BIOT-3806的图示，其中，通过同源重组将质粒pLSS308整合到染色体中，导致w&Af基因中断。附图4:构建实施例2中描述的附6cM符合读框地缺失的图示。附图5:A-显示了PCR产物PCRwv308的序列，SEQIDNO:16。B-显示了PCR产物PCRwv309的序列，SEQIDNO:19。附图6:A-显示了如实施例3中描述的，由附6cAf中符合读框地缺失502个氨基酸获得的DNA序列(SEQIDNO:20和21)，关键1-21bp编码3-tt-5-羟基苯甲酸生物合成的磷酸酶的3，端，136-68bp编码mbcM缺失蛋白，161-141bp编码mbcF的3，端。B-显示了蛋白质的M紗列(SEQIDNO:22)。蛋白质序列是自附图6A中显示的互补链产生的。附图7:产生珍贵束丝放线菌菌林的图示，其中，已经符合读框地缺失了附k尸、mbcP450、附6cAf77和附6dV/r2基因。附图8:扩增的PCR产物l+2a的序列(SEQIDNO:25)。附图9:扩增的PCR产物3b+4的序列(SEQIDNO:28)。附图10:实施例中生产的化合物(14-20)的结构。发明描述如上所述，本发明提供了18,21-双脱氧麦克菌素类似物，制备这些化合物的方法，和在医学中使用这些化合物的方法，和这些化合物作为中间体或模板，用于进一步半合成衍生作用或通过生物转化方法的衍生作用的用途。合适的Ri代表H或OH。在一个实施方案中，Ri代表H。在另一个实施方案中，Rj代表OH。合适的R2代表H。合适的R3代表CONH2。在一个实施方案中，合适的R4和Rs—起代表键。在另一个实施方案中，合适的R4和Rs各代表H。在一个示例的化合物集合中，R6、R7和Rs都代表氢。在另一个示例的化合物集合中，R6、R7和R8不都代表氢。在一个实施方案中，Ri代表H，R2代表H,R3代表CONH2、以及R4和Rs^f义表H。在另一个实施方案中，Ri代表OH，R2代表H，R3代表CONH2、以及R4和Rs各代表H。在本发明的一个合适的实施方案中，R,代表H，R2代表H,议3代表CONH2、R4和Rs^R表H，R6、R7和Rs^f戈表H。在本发明的一个合适的实施方案中，Ri代表OH，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs^R表H，R6、R7和Rs^^表H。在本发明的一个合适的实施方案中，Ri代表H，R2代表H,R3代表CONH2，R4和Rs各代表H,R6代表F，以及R7和Rs各代表H。在本发明的另一个合适的实施方案中，！^代表OH，R2代表H，R3代表CONH2，Rt和Rs各代表H，R6代表F，以及R7和Rs各代表H。在本发明的另一个合适的实施方案中，Ri代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各代表H，R6代表H，R7代表F和Rs代表H。在本发明的另一个合适的实施方案中，R，代表OH，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs^^表H，R6代表H，R7代表F和Rg代表H。在本发明的另一个合适的实施方案中，Ri代表H，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各代表H,R6和R各代表F和Rs代表H，如下列结构中表示的实例。在本发明的另一个合适的实施方案中，R，代表OH，R2代表H，R3代表CONH2，R4和Rs各代表H，R6和R7各代表F和Rs代表H。在本发明的另一个合适的实施方案中，R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2,R4和Rs各代表H，R6、R7和Rs^f戈表F。下列附图1和2中显示了非氢侧链相对于柄型环(ansaring)的优选的立体化学(也就是说优选的立体化学遵循麦克菌素的立体化学)。本发明还提供18，21-双脱氧麦克菌素类似物作为底物，用于通过生物转化或通过合成化学进行其它修饰的用途。在一个方面，本发明提供了用作为药物的18,21-双脱氧麦克菌素类似物。在另一个实施方案中，本发明提供了18，21-双脱氧麦克菌素类似物，其用在治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗。在另一个方面，本发明提供了18，21-双脱氧麦克菌素类似物在制备药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了18,21-双脱氧麦克菌素类似物在制备用于治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤、疾疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或癌症的预防性预治疗的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的18,21-双脱氧麦克菌素类似物。如上所述，可以预期本发明的化合物可用于癌症和/或B-细胞恶性肿瘤的治疗。本发明的化合物在其它适应证的治疗中也是有效的，例如但不限于疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎或作为癌症的预防性预治疗。中枢神经系统疾病和神经变性疾病包括但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、朊病毒病、脊髓和延髓性肌萎缩(SBMA)和肌萎缩性脊髓侧索石更化(ALS)。依赖血管发生的疾病包括但不限于，年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和多种其它眼病、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。自身免疫病包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、全身性红斑性狼痴和银屑病。"患者"涵盖人类和其它动物(特别是哺乳动物)对象，优选的人对象。相应的本发明的18，21-双脱氧麦克菌素类似物的方法和用途是在人医学和兽医学中的用途，优选的人类医学。上述本发明的化合物或其制剂可通过任何常规方法施用，例如但不限于，肠胃外(包括静脉内给药)、口服、局部(包括口腔、舌下或经皮)、通过医疗^殳备(如支架)、通过吸入或经注射(皮下或肌内)的施用。治疗可由单次剂量或一段时间的多次剂量构成。尽管本发明的化合物可以单独施用，但优选的将它与一种或多种可接受的稀释剂或载体一起，以药物制剂提供。因此，提供了药物组合物，其包含本发明的化合物，和一种或多种可药用的稀释剂或载体。稀释剂或载体必须是"可接受的"，含义是与本发明的化合物相容并且对其接受者无害。25合适的载体例子在以下将更详细地描述。本发明的化合物可单独或与其他治疗剂共施用。共施用两种(或更多)物质可以允许显著降低每种使用的剂量，由此减少可见的副作用。它还可允许疾病例如癌症，对已经产生耐受性的在先治疗效果复敏。其还提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和其它治疗剂，以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。在另一方面，本发明提供了本发明的化合物在与第二种物质的联合疗法中的用途，所述第二种物质例如用于治疗癌症或B细胞恶性肿瘤的第二种物质如细胞毒剂或细胞生长抑制剂。在一个实施方案中，本发明的化合物与另一种治疗剂共施用，所述另一种治疗剂例如用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤的治疗剂如细胞毒剂或细胞生长抑制剂。示例性的其它物质包括细胞毒剂，例如烷化剂和有丝分裂抑制剂(包括拓朴异构酶II抑制剂和微管蛋白抑制剂)。其它示例性的其它物质包括DNA结合剂、抗代谢物和细胞生长抑制剂，例如蛋白激酶抑制剂和酪氨酸激酶受体阻断剂。合适的物质包括但不限于，氨甲蝶呤、亚叶酸(Leukovorin)、泼尼松(prenisone)、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、多柔比星(doxorubicin)(亚德里亚霉素)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2单克隆抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)，商标名HerceptinTM)、卡培他滨(capecitabine)、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂(例如吉非替尼(gefitinib)，商标名lressa⑧、埃罗替尼(erlotinib)，商标名TarcevaTM、西妥昔单抗(cetuximab)，商标名ErbituxTM)、VEGF抑制剂(例如贝伐珠单抗(bevacizumab),商标名AvastinTM)以及蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib)，商标名VelcadeTM)。其它合适的物质包括但不限于常规化疗药物如顺铂(cisplatin)、阿糖胞苷、环己基氯乙基亚硝基脲、吉西他滨、异环磷酰胺(ifosfamid)、曱酰四氢叶酸(leucovorin)、丝裂霉素、米托蒽醌(mitoxantone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、包括紫杉醇(taxol)在内的紫杉烷类和长春地辛(vindesiiie);激素疗法；单克隆抗体疗法例如西妥昔单抗(抗-EGFR);蛋白激酶抑制剂如达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib);组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如伏立诺他(vorinostat);血管发生抑制剂如舒尼替尼(simitinib)、索拉非尼(sorafenib)、来那度胺(lenalidomide);mTOR抑制剂如坦西莫司(temsirolimus);以及伊马替尼(imatinib)，商标名为Glivec⑧。另外，本发制剂可以方^f更地以单位剂型存在并且可以通过药学领域的任何众知方法制备。此类方法包括使活性成分(本发明的化合物)与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，制剂通过使活性成分与液体载体或精细^t的固体栽体或这两者均一和紧密地结合，并且随后根据需要使产物成型而制备。本发明的化合物通常经口地或通过任何肠胃外途径以包含活性成分的药物制剂形式，任选地以无毒的有机或无机酸或碱、加成盐的形式，以可药用的剂型进行施用。根据待治疗的疾病和患者，以及施用途径，该组合物可以以变动的剂量施用。例如，本发明的化合物可以经口地、口含地或舌下地以可含有调味剂或着色剂的片剂、胶嚢剂、胚珠制剂(ovules)、酏剂、溶液剂或混悬剂形式施用，用于立即、延迟或受控释放应用。此类片剂可以含有赋形剂(如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钩、磷酸氢钙和甘氨酸)，崩解剂(如淀粉(优选玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂硅酸盐)，和颗粒化粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。相似类型的固体组合物也可以作为填充剂应用于明胶胶嚢中。在这个方面的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和/或酏剂，本发明的化合物可以与多种甜"木剂或调味剂、着色物质或染色剂、与乳化剂和/或助悬剂以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油以及其组合进行合并。片剂可以通过压缩或模制，任选地连同一种或多种辅助成分而产生。压制片剂可以通过在合适的机器中压缩处于自由流动形式(如粉末或颗粒)下的活性成分而制备，其中所述活性成分任选地与粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或*剂混合。模印片可以通过在合适的机器中模压以惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物而制备。片剂可以任选地包衣或刻痕并且可以如此进行配制，使用例如旨在提供所需释放模式的变动比例的羟丙基甲基纤维素而使得片剂的活性成分緩慢释放或受控释放。适于经口施用的本发明制剂可以作为不连续的单元如胶嚢剂、扁嚢剂或片剂(每个单元含有预定量的活性成分)；作为散剂或颗粒剂；作为在含水液体或非含水液体中的溶液剂或混悬剂或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂而存在。活性成分还可以作为大丸剂、煎膏剂或糊剂而存在。适于局部施用于口中的制剂包括在调味基材(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分的锭剂；在惰性基材如明胶及甘油或者蔗糖及阿拉伯胶中包含活性成分的软锭剂；和在合适液体载体内包含活性成分的漱口剂。应当理解除了以上具体提到的成分之外，本发明的制剂可以包括与所讨论的制剂类型有关的本领域内常用的其它制剂，例如，适于经口施用的那些制剂可以包括调味剂。适应于局部施用的药物组合物可以配制为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、浸渍敷料、喷雾剂、气雾剂或油剂、透皮装置、撒粉剂等。这些组合物可以经常规方法制备，含有活性物质。因此，它们还可以包含相容性常规栽体和添加剂，如防腐剂、辅助药物渗透的溶剂、乳膏剂或软膏剂中的软化剂以及用于洗剂的乙醇或油醇。此类载体可以占组合物的约1。/。至多到约98%。更通常地，它们将形成組合物的至多到约80%。仅作为说明，乳膏剂或软骨剂通过如此方式制备，即混合足量的亲水性材料与水(含有重量约5-10。/。的化合物)以产生具有所需稠度的乳膏剂或软骨剂。适应于透皮施用的药物组合物可以作为分立的贴剂而存在，其中所述的贴剂意图保持与受者表皮的紧密接触延长的时间段。例如，活性物质可以通过离子电渗疗法自贴剂中送递出来。对于应用于外部组织，例如口和皮肤，组合物优选地作为局部用软膏剂或乳膏剂施加。当配制在软膏剂中时，活性物质可以随石蜡或水混溶性软膏剂基质一起应用。另外，活性物质可以随水包油乳膏剂基质或油包水基质配制在乳膏剂中。对于肠胃外施用，流体单位剂型使用活性成分和无菌运载体进行制备，其中所述的运载体例如是但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油，优选是水。才艮据所用的运载体和浓度，活性成分可以悬浮或溶解于运载体中。在制备溶液剂中，活性成分可以溶解在注射用水中并且在装填至合适的小瓶或安瓿前过滤消毒并密封。有利地，物质如局麻药、防腐剂和緩冲剂可以溶解于运载体中。为增强稳定性，组合物可以在装填至小瓶后冷冻并且将水在真空下除去。干燥的冻干粉末随后密封于小瓶内并且可以提供附带的注射用水小瓶以便在用前复水液体。肠胃外混悬剂以如溶液剂那样的基本相同方式制备，除了活性成分悬浮而不非溶解在运栽体中并且消毒不能通过过滤进行。活性成分可以在悬浮于无菌运载体中之前通过暴露于环氧乙垸得到消毒。有利地，可以在组合物中包括表面活性剂或润湿剂以促进活性成分均匀分布。本发明的化合物也可以使用本领域已知的医学装置施用。例如，在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以用无针头的皮下注射装置，如在U.S.5,399,163;U.S.5,383,851;U.S.5,312,335;U.S.5,064,413;U.S.4,941,880;U.S.4，7卯，824或U.S.4,596,556中公开的装置而施用。用于本发明中的众所周知的植入物和计量单元(module)的实例包括US4，487，603，其7>开了用于以受控速率分配药物的可植入性微量输注泵；US4,486,194，其^Hf了用于施用药物穿过皮肤的治疗装置；US4,447,233，其公开了用于以精确输注速率送递药物的药物输注泵；US4,447,224，其公开了用于连续性药物送递的流量可变的可植入输注装置；US4,439,196，其公开了具有多腔室容器的渗透性药物送递系统；以及US4,475,196,其公开了渗透性药物送递系统。众多的其它装置如植入物、送递系统和计量单元是本领域技术人员已知的。本发明化合物的待施用剂量将根据特定化合物、所涉及疾病、受试者和疾病性质及严重性以及受试者的身体状况，和选择的施用途径而变化。适合的剂量可以毫不费力地由本领域技术人员确定。组合物可以含有0.1%重量、优选5-60%、更优选10-30%重量的本发明4匕合物，这取决于施用的方法。本领域技术人员会认识到本发明化合物的最佳量和单个剂量的间隔期将由正在治疗的病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位和正在治疗的具体受试者的年龄和条件决定，并且内科医生将最终确定待使用的合适剂量。这个剂量可以根据需要经常地重复使用。如果出现副作用，该剂量的量和/或频率可以按照正常临床惯例加以改变或降4氐。在另一个方面，本发明提供了生产18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法。可以认为麦克菌素以两个阶段进行生物合成。在第一个阶段，核心-PKS基因通过简单的羧酸前体的重复装配(以产生聚酮化合物链)来装配大环内酯核，所述大环内酯核然后环化形成第一个无酶中间体"前-麦克菌素"，参见附图1。在第二个阶段，一系列"后-PKS"剪裁酶(tailoringenzyme)(例如，P450单加氧酶、甲基转移酶、FAD-依赖性加氧酵和氨曱酰基转移酶)作用将多个其它基团添加到前麦克菌素模板上，获得最终的母体化合物结构，参见附图2。可以用类似的方式生物合成18，21-双脱氧麦克菌素30类似物。可以通过生物转化(任选地结合合适的生产菌抹的遗传改造)来开发该生物合成生产，来获得新型化合物的生产。特别的，本发明提供了生产18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)4^供第一个宿主菌林，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素或类似物；b)向所述菌林饲喂非天然的起始酸；c)在用于生产18,21-双脱氧麦克菌素类似物的合适的条件下培养所述菌林；和d)任选地分离所生产的化合物。本方法可以额外地包括步骤e)缺失或灭活一个或多个起始单元生物合成基因或其同源物，所述步骤通常在步骤c)前发生，和/或方法还可以包括步骤f)缺失或灭活一个或多个后-PKS基因，所述步骤通常在步骤c)前发生。在步骤a)中，"生产麦克菌素或其类似物的宿主菌林"意指当培养在合适的条件下时，生产麦克菌素或被R,-Rs的定义涵盖的那些麦克菌素类似物特别是18,21-双脱氧麦克菌素类似物的菌林。适当的条件(和步骤(c)中的合适的条件)包括提供合适的起始饲喂物(feed)和合适组成的生长培养基(其是本领域技术人员已知的，或实际上可以通过已知方法来确定)。合适的，非天然起始饲喂物是取代的苯曱酸(不是3-氨基-5-羟基-苯甲酸这一天然的起始酸)。最合适的非天然起始饲喂物是3-i^-苯甲酸，其中苯环任选地被1-3个氟原子取代。在合适的实施方案中，非天然起始酸饲喂物是3-氨基苯曱酸。在另一个合适的实施方案中，非天然起始酸饲喂物是氟苯曱酸。在另一个合适的实施方案中，非天然起始酸饲喂物是5-M-3-氟苯曱酸。31在另一个合适的实施方案中，非天然起始酸饲喂物是5-氨基-2，3-二氟苯甲酸。在另一个合适的实施方案中，非天然起始酸饲喂物是5-氨基-2，3，6-三氟苯曱酸。本领域技术人员将理解，存在可以被饲喂给宿主菌抹来生产相同的化合物的备选的非天然起始单元，例如但不限于取代的苯甲酸的甲酯、乙酯、N-乙酰-半胱胺^P危代酸酯，以及适当活化用于掺入的生物合成中间体的diketide类似物，例如N-乙酰-半胱胺石克代酸酯。在本发明的第一个实施方案中，宿主菌林是麦克菌素生产菌林。在备选的实施方案中，宿主菌株是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了一个或多个起始单元生物合成基因。在另一个实施方案中，宿主菌林是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌抹，其中已经缺失或灭活了一个或多个后-PKS基因。例如，宿主菌林可以是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了附6cM和任选地其它后-PKS基因。特别地，宿主菌林可以是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌抹，其中已经缺失或灭活了mbcM。可选地，宿主菌林可以是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌株，其中已经缺失或灭活了附6cAf、附6cMT7、拊6dWT2、附6c户和/m6c/W5(。合适的，将选择性的缺失或灭活一个或多个起始单元生物合成基因和/或后-PKS基因。在另一个实施方案中，通过将DNA整合到基因中，使得不生产功能性蛋白质，来在所述被改造的菌林中灭活一个或多个起始单元生物合成基因或后-PKS基因灭活。在备选的实施方案中，通过产生一个或多个靼向缺失，在所述被改造的菌林中缺失一个或多个所述起始单元生物合成基因或后-PKS基因。在另一个实施方案中，通过定点突变在所述被改造的菌林中灭活一个或多个起始单元生物合成基因或后-PKS基因。在另一个实施方案中，对麦克菌素生产宿主菌林进行诱变(化学或UV的)，并且挑选出修饰的菌林，所述菌林中一个或多个起始单元生物合成酶或后-PKS酶没有功一个或多个起始单元生物合成基因或后-PKS基因表达的调节子的突变，本领域技术人员将理解，调节子的缺失或灭活也可以产生与基因缺失或灭活相同的结果。在另一个实施方案中，向上述其中已经缺失或灭活了一个或多个后-PKS基因的被改造的菌抹中重新引入了一个或多个相同的后-PKS基因，或它的来自可选的麦克菌素生产菌林的同源物。在另一个实施方案中，用来自异源PKS簇的一个或多个后PKS基因补充其中已经缺失或灭活了一个或多个基因的被改造的菌抹，所述异源PKS簇包括但不限于指导利福霉素、安丝菌素、格尔德霉素或除莠霉素的生物合成的簇。选择性缺失或灭活后PKS基因的方法包括(i)基于目标基因的同源物(例如，来自利福霉素、格尔德霉素或除莠霉素生物合成簇和/或其它可获得的序列)设计简并寡聚物，通过在PCR反应中使用这些引物从合适的麦克菌素生产菌抹中分离目标基因的内部片段，(ii)将含有该片段的质粒通过同源重组整合到相同或不同的麦克菌素生产菌林中，导致耙向基因的中断，(iii)在适合麦克菌素类似物(例如18,21-双脱氧麦克菌素类似物)生产的条件下培养如此生产的菌林。在特定的实施方案中，步骤(i)中的麦克菌素生产菌林是奇迹束丝放线菌(v4"/"，""e附ff附/,m附)/mV"m附)。在另一个特定的实施方案中，步骤(ii)中的麦克菌素生产菌林是珍贵束丝放线菌(A/7"ftVw"附)。本领域技术人员将理解，可以使用上述方法的备选方法来获得等价的菌林，例如可以使用简并的寡聚物从任何麦克菌素生产菌林中扩增目标基因，所述菌抹例如但不限于珍贵束丝放线菌或奇迹束丝放线菌可以i殳计不同的简并寡聚物，其将从麦克菌素生产者或生产其同源物的菌林中，成功的扩增后-PKS基因或其同源物的合适区域。33可以使用珍贵束丝放线菌菌林的基因序列产生对珍贵束丝放线菌的基因特异的寡聚物，然后可以从任何麦克菌素生产菌(例如珍贵束丝放线菌或奇迹束丝放线菌)中扩增内部片段。可以与同源基因的序列一起使用珍贵束丝放线菌菌林的基因的序列来产生对珍贵束丝放线菌的基因简并的寡聚物，然后可以从任何麦克菌素生产菌抹(例如珍贵束丝放线菌或奇迹束丝放线菌)中扩增内部片段。附图2显示了麦克菌素生物合成蔟中的后-PKS基因的活性。因此，本领域技术人员将能够鉴别需，失或灭活的额外的后-PKS基因，从而实现生产目标化合物的菌林。在这些系统中可以观察到，当产生这样的菌抹时可以生产一种以上的18,21-双脱氧麦克菌素类似物，所述菌林中一个或多个后-PKS基因没有功能(作为描述过的方法之一包括灭活或缺失的结果)。本领域4支术人员将理解该做法有多种可能的理由。例如，存在后-PKS步骤的优选顺序，去除单个活性导致在对于所涉及的酶而言非天然的底物上执行所有后续步骤。由于对于呈递至后-PKS酶上的新底物效率的降低，其可以导致中间体在培养肉汤中积累，或者，可能由于步骤顺序已经改变，不再是剩余酶的底物的产物被分流。本领域技术人员将理解，通过利用生长条件的变化，可以操^混合物中观察到的化合物的比例。本领域技术人员将理解，在生物合成簇中，一些基因是组织在操纵子中的，一个基因的中断通常将影响同一操纵子中的后续基因的表达。当观察到化合物的混合物时，可以容易的使用标准技术来分离，一些技术描述在下列实施例中。可以通过本文中描述的一些方法筛选18，21-双脱氧麦克菌素，在当单个化合物表现出有利的性质的情况下，可以改造菌林使得该化合物优选。在不常见却也并非不可能的情况下，可以产生中间体，然后将其生物转化来生产需要的化合物。34本发明提供了新的麦克菌素类似物，其是通过来自麦克菌素PKS基因簇中一个或多个后-PKS基因的选择性缺失或灭活来产生的。特别地，本发明涉及新的18,21-双脱氧麦克菌素类似物，其通过向麦克菌素生产菌林饲喂非天然的起始单元，任选地结合来自麦克菌素PKS基因簇中一个或多个后-PKS基因的选择性的缺失或灭活来产生。本领域技术人员将理解，导致基因产物无功能并不需要完全缺失基因，因此，本文中使用的术语"缺失或灭活"涵盖了任何导致基因产物无功能的方法，包括但不限于缺失完整的基因、缺失基因的一部分、耙基因中的插入灭活、导致基因不表达或表达产生失活蛋白质的定点诱变、导致基因不表达或表达产生失活蛋白质的宿主菌抹诱变(例如，通过放射或暴露给诱变化学物、原生质体融合或转座子诱变)。可选的，可以用抑制剂化学的损伤活性基因产物的功能，例如甲基双吡啶丙酮(metapyrone)(备选名称2-曱基-l,2-双(3-吡咬基-l-丙酮)，EP0627009)和嘧咬醇是加氧酶的抑制剂，可以在生产培养基中添加这些化合物来产生类似物。此外，西奈芬净是甲基转移酶抑制剂，可类似的使用但是用于在体内抑制甲基转移酶活性(McCammon和Parks1981)。在可选的实施方案中，可以缺失或灭活所有的后-PKS基因，然后可以通过补充作用(complementation)(例如，在附着位点处、在自我复制的质粒上或通过插入到染色体的同源区域)重新引入一个或多个基因。因此，在特定的实施方案中，本发明涉及产生18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌林，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素；b)任选地选择性的缺失或灭活所有的后-PKS基因，c)向所述菌林饲喂非天然的起始单元，d)在用于生产18,21-双脱氧麦克菌素类似物的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和e)任选地分离所生产的化合物。在可选的实施方案中，重新引入一个或多个缺失的后-PKS基因。在另一个实施方案中，重新引入了1个或多个后-PKS基因，其选自附&AT、附6dV、附6c户、附6dWT7、附6cA/T2和附6c/V5。。在另一个实施方案中，重新引入了2个或多个后-PKS基因，其选自附6cAf、附6dV、附6c尸、附6cMT7、附6cMD和附6ci^50。在另一个实施方案中，重新引入了3个或多个后-PKS基因，其选自淤6cAf、附6dV、附Ac户、/w6ciWT7、附6dWT2和附6c尸450。在另一个实施方案中，重新引入了4个或多个后-PKS基因，其选自w6dkf、附6c7V、附6c尸、/wkA/T7、附6cA/T2和附6c7M5。。在另一个可选的实施方案中，重新引入了5个或多个后-PKS基因，其选自附6cM、附6c7V、附6c尸、附6cMT7、柳6dWT2和附6c/V50。任选地，可以合适的引入来自其它PKS生物合成蔟(例如但不限于格尔德霉素或除莠霉素途径)的基因。此外，对本领域技术人员是显而易见的，可以缺失或灭活后-PKS基因的子集，并且任选地重新引入所述后-PKS基因的更小的子集，从而得到这样的菌林，其在饲喂非天然的起始单元时生产18,21-双脱氧麦克菌素类似物。因此，在优选的实施方案中，本发明涉及产生18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌林，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素；b)选择性的缺失或灭活附6cM，c)向所述菌林饲喂非天然的起始单元，d)在用于生产18，21-双脱氧麦克菌素类似物的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和e)任选地分离所生产的化合物。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及产生18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌林，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素；b)选择性的缺失或灭活附6dVf和m^/M5仏c)任选地选择性的缺失或灭活其它后-PKS基因d)向所述菌林饲喂非天然的起始单元，e)在用于生产18，21-双脱氧麦克菌素类似物的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和f)任选地分离所生产的化合物。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及产生18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌林，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素；b)选择4生的缺失或灭活附&Af、附6cM77、附6cMr2、附6c尸和附6c/^5Cc)任选地选择性的缺失或灭活其它后-PKS基因或起始单元生物合成基因d)向所述菌林饲喂非天然的起始单元，e)在用于生产18,21-双脱氧麦克菌素类似物的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和f)任选地分离所生产的化合物。本领域技术人员普遍已知，聚酮化合物基因簇可以在异源宿主中表达(Pfeifer和Khosla，2001)。因此，本发明包括将麦克菌素生物合成基因簇转移到异源宿主中，所述基因簇具有或没有抗性和调节基因，此外是完整的或者含有缺失。可选地，可以将完整的麦克菌素生物合成簇转移到具有或没有抗性和调节基因的异源宿主中，其可以通过本文中描述的方法来操作，从而缺失或灭活一个或多个后-PKS基因或起始单元生物合成基因。如上所述用于转移此类大DNA片段的方法和载体是本领域普遍已知的(Rawlings，2001;Staunton和Weissman，2001)，或在本文公开的方法中提供。在本上下文中，优选的宿主细胞林是原核生物，更优选的是放线菌或大肠杆菌(￡^/^Wd/ff"//)，仍然更优选的包括但不限于奇迹束丝放线菌(A/mV"附)、珍贵束丝放线菌珍贵亚种、吸水链霉菌、吸水链霉菌物种(S.hygroscopicus.sp)、吸7jC链霉菌子嚢霉素变种(S.A,o，尸/面麼.fl^c麵j^WcMS)、筑波链霉菌(S^/7to附戸"s"A:"6"ms/s)、天蓝色链霉菌(5^e/7似附ycescoe//co/o/*)、变铅青链霉菌(5^印to附yc"//v/dflws)、糖多孢红霉菌(1S"cc^flro/7o(v5/wfl"&fwfl)、脆弱链霉菌(iS^e/7to附yces/rad/fle)、阿维链霉菌(S^印to附j;c^flrve/7m'"//s)、肉桂地链霉菌(&re;7M附j;c^c/"""附o"e"s/s)、龟裂链霉菌(5y"/;似附j;c"/7附mms)、白色链霉菌(S^^/7似附^c^y"/6"s)、灰褐链霉菌(S"印to附ycesgWseo/kycM5)、黄色长孢链霉菌(5V/*e/7to/j;c"/oMg/s/wrq/"VMS)、委内瑞拉链霉菌(5^rcpto附j;cesv^i^w/m)、白色链霉菌(&"/to附;;cesa/6"s)、孩吏单孢菌属物种(M/cTO附owos/wms尸.)、灰红孩史单孢菌(M/c7^/Mo"os/;omgr/seor"ft/rf")、地中海拟无枝酸菌(」附j;co/fl鄉s/s1附eWfem"")或游动放线菌属物种(^"/"印/朋essp.)N902-109。其它实例包括吸7jC链霉菌去势亚种(5^/7to柳j^s1/r殿royco/7/c附s"6sp.ge/da""s)和紫黑链霉菌(5^/7to考c^y在一个实施方案中，转移完整的生物合成簇。在备选的实施方案中，转移了完整PKS，其是没有任何相关的起始单元生物合成基因和/或后-PKS基因的。在其它实施方案中，转移完整的麦克菌素生物合成簇，然后根据本文描述进行操作。在本发明的可选的方面，还可以通过合适菌林的生物转化来处理本发明的18,21-双脱氧麦克菌素类似物。合适的菌林或者是可获得的野生型菌林，例如但不限于奇迹束丝放线菌、珍贵束丝放线菌珍贵亚种、吸水链霉菌、吸水链霉菌物种(S.hygrosc叩icussp.)。可选的，合适的菌林可以被改造，从而允许用特定的后-PKS酶生物转化，所述的后-PKS酶例如但不限于，那些由w6dkf、附6dV、附6c尸、附6cMT2、附6ci^/50(如本文中定义的)、g<//w7V、^/附Af、grf附l、^/附P、(Rascher等人，2003)格尔德霉素O-甲基转移酶、/^附7V、/i6附丄、/i6附户、(Rascher等人，2005)除莠霉素O-甲基转移酶和其它除莠霉素单加氧酶、m附7、fls附70、fls附//、fls附"、m/m"和"^m"(Cassady等人，2004，Spitdler等人，2003)所编码的。当基因尚需鉴别或序列尚未位于公众领域时，通过标准方法获得此类序列对本领域技术人员是常规的。例如，编码格尔德霉素O-甲基转移酶的基因序列不属于公众领域，但是本领域技术人员可以产生探针(使用相似的O-曱基转移酶来生产异源探针，或通过自可获得的同源基因设计简并引物来生产同源探38针)，以用于对格尔德霉素生产菌林进行Southern印迹，从而获得该基因来产生生物转化系统。在特定的实施方案中，菌林可以有一个或多个其天然的聚酮化合物簇被完整的或部分的缺失，或者失活，从而阻止所述天然的聚酮化合物簇生产的聚酮化合物产生。所述被改造的菌株可以选自，例如但不限于，奇迹束丝放线菌、珍贵束丝放线菌珍贵亚种、吸7jC链霉菌、吸K链霉菌物种(S.hygroscopicus.sp)、吸水链霉菌子嚢霉素变种、筑波链霉菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、糖多孢红霉菌、脆弱链霉菌、阿维链霉菌、肉桂地链霉菌、龟裂链霉菌、白色链霉菌、灰褐链霉菌、黄色长孢链霉菌、委内瑞拉链霉菌、微单孢菌属物种、灰红微单孢菌、地中海拟无枝酸菌或游动放线菌属物种N卯2-109。其它可能的菌林包括吸水链霉菌去势亚种和紫黑链霉菌。虽然上述本发明的制备18,21-双脱氧麦克菌素类似物的方法基本上或完全是生物合成的，但是并不排除通过包括标准合成的化学方法的方法来生产或相互转换本发明的18,21-双脱氧麦克菌素类似物。为了允许麦克菌素PKS基因簇的遗传操作，首先测序来自珍贵束丝放线菌珍贵亚种的基因簇，然而，本领域技术人员将理解有备选的生产麦克菌素的菌林，例如但不限于奇迹束丝放线菌。可以如在本文对于珍贵束丝放线菌珍贵亚种所述的，对来自这些菌株的麦克菌素生物合成基因簇测序，信息用于产生等价的菌林。本发明的其他方面包括-基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了附&M，以及任选地其它后-PKS基因，特别是其中已经缺失或灭活了附6cM的被改造的菌林，或者是其中已经缺失或灭活了附6dVf、附6dW77、附6dWT2、附^P和附6c/，450的被改造的菌林。合适的麦克菌素生产菌林是珍贵束丝放线菌或奇迹束丝^t线菌。-基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了附6cM,以及任选地其它后-PKS基因和/或起始单元生物合成基因，特别是其中已经缺失或灭活了W6dkf的被改造的菌林，或者是其中已经缺失或灭活了附6cM、/w6d^T7、/w6c3/r2、附6c尸和附6c^/50的被^tit的菌株。合适的麦克菌素生产菌林是珍贵束丝放线菌或奇迹束丝放线菌。-此类被改造的菌株在制备18，21-双脱氧麦克菌素类似物中的用途。发明的化合物的优点在于预期它们具有一个或多个下列性质与母体化合物相比，与Hsp卯的紧密结合、快速的与Hsp90的结合率、良好的抗一种或多种不同癌症亚型的活性；良好的毒理学特性例如良好的肝毒性特性、良好的肾毒性、良好的心脏安全性；良好的水溶性；良好的代谢稳定性；良好的制剂能力；良好的生物利用率；良好的药物动力学或药效学性质例如与Hsp90的紧密结合、快速的与Hsp90的结合率和/或良好的脑药物动力学；良好的细胞摄取；和低的与红细胞的结合。实施例一般方法培养物的发酵用于生长细菌菌林珍贵束丝方文线菌珍贵亚种ATCC31280(US4，315,989)和奇迹束丝放线菌DSM43827(KCCA-0225,Watanabe等，1982)的条件在专利US4,315,989和US4,187,292中描述。本文中所用方法改编自这些中并且如下用于在震摇培养箱内的管或烧瓶的肉汤里培养，在实施例中指出对已公开方案的改变。菌林在ISP2琼脂(培养基3，Shirling，E.B.和Gottlieb,D.，1966)上在28。C培育2-3天并且用来接种种子培养基(培养基l，见下文和US4,315,989和US4，187，292)。接种的种子培养基随后于5或2.5cm的抛距(throw)以200-300转/分钟震摇，在28。C孵育48小时。为产生麦克菌素、18，21-二氢麦克菌素和麦克菌素类似物如18，21-双脱氧麦克菌素类似物，将发酵培养基(培养基2,见下文和US4,315,989及US4,187,292)用2.5%-10%的种子培养物接种并于5或2.5cm的抛距以40200-300转/分钟之间的震摇，在26。C孵育6天(除了实施例中另外标明的)。随后收获培养物用于提取。培养基培养基1-种子培养基在1L蒸馏水中<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在121。C高压灭菌20分钟进行消毒。根据需要，在高压灭菌后添加安泊拉霉素以产生终浓度50mg/L。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>"Bacto"酵母提取物(蒂夫公司(Difco))20gKH2P0420gMgCl2.6H205gCaC03lg用NaOH调节的pH6.5在121°C高压灭菌20分钟进行消毒。培养基3-ISP2培养基在1L蒸馏水中麦芽提取物10g酵母提取物4g右旋葡萄糖(Dextrose)4g琼脂15g用NaOH调节的pH7.3在121。C高压灭菌20分钟进行消毒。培养基4-MAM在1L蒸馏水中小麦淀粉10g玉米浆固体(Cornsteepsolids)2.5g酵母提取物3gCaC033g42硫酸铁0.3g琼脂20g在121°C高压灭菌20分钟进行消毒。提取培养肉汤用于LCMS分析将培养肉汤(lmL)和乙酸乙酯(lmL)剧烈混合15-30分钟，然后离心10分钟。收集0.5mL的有机层，蒸发干燥，然后重溶于0.25mL的曱醇。LCMS分4斤流程使用LCMS方法1，在AgilentHP1100HPLC系统结合BrukerDaltonicsEsquire3000+电喷射质谱仪上，在阳离子和/或阴离子才莫式操作下来实施分析LCMS。LCMS方法1:可以在PhenomenexHyperclone柱上(C18BDS，3孩i米颗粒大小，150x4.6mm)实施色i普，在1mL/分钟的流速下洗脱，-使用下列梯度洗脱过程T=0，10%B;T=2，10%B;T=20，100%B;T=22，100%B;T=22.05，10%B;T=25，10%B。流动相A-水+0.1。/。曱酸；流动相8=乙腈+0.1%甲酸。在l卯和400nm之间记录UV谱，在210、254和276nm获得提取的色谱。在100和1500amu之间记录质谱。NMR结构i兌明方法在BrukerAdvance500分光计上，以298K,在500MHz和125MHz操作，分别对'H和。C记录NMR谱。使用标准的Bruker脉冲序列获得!H」HCOSY、APT、HMBC和HMQC谱。NMR谱可以用其所运行的溶剂中的剩余质子或标准碳共振作为参照。化合物纯度的评价可以使用描述的LCMS方法2分析纯化的化合物。LCMS方法2:在PhenomenexHypercloneC18BDS柱上(4.6x150mm,3孩支米颗粒大小)实施色谱，其中洗脱具有下述梯度水+0.1%甲酸:乙腈+0.1%曱酸，(90:10)至(0:100)，以lmL/分钟进行20分钟。通过MS在多波长下(210、254和276nm)评价纯度。所有的化合物在所有波长下>95%纯。最终通过H和13CNMR谱检查确定纯度。水溶性的评价可以按如下检测水溶性在室温下在100%DMSO中制备18，21-双脱氧麦克菌素类似物的10mM储液。将一式三份0.01mL等分试样，在安培(amper)瓶中用0.1MPBS，pH7.3溶液或100%DMSO补充到0.5mL。在黑暗中振荡所获得的0.2mM溶液，室温下在IKA⑧vibraxVXR振荡器上振荡6小时，然后将获得的溶液或悬浮液转移到2mLEp管中，在13200rpm离心30分钟。然后用如上所述LCMS方法1分析上清液的等分试样。抗癌活性的体外生物测定可以在实验胂瘤学研究所肿瘤检测/>司的肿瘤检测测试实验室(OncotestTestingFacility,InstituteforExperimentalOncology,OncotestGmbH，Freiburg)进行化合物的抗癌活性的体外评价，这是在一组人肿瘤细胞系中在单层增殖测定中进行。表l中总结了挑选的细胞系的特征。表l-测试细胞系#细胞系特征1CNXF498NLCNS2CXFHT29结肠3LXF1121L肺、大细胞ca4MCF-7乳腺、NCI标准20MEXF394NL黑素瘤6DU145前列腺-PTEN阳性Oncotest细胞系是按Roth等人，(1999)描述的从人肿瘤异种移植物中建立的。Fiebig等人，(1999)描述了供体异种移植物的起源。其它的细胞系是自NCI(DU145,MCF-7)获得的或自DSMZ公司(DSMZ)，Braunschweig,德国购买的。除非另作说明，所有的细胞系均在加湿的大气中(95%空气，5%C02)，4437。C下，在含有RPMI1640培养基、10%胎牛血清和0.1mg/mL庆大霉素(PAA，C61be，德国)的"即用混合(ready-mix)"培养基中生长。可以使用改良的硪化丙锭测定来评价测试化合物对人肿瘤细胞系的生长的影响(Dengler等人，(1995))。简而言之，通过胰酶消化从指数期培养物中收获细胞，计数并放置在96孔平底孩i量滴定板上，放置的细胞密度取决于细胞系(5-10,000活细胞/孔)。恢复24小时以允许细胞重新指数生长后，向孔内添加0.010mL的培养基(每个平板6个对照孔)或含有18，21-双脱氧麦克菌素类似物的培养基。每个浓度一式三份放置。化合物以五个浓度(100;10;1;0.1和0.01pg/mL)应用。在连续暴露4天后，用0.2mL的含7jC^化丙锭(PI)溶液(7mg/L)替换具有或没有测试化合物的细胞培养基。为了测量活细胞的比例，通过冷冻平板对细胞进行透化处理。在平板融化后，使用Cytofluor4000微量平板读数仪测量荧光(激发530nm,发射620nm),产生与活细胞总数的直接关系。用处理/对照xl00(%T/C)来表示生长抑制。这可以绘制成o/。T/C相对所使用的测试化合物的浓度的图，所述图随后用于计算抑制70%细胞生长(IC7G)所必需的浓度。实施例1-对麦克菌素PKS基因簇的测序基因组DNA使用Kieser等(2000)中所述的标准方案从珍贵束丝放线菌(ATCC31280)和奇迹束丝放线菌(DSM43827，ATCC29888)分离。DNA测序通过位于剑桥CB21QW的TennisCourt路的剑桥大学生物化学系的测序i殳备，4吏用标准方法实施。4吏用引物BIOSG1045'-GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3'(SEQIDNO:1)和BIOSG1055'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3'(SEQIDNO:2)，利用标准技术扩增来自吸水链霉菌NRRL3602(序列登录号AY179507)的格尔德霉素生物合成基因簇中的氨甲酰基转移酶编码基因^/wW。Southern印迹实验使用DIG试剂和用于非放射性核酸标记和检测的试剂盒根据制造商的说明书(罗切公司(Roche))实施。DIG标记的^/附7VDNA片段用作异源探针。使用^/附7V产生的探针和从珍贵束丝放线菌2112分离的基因组DNA,在Southern印迹分析中鉴定到大约8kbEcoRI片段。该片段采用标准方法被克隆至Litmus28并且通过菌落杂交法鉴定转化体。克隆p3被分离并对大约7.7kb插入片段测序。从克隆p3中分离的DNA用EcoRI和EcoRI/SacI消化并且分别分离在约7.7kb和在约1.2kb处的条带。标记反应才艮据制造商的方案实施。使用栽体SuperCos1和GigapacklllXL包装试剂盒(斯莱特因公司(Stratagene))根据制造商的说明书产生以上所提及两个菌株的黏粒文库。这两个文库使用标准方案加以篩选并且使用来自克隆p3的7.7kbEcoRI片段的DIG标记片段作为探针。黏粒52从珍贵束丝放线菌的黏粒文库中鉴定并提交至剑桥大学生物化学系测序设备进行测序。类似地，黏粒43和黏粒46从奇迹束丝放线菌的黏粒文库鉴定。这三种黏粒如Southern印迹分析所示均含有7.7kbEcoRI片段。黏粒43的PKS区的约0.7kbp片段使用引物BIOSG1245'-CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3'(SEQIDNO:3)和BIOSG1255-GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3'(SEQIDNO:4)采用标准方案扩增、克隆并且用作探针对珍贵束丝放线菌祐粒文库筛选重叠克隆。黏粒52的序列信息也用来产生用于筛选珍贵束丝放线菌黏粒文库的衍生自DNA片段的探针，其中所述的DNA片段由引物BIOSG1305-CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG画3'(SEQIDNO:5)和BIOSG1315,-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-3(SEQIDNO:6)以及mOSG1325-GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-3'(SEQIDNO:7)和BIOSG1335'-GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3，(SEQIDNO:8)扩增。分离黏粒311和352并且将黏粒352送交测序。黏粒352含有与黏粒52的大约2.7kb重叠区。为筛选其它黏粒，使用引物BIOSG1365'-CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGGCTGC-3，(SEQIDNO:9)和BIOSG1375'画CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGCACAGCGAG-3，(SEQIDNO:10)和黏粒311作为模板，采用标准方案扩增大约0.6kbPCR片段。筛选珍贵束丝放线菌的黏粒文库并分离縣粒410。黏粒410与祐粒352重叠大约17kb并将黏粒410送交测序。将三个重叠黏粒(黏粒52、縣粒352和黏粒410)的序列装配起来。测序的区域覆盖约100kbp并且鉴定可能构成麦克菌素生物合成基因簇的23个可读框。每个可读框在SEQIDNO:ll中的位置在表3显示。表2-|*粒的总结糾立菌林黏粒43奇迹束丝放线菌ATCC29888黏粒46奇迹束丝》文线菌ATCC29888黏粒52珍贵束丝方文线菌ATCC31280黏粒311珍贵束丝it线菌ATCC31280黏粒352珍贵束丝放线菌ATCC31280糾立410珍贵束丝》欠线菌ATCC31280表3-后-PKS基因和起始单元生物合成基因的每个可读框的位置SEQIDNO:11中的核苦酸位置基因名称所编码蛋白质的功能14925-17909*mbcRII转录调节物18025-19074cmbcO氨基氢化奎尼酸(Aminohydroquinate)合酶19263-20066c*mbc未知，AHBA生物合成47<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>实施例2-产生菌林BIOT-3806:珍贵束丝放线菌菌林，其中的^/附M同源物柳c6AT已经初C质粒的插入所中断附图3中显示了pLSS308构建的概况。2.1质粒pLSS308的构建使用VectorNTI序列比对程序比对了来自吸水链霉菌菌林NRRL3602(AY179507)的格尔德霉素生物合成基因簇的gdmM基因，和来自地中海拟无斗支酸菌(AF040570AF040571)的利福霉素生物合成基因蔟的orfl9的DNA序列。该比对鉴别了适合简并寡聚物设计的同源性区域，所述寡聚物用于从奇迹束丝放线菌(BIOT-3134;DSM43827;ATCC29888)中扩增同源基因的片段。简并寡聚物是FPLS1:5，ccscgggcgnycngsttcgacngygag3，；(SEQIDNO:12)FPLS3:5，cgtcncggannccggagcacatgccctg3，；(SEQIDNO:13)其中N二G，A，T或C;Y-C或T;S-G或CPCR扩增的才莫板是奇迹束丝放线菌黏粒43。上述实施例1中描述了黏粒43的产生。使用黏粒43作为模板和TaqDNA聚合酶，在标准PCR反应中，使用寡聚物FPLS1和FPLS3从奇迹束丝^t线菌中扩增^/附3f同源物的内部片段。将获得的793bpPCR产物克隆到用Smal线性化的pUC19中，获得质粒pLSS301。假设扩增的序列是来自奇迹束丝放线菌的麦克菌素簇的附cM/基因。用E^RI/历Vidl1消化质粒pLSS301,将片段克隆到已经用五^RI/好/mmi消化的质粒pKC1132中(Bierman等人，1992)。获得的质粒纟皮命名为pLSS308，是抗阿泊拉霉素的并包含奇迹束丝放线菌的附6cM基因的内部片段。492.2珍贵束丝放线菌珍贵亚种的转化携带质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567用pLSS308通过电穿孔法转化以产生用于接合的大肠杆菌供体菌林。这种菌林用来通过营养接合(Matsushima等，1994)而转化珍贵束丝放线菌珍贵亚种。接合后体涂布在培养基4上并在28°C温育。平板在24小时后铺50mg/L安泊拉霉素和25mg/L萘啶酮酸。因为pLSS308不能够在珍贵束丝放线菌珍贵亚种中复制，预期任意安泊拉霉素抗性菌落是含有质粒的转化体，其中所述的质粒通过同源重组借助质粒来源的/wcMf内部片段整合至染色体的mbcM基因(图3)。这产生位于染色体上的mbcM基因的两个截短型拷贝。转化体通过PCR分析予以证实并将扩增片段测序。将菌落涂斑(patch)在培养基4(含有50mg/L安泊拉霉素和25mg/L萘咬酮酸)上。来自每个菌斑(patch)的6mm环状填块(circularplug)用来接种含有10mL种子培养基(培养基1的变型-2%葡萄糖，3%可溶性淀粉，0.5%玉米浆固体，1%豆粉，0.5%胨，0.3%氯化钠，0.5。/。碳酸钩)夕卜加50mg/L安泊拉霉素的分别的50mL福尔肯(Falcon)管。这些种子培养物在28。C以5cm抛距200转/分钟孵育2天。它们随后用来接种(5。/。v/v)发酵培养基(培养基2)并且在28°C生长24小时及随后在26°C生长另外5天。代谢产物从这些培养物中根据上文所述标准方案提取。通过HPLC使用上文所述标准方案对样品评估麦克菌素类似物的产生。所选择的生产性分离林命名为BIOT-3806。2.3从BIOT-3806中鉴别化合物如一般方法中描述的^f吏用LCMS方法1分析样品。表4-LCMC鉴别的化合物化合物保留时间(分钟)[M+Na+[M画H-质量1411.4525.2501.2502159.7541.1517.1518A8.6506.1482.1483B9.3539.2515.1516C10.9543.1519.252050实施例3-产生BIOT-3870:珍贵束丝放线菌菌株，其中的^/附3f的同源物附6dV/具有符合读框地缺失3.1克隆与附6c3/下游侧翼区域同源的DNA使用黏粒52(来自实施例1)作为模板和PfuDNA聚合酶，使用寡聚物BV145(SEQIDNO:14)和BV146(SEQIDNO:15)，在标准的PCR反应中从珍贵束丝放线菌(ATCC31280)中扩增1421bp的DNA区域。在每个寡聚物中都设计了5'延伸，来引入限制性位点，帮助扩增片段的克隆(附图4)。扩增的PCR产物(PCRwv308，SEQIDNO:16，附图5A)编码附6cM的3'端的33bp，和下游同源的另外1368bp。将该1421bp片段克隆到已经用线性化的pUC19中，获得质粒pWV308。BV145Spel~~(SEQIDNO:14)BV146ATATCCTAGGCTGGTGGCGGACCTGCGCGCGCGGTTGGGGTGAvrII(SEQIDNO:15)3.2克隆与附6cM上游侧翼区域同源的DNA使用黏粒52(来自实施例1)作为模板和PfuDNA聚合酶，使用寡聚物BV147(SEQIDNO:17)和BV148(SEQIDNO:18),在标准的PCR反应中从珍贵束丝放线菌(ATCC31280)中扩增1423bp的DNA区域。在每个寡聚物中都设计了5'延伸，来引入限制性位点，帮助扩增片段的克隆(附图4)。扩增的PCR产物(PCRwv309，SEQIDNO:19，附图5B)编码附&M的5，端的30bp，和下游同源的另外1373bp。将该1423bp片段克隆到已经用线性化的pUC19中，获得质粒pWV309。BV147ATATCCTAGGCACCACGTCGTGCTCGACCTCGCCCGCCACGCAvrII(SEQIDNO:17)BV148ATATTCTAGACGCTGTTCGACGCGGGCGCGGTCACCACGGGCXbal(SEQIDNO:18)51将产物PCRwv308和PCRwv309以相同方向克隆到pUC19中，从而利用pUC19多聚接头中的尸WI位点，用于下一克隆步骤。将来自pWV309的1443bpJvHI/i^1片段克隆到pWV308的4073bp爿wll/i^1片段中，产生pWV310。因此，pWV310含有片段，其编码与在位点融合的w6cM的侧翼区域同源的DNA。将该2816bpS/^I/A^fll片段克隆到用S/^I线性化的pKC1132(Bierman等人，1992)中，产生pWV320。3.3珍贵束丝放线菌珍贵亚种的转化4吏用pWV320用电穿孔转化携带有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，产生用于接合的大肠杆菌供体菌林。通过营^^合(Matsushima等人,1994)使用该菌林转化珍贵束丝放线菌珍贵亚种。将接合后体涂布到培养基4上，在28°C孵育。在24小时后用50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酮酸铺平板。由于pWV320在珍贵束丝放线菌珍贵亚种中不能复制，预期阿泊拉霉素抗性菌落是包含质粒pWV320的转化体，其中所述质粒藉由质粒来源附6dlf的同源性側翼区域通过同源重组被整合到染色体中。从6个接合后体中分离基因组DNA，消化并用Southern印迹分析。印迹显示，6个分离体中的4个已经在同源性的上游区域中发生整合，6个分离体中的2个已经在下游区域中发生了同源性整合。选择由上游区域中的同源性整合产生的一林菌林(被命名为BIOT-3831)用于筛选次级交换(secondarycross)。同样选择由下游区域中的同源性整合产生的一林菌林(BIOT-3832)用于筛选次级交换。3.4筛选次级交换将菌林涂斑至培养基4上(补充50mg/L阿泊拉霉素)并在28°C生长4天。将lcm2区域的每个菌斑用于接种在50mL福尔肯管中的7mL的无抗生素的修饰的ISP2(1L蒸馏水中含0.4。/o酵母提取物、1%麦芽提取物、0.4。/。右旋葡萄糖糖)。培养物生长2-3天，然后传代培养(5%接种物)到另一个50mL福尔肯管中的7mL修饰的ISP2(见上)中。在4-5代传代培养后，将培养物超声处理，连续稀释，涂布到培养基4上，并在28°C孵育4天。然后将单个菌落一式两份涂斑到含有阿泊拉霉素的培养基4上和不含抗生素的培养基4上，将平板在28°C孵育4天。将生长在无抗生素平板上、但没有生长在阿泊拉霉素平板上的菌斑，重新涂斑到+/-阿泊拉霉素平板上，mt它们已经丢失了抗生素标志物。突变菌林编码具有502个氨基酸的符合读框的缺失的mbcM蛋白质(附图6A。SEQIDNO:20和21:附图6B显示了编码的蛋白质序列，SEQIDNO:22)。将w&Af缺失突变体涂斑至培养基4上并在28°C生长4天。使用来自每个菌斑的6mm环形填块(circularplug)接种到分别的包含IOmL种子培养基(由培养基l调整而来-2%葡萄糖、3。/。可溶性淀粉、0.5%玉米浆固体、1%豆粉、0,5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸钓)的50mL福尔肯管中。这些种子培养物以2英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育2天。然后，用于接种(0.5mL到10mL中)生产培养基(培养基2-5%甘油、1%玉米浆固体、2%酵母提取物、2。/。磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸4丐)，并且在28。C生长24小时，然后在26。C生长另外5天。根据一般方法中描述的提取次级代谢物，并通过LCMS分析麦克菌素类似物的生产。3.5从BIOT-3872中鉴别14和15产生在实施例3.4中描述的发酵提取物，并根据一般方法中描述的使用LCMS方法1用LCMS测定。没有观察到麦克菌素，但观察到两种新的主要成分。下表5中显示了化合物显示的理化特征。表5-LCMS鉴别的化合物化合物保留时间(分钟)[M+Na+[M-H质量1411.5525.2501.2502159.9541.1517.1518显示化合物14和15与以前已经报道过的麦克菌素类似物7-0-氨甲酰基前-麦克菌素和7-0-氨甲酰基-15-羟基前-麦克菌素相同。OHJ8P21HH3CH3CO'H3C,CH3\化合物14OH|18HC1221S21H3CO'■OHHA7,OGO,化合物15.CH3OCOMH2注意到通过附&Af中的整合作用(实施例2)或缺失附6dV/基因导致去除mbcM的功能，都可以生产相同的化合物；14和15。分析观察到的结构和生物合成途径之间的关系，提示除mbcM以外还有多种酶没有功能。在化合物15的情况下，这些酶是MbcP、MbcMTl和MbcMT2，在化合物14的情况下还没有观察到MbcP450的功能。如上述，可以有多种原因导致这些蛋白质在该系统中没有功能，例如化合物14和15代表对于这些而言新的结构，它们可能是不良的底物或根本不M物。3.6通过产生BIOT-3872的原生质体来选择单个克隆使用自Weber和Losick1988调整后的方法以及下列培养基改变，从BIOT-3872产生原生质体；在ISP2平板(培养基3)上生长珍贵束丝放线菌培养物，在28°C生长3天，并使用5mm2刮片(scraping)接种40ml的ISP2肉汤(其中补充了2ml的水中的无菌10。/。(Wv)甘氨酸)。根据Weber和Losick1988中描述的产生原生质体，然后在R2平板上再生(R2配方-蔗糖103g、K2SO40.25g、MgCl2.6H2010.12g、葡萄糖10g、Difco酪蛋白^J^酸0.1g、DifcoBacto琼脂22g、蒸馏水至800mL,通过在121°C高压灭菌20分钟消毒混合物)。在高压灭菌后，添加下列高压灭菌过的溶液0.5%KH2P0410ml、3.68%CaCl2.2H2080mL、20%L-脯氨酸15mL、5.73%TES緩冲液(pH7.2)100mL、微量元素溶液(ZnCl240mg、54FeCl3.6H20200mg、CuCl2.2H2010mg、MnCl2.4H2010mg、Na2B4O7.10H2O10mg、(NH4)6Mo7024.4H2010mg、蒸馏水至1升)2mL、NaOH(IN)(未灭菌)5mL)。将80个单个菌落涂斑至MAM平板(培养基4)上，如上述分析麦克菌素类似物的生产。大多数原生质体产生的菌斑以与亲本菌林相似的低水平生产。检测的80个样品中的15个比亲本菌林产生显著更多的14和15。观察到最佳的生产菌林BIOT-3870(还被称为WV4a-33)，其比亲本菌林以显著更高水平生产14和15，选择其供将来的实验中使用。实施例4饲喂WV4a-33产生4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-18，21-双脱氧麦克菌素4.1用WV4a-33(BIOT-3870)生物转化3-氨基苯曱酸将WV4a-33涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28。C生长3天。使用6mm环形填块(circularplug)接种含有10mL种子培养基(自培养基l调整的-2%葡萄糖、3。/。可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸钓)的各个50mL福尔肯管。这些种子培养物以2英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育65小时。然后，将它们用于接种(1mL至10mL中)修饰的生产培养基(自培养基2调整的-5%甘油、1。/。玉米浆固体、2。/。酵母提取物、2。/。磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸钓的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)，在26。C生长24小时。向每个福尔肯管中加入0.1mL的200mM饲喂储液(溶解在曱醇中的3-tJ^苯曱酸)，以产生最终的饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。平行的，使用种子培养物接种培养基2。对这些培养物的分析(见下文)显示，在两种类型的生产培养基中产生了相同的化合物，但是，使用修饰的培养基时观察到更高的效价。4.2从祠喂3-氨基苯曱酸的WV4a-33培养物中鉴别4，5-二氢-ll-0-去甲基-15-去曱氧基-18,21-双脱氧麦克菌素产生在实施例2.7中描述的发酵提取物，并根据一般方法中描述的用55LCMS测定。如预期产生了化合物14和15。此外，还清楚的观察到新的化合物16，其在没有饲喂3-氨基苯甲酸的任何发酵提取物中都没有观察到。16比14或15洗脱的更晚，具有下表6中描述的理化性质。基于可获得的数据，鉴别16是4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-18，21-双脱氧麦克菌素。表6-LCMS鉴别的化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>实施例5——4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-18，21-双脱氧麦克菌素的生产和分离(备选方法)5.1从铜喂3-^J^苯曱酸的WV4a-33培养物中发酵4,5-二氢-11-0-去曱基-15-去曱氧基-18,21-双脱氧麦克菌素将WV4a-33涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28°C生长3天。使用2个6mm环形填块(circularplug)接种含有30mL种子培养基(自培养基l调整-2%葡萄糖、3。/。可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸钾)的250mL锥形摇瓶中。孵育6个烧瓶。这些种子培养物以1英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育65小时。然后，将它们用于接种(lmL至10mL中)每个含有10mL修饰的生产培养基(自培养基2调整-5%甘油、1。/。玉米浆固体、2%酵母提取物、2%磷酸二氢钟、0.5%氯化镁、0.1%碳酸钩的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)的170个福尔肯管，并且在26。C生长24小时。向每个福尔肯管中加入O.lmL的200mM饲喂储液(溶解在甲醇中的3-氨基苯曱酸)，产生最终饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。集合培养物(约1.41)，并且洗涤福尔肯管(每个用7ml水)。集合洗涤液(约1.41)。将集合的培养物和洗涤液用于分离4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-18，21-双脱氧麦克菌素(共计约3L)。平行的，使用种子培养物接种30mL修饰的生产培养基(3ml)，然后进行与上ii4目同的孵育和饲喂方案(最终饲喂浓度为2mM)。烧瓶在2英寸抛距的振荡器中孵育。通过LCMS估算生产水平，大约是对福尔肯管生产培养物的测量的那些的50%和90%之间。5.2分离和表征4,5-二氢-ll-0-去曱基-15-去甲氧基-18，21-双脱氧麦克菌素用等体积乙酸乙酯(EtOAc)提取发酵肉汤(3L)2次。合并有机提取物，在真空40。C去除溶剂，产生1.2g油性残余物。然后在硅胶60柱(30x2.5cm)上用自100%CHC13至CHCl3:MeOH(97:3)的分步梯度对该残余物进行色i普，收集约250mL的级分。用分析HPLC监控级分。合并含有16的级分，在真空40。C去除溶剂，产生435mg半纯的16。在Phenomenex-LunaC18-BDS柱(21.2x250mm，5孩吏米颗并立大小)上，通过反相HPLC进一步纯化该半纯的物质，其中以21ml/分钟的流速，用水:乙腈(77:23)至(20:80)梯度洗脱25分钟。16在17分钟洗脱，并且合并相关的级分，在减压下去除溶剂，以产生作为白色粉末(l"mg)的l6。根据一般方法中描述的使用方法1，通过LCMS验证16的纯度。LCMS:16，RT=12.9分钟([M+Na]+，附々=509.4;[M-H]，m/z=485.5)。在400MHz收集的质子NMR数据与显示的结构一致。化合物16实施例6通过向BIOT-3870饲喂5-氨基-2-氟苯甲酸产生4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-17-氟-18，21-双脱氧麦克菌素6.1用BIOT-3870生物转化5-氨基-2-氟苯甲酸将BIOT-3870涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28°C生长3天。使用6mm环形填块(circularplug)接种到含有10mL种子培养基(自培养基l调整的-2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3。/。氯化钠、0.5。/。碳酸4丐)的各个50mL福尔肯管。这些种子培养物以2英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育65小时。然后，将它们用于接种(1mL至10mL中M'务饰的生产培养基(自培养基2调整的-5%甘油、1%玉米浆固体、2%酵母提取物、2%磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸钓的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)，在26°C生长24小时。向每个福尔肯管中加入O.lmL的200mM飼喂储液(溶解在甲醇中的5-M-2-氟苯甲酸)，以产生最终的饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。6.2鉴别4,5-二氢-ll-0-去甲基-15-去甲氧基-17-氟-18,21-双脱氧麦克菌素，17才艮据一般方法中描述的用LCMS方法1实施分析。除14和15以外，还观察到具有下表7中描述的LCMS特征的新化合物。这些数据与标题化合物一致。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>6.3生产和提取4,5-二氢-ll-0-去曱基-15-去曱氧基-17-氟-18，21-双脱氧麦克菌素，17将BIOT-3870涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28°C生长3天。使用2个6mm环形填块(circularplug)接种含有30mL种子培养基(自培养基l调整-2%葡萄糖、3。/。可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸钓)的250mL锥形摇瓶中。孵育6个烧瓶。这些种子培养物以1英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育65小时。然后将它们用于接种(1mL至10mL中)每个含有10mL修饰的生产培养基(自培养基2调整-5%甘油、1。/。玉米浆固体、2%酵母提取物、2%磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸4丐的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)的170个福尔肯管中，并且在26。C生长24小时。向每个福尔肯管中加入O.lmL的200mM饲喂储液(溶解在甲醇中的5-#J^2-氟苯甲酸)，产生最终的饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。集合培养物(约1.4L)，并且洗涤福尔肯管(每个用7ml水)。集合洗涤液(约1.4L)。将集合的培养物和洗涤液用于分离4,5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-17-氟-18，21-双脱氧麦克菌素，见下文。6.4纯化和表征4，5-二氢-ll-0-去曱基-15-去曱氧基-17-氟-18，21-双脱氣麦克菌素，17用等体积乙酸乙酯(EtOAc)提取发酵肉汤(3L)2次。合并有机提取物，在真空40'C去除溶剂，产生3.0g油性残余物。然后在硅胶60柱上对残余物进行色i普，用CHCl3中的2%曱醇洗脱，并且收集约250mL的级分。用分析HPLC监控级分。合并含有的级分，在真空40。C去除溶剂。在Phenomenex-LunaCis誦BDS柱(21,2x250mm，5樣史米颗粒大小)上，通过反相HPLC进一步纯化该半纯的物质，其中以21ml/分钟的流速，用水乙腈(77:23)至(20:80)的梯度洗脱25分钟。17在18分钟洗脱，并且合并相关级分，并且在减压下去除溶剂，产生白色粉末(54mg)。在(16-丙酮中获得的NMR数据与报道的结构完全一致。根据一般方法中描述的使用LCMS方法2验证17的纯度。测量在多波长下进行，并同时以阳性和阴性模式使用MS分析。LCMS:17,RT-11.3分4中([M-H，w/z=503.3;[M+Na+，w/z=527.3;[2M+Na+,w/z=1032.0)。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>O——COM*化合物17实施例7通过向BIOT-3870铜喂5-氨基-3-氟苯甲酸产生4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去曱氧基-18-氟-18，21-双脱氧麦克菌素7.1用BIOT-3870生物转化5-M-3-氟苯曱酸将BIOT-3870涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28°C生长3天。使用6mm环形填块(circularplug)接种到含有10mL种子培养基(自培养基l调整-2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、0.5%玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸钓)的各个50mL福尔肯管。这些种子培养物以2英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育65小时。然后，将它们用于接种(1mL至10mL中)修饰的生产培养基(自培养基2调整-5%甘油、1。/。玉米浆固体、2。/。酵母提取物、2。/。磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸钓的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)，在26。C生长24小时。向每个福尔肯管中加入O.lmL的200mM饲喂储液(溶解在曱醇中的5-氨基-3-氟苯甲酸)，产生最终的饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。7.2鉴别4,5-二氢-ll-0-去甲基-15-去曱氧基-18-氟-18,21-双脱氧麦克菌素，18才艮据一般方法中描述的用LCMS方法1实施分析。除14和15以外，还观察到具有下表8中描述的LCMS特征的两种新化合物。这些数据与标题化合物18及其C15-羟基化类似物19一致。表8化合物4呆留时间(分钟)[M+Na+，m/z[M-H]，m/z质量1411.5525.2501.2502159.9541.1517.15181814.1527.2503.15041911.5543.3519.35207.3生产和提取4,5-二氢-ll-0-去曱基-15-去曱氧基-18-氟-18,21-双脱氧麦克菌素，18将BIOT-3870涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28°C生长3天。使用2个6mm环形填块(circularplug)接种含有30mL种子培养基(自培养基l调整-2%葡萄糖、3。/。可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸4丐)的250mL锥形摇瓶中。孵育6个烧瓶。这些种子培养物以1英寸抛距的200转/分钟在28°C孵育65小时。然61后，将它们用于接种(1iiiL至10mL中)每个含有10mL修饰的生产培养基(自培养基2调整-5%甘油、1%玉米浆固体、2%酵母提取物、2%磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸钓的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)的170个福尔肯管中，并且在26。C生长24小时。向每个福尔肯管中加入0.1mL的200mM饲喂储液(溶解在甲醇中的5-#J^-3-氟苯甲酸)，产生最终的饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。集合培养物(约1.41)，并且洗涤福尔肯管(每个用7ml水)。集合洗涂液(约1.41)。将集合的培养物和洗涤液如下述用于分离4，5-二氢-11-0-去曱基-15-去甲氧基-18-氟-18，21-双脱氧麦克菌素。7.4分离和表征4，5-二氢-ll-0-去曱基-15-去甲氧基-18-氟-18,21-双脱氧麦克菌素，18用等体积EtOAc提取发酵肉汤(~3L)2次。合并有机提取物，在真空40。C去除溶剂，产生3.4g油性残余物。然后在珪胶60柱(30x2.5cm柱)上用自100%CHC13至CHCl3:MeOH(96:4)分步梯度对该残余物进行色谱，并且收集约250mL的级分。用分析HPLC监控级分。合并含有18的级分，在真空40。C去除溶剂，产生528mg半纯的18。在Phenomenex-LunaC18-BDS柱(21.2x250mm,5孩史米颗粒大小)上，通过反相HPLC进一步纯化该半纯的物质，其中以21ml/分钟的流速，用水:乙腈(77:23)至(20:80)的梯度洗脱25分钟。18在20分钟洗脱，并且合并相关级分，在减压下去除溶剂，产生作为白色粉末(224mg)的18。在d6-丙酮中获得的NMR数据与报道的结构完全一致。根据一般方法中描述的使用LCMS方法2验证18的纯度。测量在多波长下进行，并同时以阳性和阴性模式使用MS分析。LCMS:18，RT=11.9分钟([M-H]-，/m/z=503.1;[M+Na]+，m/z=527.2;[2M+Na]+，wi/z=1031.5)。化合物18_化合物19实施例8通过向BIOT-3870饲喂5-氨基-2,3，6-三氟苯甲酸产生4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-18，21-双脱氧-17，18，21-三氟麦克菌素8.1用BIOT-3870生物转化5-氨基-2，3,6-三氟苯曱酸将BIOT-3870涂斑至MAM平板(培养基4)上，在28°C生长3天。使用6mm环形填块(circularplug)接种含有10mL种子培养基(自培养基l调整-2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3%氯化钠、0.5%碳酸钓)的各个50mL福尔肯管。这些种子培养物以2英寸抛距的200转/分钟在28。C孵育65小时。然后，将它们用于接种(1mL至10mL中)修饰的生产培养基(自培养基2调整-5%甘油、1%玉米浆固体、2%酵母提取物、2%磷酸二氢钾、0.5。/。氯化镁、0.1%碳酸钩的培养基保留沉淀2-60天，取上层作为生产培养基)，并且在26°C生长24小时。向每个福尔肯管中加入O.lmL的200mM饲喂储液(溶解在甲醇中的5-氨基-2，3，6-三氟苯甲酸)，可以产生最终的饲喂浓度为2mM。将管在26。C孵育另外6天。8.2鉴别4,5-二氩-ll-0-去曱基-15-去甲氧基-18,21-双脱氧-17,18,21-三氟麦克菌素，20上18Oo.;、/CH3H3CO，、"H'，3CH3,,二::.-!H3C'、'H3CO，、,、OH'13H3CH，PH3/O——CONH2\O——CONH7...2c才艮据一般方法中描述的用LCMS方法1实施分析。除14和15以外，还观察到具有下表9中描述的LCMS特征的新化合物。这些数据与标题化合物一致。表9化合物保留时间(分钟)[M+Na]+，m/z[M誦H，m/z质量1411.5525.2501.2502159.9541.1517.15182013.2未观察到539.254017.:1182422HOCH3H3CO，化合物20.■、OHH3qCH3IT\-CO:,实施例9产生珍贵束丝放线菌菌林，其中附6dkf具有符合读框地缺失，并且已经额外缺失了附6dWT7、附6dWT2、附6cP和附6ci^/50。9.1克隆与附6cAm下游侧翼区域同源的DNA使用黏粒52(来自实施例1)作为模板和PfuDNA聚合酶，使用寡聚物ls4del1(SEQIDNO:23)和ls4dd2a(SEQIDNO:24),在标准的PCR反应中从珍贵束丝i文线菌(ATCC31280)中扩增1595bp的DNA区域。在寡聚物ls4del2a中设计了5'延伸，来引入爿vrll位点，以帮助扩增片段的克隆(附图7)。扩增的PCR产物(l+2a,附图8，SEQIDNO:25)编码附6cMT2的3，端的196bp，和下游同源的另外1393bp。将该1595bp片段克隆到已经用S附fll线性化的pUC19中，获得质粒pLSSl+2a。ls4del1(SEQIDNO:23)5，一GGTCACTGGCCGAAGCGCACGGTGTCATGG—3"ls4del2a(SEQIDNO:24)5，一CCTAGGCGACTACCCCGCACTACTACACCGAGCAGG-359.2克隆与上游侧翼区域同源的DNA使用黏粒52(来自实施例1)作为模板和PfuDNA聚合酶，使用寡聚物ls4del3b(SEQIDNO:26)和ls4del4(SEQIDNO:27)，在标准的PCR反应中从珍贵束丝方文线菌(ATCC31280)中扩增1541bp的DNA区域。在寡聚物ls4del3b中设计了5，延伸，来引入^vrll位点，以帮助扩增片段的克隆(附图7)。扩增的PCR产物(3b+4，附图9，SEQIDNO:28)编码附6c尸的5，端的100bp，和下游同源的另外1450bp。将该1550bp片段克隆到已经用线性化的pUC19中，获得质粒pLSS3b+4。ls4dd3b(SEQIDNO:26)5，-CCTAGGAACGGGTAGGCGGGCAGGTCGGTG-3"ls4del4(SEQIDNO:27)5，一GTGTGCGGGCCAGCTCGCCCAGCACGCCCAC_3'将产物l+2a和3b+4克隆到pUC19中，以利用pUC19多聚接头中的和5"附HI位点，用于下一克隆步骤。将来自pLSSl+2a的1621bp^vrlI/77,Vid111片段，和来自pLSS3b+4的1543bp^vrlI/5fl附HI片段克隆到pKC1132的3556bp孖/"dlII/5fl附HI片段中，产生pLSS315。因此，pLSS315含有历VidlII/必"附HI片段，其编码与在zlvrll位点融合的所需的四个ORF缺失区域的侧翼区域同源的DNA(附图7)。9.3用pLSS315转化BIOT-3870使用pLSS315用电穿孔转化携带有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，产生用于接合的大肠杆菌供体菌抹。通过营絲合(Matsushima65等人，1994)使用该菌林转化BIOT-3870。将M后体涂布到MAM培养基(1%小麦淀粉、0.25%玉米浆固体、0.3%酵母提取物、0.3%碳酸钓、0.03。/。石克酸4失、2%琼脂)上，并且在28。C赙育。在24小时后用50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘咬酮酸涂布平板。由于pLSS315在BIOT-3870中不能复制，预计阿泊拉霉素抗性菌落是包含质粒的转化体，其中所M粒藉由质粒来源的同源性区域通过同源重组被整合到染色体中。9.4筛选次级交换选择3个BIOT-3870:pLSS315的初级转化体进行传代克隆，用于筛选次级交换。将菌林涂斑至MAM培养基上(补充50mg/L阿泊拉霉素)并在28°C生长4天。将2个6mm的环形填块接种到250ml锥形瓶中的30mL的ISP2(0.4%酵母提取物、1。/。麦芽提取物、0.4%右旋葡萄糖糖，未补充抗生素)中。培养物生长2-3天，然后传代培养(5%接种物)到250mL锥形瓶中的30mLISP2中。在4-5轮传代培养后，按实施例3.6中描述的将培养物制备成原生质体，将原生质体连续稀释，涂布到再生培养基(参见实施例3.6)中，并在28。C孵育4天。然后将单个菌落一式两份的涂斑到含有阿泊拉霉素的MAM培养基上或不含抗生素的MAM培养基上，并且在28。C孵育4天。将来自克隆No1(No32-37)的7个菌斑和来自克隆No3(No38-41)的4个菌斑(所述克隆生长在无抗生素平板上、但没有生长在阿泊拉霉素平板上)，重新涂斑到+/-阿泊拉霉素平板上，验证它们已经丟失了抗生素标志物。根据一般方法中描述的进行麦克菌素类似物的生产。根据一般方法中描述的使用LCMS方法1实施分析。对于菌斑33、34、35、37、39和41中而言，生产的化合物14的产量与亲本菌林8101-3870是可比较的，并且没有XPL察到化合物15的生产。该结果显示，除了附kM的原始缺失外，需要的突变菌^Mi具有包含基因w&尸、附6c/^5。、附6dWT7和附6dWT7的麦克菌素簇的3892bp的缺失。实施例10-与Hsp卯结合爭温谅定賴法;^縱针对含有1mMEDTA和5mMNaCl的20mMTrispH7.5透析酵母Hsp90,然后在相同但是含有2%DMSO的緩冲液中将其稀释至0.008mM。将测试化合物在100%DMSO中溶解，浓度为50mM，然后在与用于Hsp90的緩冲液相同的緩冲液(具有2%DMSO)中稀释至O.lmM。在MSC系统(Microcal)上在30。C测量相互作用热，细胞体积为1.458mL。将10份等分试样的0.027mL0.100mM的每种测试化合物注射到0.008mM酵母Hsp90中。在独立实验中，通过将测试化合物注入含有2%DMSO的緩冲液中，测定稀释热，并且使用最小二乘方曲线拟合算法(MicrocalOrigin)将校正的数据拟合三个浮动变量化学计量、结合常数和相互作用焓的改变。下表10中显示了结果。表10-Hsp90结合的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>实施例11-生物学数据——体外评估18，21-双脱氧麦克菌素类似物的抗癌活性根据一般方法中描述的，使用修饰的碘化丙锭测定，在单层增殖测定中，在一组人肺瘤细胞系中，进行测试化合物的抗癌活性的体外评估。下表ll中显示了结果，所显示的所有处理/对照(％T/C)值都是至少3组独立的实验的平均值。表12显示了化合物在所测试的细胞系组之间的平均IC7(j，麦克菌素显示为参照(其中，平均值是才艮据所有重复的算术平均值计算的)。表ll-体外的细胞系数据<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>在本申请中参考的所有文献，包括专利和专利申请，都以其最完整的程度整合到本文中作为参考。在说明书和以下的权利要求中，除非上下文另外要求，词语"包含"，及其变体例如"含有，，和"包括，，都将理解为包括所述整体或整体的步骤或群组，但不排除任何其他的整体或整体的步骤或群组或者步骤。参考文献Allen,I.W.和Ritchie,D.A.(1994)CloningandanalysisofDNAsequencesfromStreptomyceshygroscopicusencodinggeldanamycinbiosynthesis.Mol.Gen.Genet.243:593-599.Bagatell,R.和Whitesell,L.(2004)AlteredHsp90functionincancer:Auniquetherapeuticopportunity.MolecularCancerTherapeutics3:1021-1030.Beliakoff,J.和Whitesell,L.(2004)Hsp90:anemergingtargetforbreastcancertherapy.Anti-CancerDrugs15:651-662.Bierman,M.，Logan,R.，O，Brien，K.，Seno,ET.，NagarajaRao，R.和Schoner,BE.(1992)"PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStreptomycesspp."Gene116:43-49.Blagosklonny，M.V.(2002)Hsp-90-associatedoncoproteins:multipletargetsofgeldanamycinanditsanalogues.Leukemia16:455-462.Blagosklonny，M.V"Toretsky,J.,Bohen，S.和Neckers,L(1996)Mutantconformationofp53translatedinvitroorinvivorequiresfunctionalHSP90.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8379-8383.Bohen，S.P.(1998)Geneticandbiochemicalanalysisofp23andansamycinantibioticsinthefunctionofHsp90-dependentsignalingproteins.MolCellBiol18:3330-3339.Carreras，C.W.，Schirmer，A.，Zhong，Z.和SantiD.V.(2003)Filterbindingassayforthegeldanamycin-heatshockprotein90interaction.AnalyticalBiochemistry317:40-46.Cassady，J.M.，Chan,K.K.,Floss,H.G.和LeistnerE.(2004)Recentdevelopmentsinthemaytansinoidantitumouragents.Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26.Chiosis，G.，Huezo，H.，Rosen,N.，Mimnaugh，E.，Whitesell,J.和Neckers,L(2003)17AAG:Lowtargetbindingaffinityandpotentcellactivity—findinganexplanation.MolecularCancerTherapeutics2:123-129.Chiosis，G.，Vilenchik，M.，Kim，J.和Solit，D.(2004)Hsp卯thevulnerablechaperone.DrugDiscoveryToday9:881-888.Csermely,P.和Soti，C.(2003)InhibitionofHsp90asaspecialwaytoinhibitproteinkinases.Cell.Mol.Biol丄ett.8:514-515.DeBoer，CandDietz，A.(1976)ThedescriptionandantibioticproductionofStreptomyceshygroscopicusvar.geldanus.J.Antibiot.29:1182-1188.DeBoer，C.，Meulman，P.A.，Wnuk,R.丄，andPeterson,D.H.(1970)Geldanamycin,anewantibiotic.J.Antibiot.23:442-447.DenglerW.A.，SchulteJ.，BergerD.P.，MertelsmannR.和FiebigHH.(1995)Developmentofapropidiumiodidefluorescenceassayforproliferationandcytotoxicityassay.Anti-CancerDrugs,6:522-532.Dikalov,s.，Landmesser,U.，Harrison,DG.,2002，GeldanamycinLeadstoSuperoxideFormationbyEnzymaticandNon-enzymaticRedoxCycling,TheJournalofBiologicalChemistry,277(28)，pp25480画25485Donz6O.和Picard，D.(1999)Hsp90bindsandregulatestheligand-inducibleasubunitofeukaryotictranslationinitiationfactorkinaseGcn2.MolCellBiol19:8422-8432.EgorinMJ,LagattutaTF，HamburgerDR，CoveyJM，WhiteKD，MusserSM，EisemanJL(2002)"Pharmacokinetics,tissuedistribution,andmetabolismof17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin(NSC707545)inCD2F1miceandFischer344rats."CancerChemotherPharmacol,49(1)，pp7画19.Eustace,B.K.，Sakurai,T.，Stewart,J.K.，等人(2004)Functionalproteomicscreensrevealanessentialextracellularroleforhsp90aincancercellinvasiveness.NatureCellBiology6:507-514.Fang，Y.，Fliss，A,E.，Rao，丄和CaplanA.J.(1998)SBA1encodesayeastHsp90cochaperonethatishomologoustovertebratep23proteins.MolCellBiol18:3727-3734.FiebigH.H.，DenglerW.A.和RothT.Humantumorxenografts:Predictivity，characterization,anddiscoveryofnewanticanceragents.In:FiebigHH，BurgerAM(eds).RelevanceofTumorModelsforAnticancerDrugDevelopment.Contrib.Oncol.1999，54:29-50.Goetz，M.P.，Toft，D.O.，Ames,M.M.和Ehrlich,C.(2003)TheHsp90chaperonecomplexasanoveltargetforcancertherapy.AnnalsofOncology14:1169-1176.Harris,S.F.，ShiauA.K.和AgardD.A.(2004)Thecrystalstructureofthecarboxy-terminaldimerizationdomainofhtpG,theEscherichiacoliHsp90，revealsapotentialsubstratebingingsite.Structure12:1087-1097.Hong,Y.-S.，Lee，D.，Kim，W.，Jeong，J.-K.等人(2004)Inactivationofthecarbamoyltransferasegenerefinespost-polyketidesynthasemodificationstepsinthebiosynthesisoftheantitumoragentgeldanamycin.J.Am.Chem.Soc.126:11142-11143.Hostein，I.，Robertson,D.，DiStefano，F.，Workman,P.和Clarke,P.A.(2001)InhibitionofsignaltransductionbytheHsp90inhibitor17-allylamino-17-demethoxygeldanamycinresultsincytostasisandapoptosis.CancerResearch61:4003-4009.Hu，Z.，Liu，Y.，Tian，Z.画Q.，Ma，W.，Starks，C.M.等人(2004)Isolationandcharacterizationofnovelgeldanamycinanalogues.J.Antibiot.57:421-428.Hur，E.,Kim，H.-H.，Choi,S.M.，等人(2002)Reductionofhypoxia-inducedtranscriptionthroughtherepressionofhypoxia-induciblefactor-la/arylhydrocarbonreceptornucleartranslocatorDNAbindingbythe90-kDaheat-shockproteininhibitorradicicol.MolecularPharmacology62:975-982.IwaiY，Nakagawa，A.，Sadakane,N.，Omura，S.，Oiwa，H.，Matsumoto，S.，Takahashi,M.,Ikai,T.，Ochiai，Y.(1980)HerbimycinB，anewbenzoquinoidansamycinwithanti-TMVandherbicidalactivities.TheJournalofAntibiotics,33(10)，ppl114-1119.Jez，J.M.，Chen,J.C.画H.，Rastelli，G.，Stroud,R.M.和Santi，D.V.(2003)Crystalstructureandmolecularmodelingof17-DMAGincomplexwithhumanHsp90.ChemistryandBiology10:361-368.Kaur,G.，Belotti，D，Burger,A.M.,Fisher-Nielson，K.，Borsotti，P.等人(2004)Antiangiogenicpropertiesof17-(Dimethylaminoethylamino)誦17-Demethoxygeldanamycin:anorallybioavailableheatshockprotein90modulator.ClinicalCancerResearch10:4813-4821.Kieser，T.，Bibb,M.J.，Buttner,M.丄，Chater，K.F.，andHopwood,D.A.(2000)PracticalStreptomycesGenetics,JohnlimesFoundation,NorwichKumar,R.，Musiyenko，A.和BarikS.(2003)Theheatshockprotein90ofPlasmodiumfalciparumandantimalarialactivityofitsinhibitor,geldanamycin.JMalar2:30.Kurebayashi，J.，Otsuke，T.，Kurosumi，M.，Soga，S.，Akinaga，S.和Sonoo，H.(2001)Aradicicolderivative,KF58333,inhibitsexpressionofhypoxia-induciblefactor-laandvascularendothelialgrowthfactor,angiogenesisandgrowthofhumanbreastcancerxenografts,Jpn.J.CancerRes.92:1342-1351.LeBrazidec,J.-Y.，Kamal，A"Busch，D.，Thao，L，Zhang,L等人(2003)SynthesisandbiologicalevaluationofanewclassofgeldanamycinderivativesaspotentinhibitorsofHsp90.J.Med.Chem.47:3865-3873.Lee，Y.-S.，Marcu,M.G.和Neckers，L.(2004)Quantumchemicalcalculationsandmutationalanalysissuggestheatshockprotein90catalyzestrans-cisisomerationofgddanamycin.Chem.Biol.11:991-998.Liu，X.-D.，Morano，K.A.和ThieleD.J.(1999);TheyeastHspllOfamilymember,Ssel,isanHsp90cochaperone.JBiolChem274:26654-26660.Mandler，R.，Wu,C.，Sausville，E.A.，Roettinger，A.J.，Newman,D.J.，Ho，D.K.，King,R.，Yang,D.，Lippman，M.E.，La油lfi，N.F.，Dadachova,E.，Brechbiel,M.W.和Waldman,T.A.(2000)Immunoconjugatesofgeldanamycinandanti-HER2monoclonalantibodies:antiproliferativeactivityonhumanbreastcarcinomacelllines.JournaloftheNationalCancerInstitute92:1573-1581.Matsushima,P.，M.C.Broughton，等人(1994).ConjugaltransferofcosmidDNAfromEscherichiacolitoSaccharopolysporaspinosa:effectsofchromosomalinsertionsonmacrolideA83543production.Gene146(1):39-45.McLaughlinS.H.，Smith,H.W.和JacksonS.E.(2002)StimulationoftheweakATPaseactivityofhumanHsp90byaclientprotein.J.Mol.Biol.315:787-798.McCammon，M.T.和L.W.Parks(1981).InhibitionofsteroltransmethylationbyS-adenosylhomocysteineanalogs.JBacteriol145(1):106-12.MuroiM，IzawaM，KosaiY，AsaiM.(1981)"ThestructuresofmacbecinIandII"Tetrahedron,37，ppll23陽1130.Muroi，M.，IzawaM.，Kosai，Y.，和Asai，M.(1980)MacbecinsIandII，NewAntitumorantibiotics.II.Isolationandcharacterization.JAntibiotics33:205-212.Neckers，L(2003)DevelopmentofsmallmoleculeHsp90inhibitors:utilizingbothforwardandreversechemicalgenomicsfordrugidentification.CurrentMedicinalChemistry9:733-739.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>MicrobiologyLetters218:223-230.Rascher，A.，Hu，Buchanan,O.，Reid,R.和Hutchinson,R,(2005),Insightsintothebiosynthesisofthebenzoquinoneansamycinsgeldanamycinandherbimycin,obtainedbygenesequencinganddisruption.ApplEnvironMicrobiol71(8):4862-71.Rawlings，B.J.(2001)."TypeIpolyketidebiosynthesisinbacteria(PartB)."NaturalProductReports18(3):231-281.RothT.,BurgerA，M.，DenglerW.，WillmannH.和FiebigH.H.Humantumorcelllinesdemonstratingthecharacteristicsofpatienttumorsasusefulmodelsforanticancerdrugscreening.In:FiebigHH，BurgerAM(eds).RelevanceofTumorModelsforAnticancerDrugDevelopment.Contrib.Oncol.1999，54:145-156.Rowlands,M.G.，Newbatt,Y.M.，Prodromou，C.，Pearl,L,H.,Workman,P.和Aherne，W.(2004)High-throughputscreeningassayforinhibitorsofheat-shockprotein90ATPaseactivity.AnalyticalBiochemistry327:176-183Schulte，T.W.，Akinaga,S.，Murakata,T.，Agats腿a，T.等人(1999)Interactionofradicicolwithmembersoftheheatshockprotein90familyofmolecularchaperones.MolecularEndocrinology13:1435-1488.Shibata,K.，Satsumabayashi,S.，Nakagawa,A,，Omura，S.(1986a)ThestructureandcytocidalactivityofherbimycinC.TheJournalofAntibiotics,39(11)，ppl630-1633.Shibata，K.,Satsumabayashi,S.，Sano，H.，Komiyama,K.，Nakagawa，A.，Omura，S.(1986b)Chemicalmodi打cationofHerbimycinA:synthesisandinvivoantitumoractivitiesofhalogenatedandotherrelatedderivativesofherbimycinA.TheJournalofAntibiotics,39(3)，pp415隱423.Shirling，E.B.和Gottlieb,D.(1966)InternationalJournalofSystematicBacteriology16:313-340Smith-Jones,P.M.,Solit，D.B.，Akhurst，T.，Afroze,F.，Rosen，N.和Larson,S.M.(2004)ImagingthepharmacodynamicsofHER2degradationinresponsetoHsp90inhibitors.NatureBiotechnology22:701-706.Spiteller，P"Bai，L.，Shang，G.，Carroll,B.J"Yu，T,W.和Floss,H.G.(2003).Thepost-polyketidesynthasemodificationstepsinthebiosynthesisoftheantitumoragentansamitocinbyActinosynnemapretiosum.JAmChemSoc125(47):14236-7SreedharA.S.，Nardai，G.和Csermely,P.(2004)Enhancementofcomplement-inducedcelllysis:anovelmechanismfortheanticancereffectsofHsp90inhibitors.Immunologyletters92:157-161.Sreedhar，A.S.，S6ti，C.和Csermely,P.(2004a)InhibitionofHsp90:anewstrategyforinhibitingproteinkinases.BiochimicaBiophysicaActa1697:233-242.Staunton,J.和K.J.Weissman(2001)."Polyketidebiosynthesis:amillenniumreview."NaturalProductReports18(4》380-416.Stead,P.，Latif，S.，Blackaby,A.P.等人(2000)Discoveryofnovelansamycinspossessingpotentinhibitoryactivityinacell-basedoncostatinMsignallingassay.JAntibiotics53:657-663.Supko,J.G.，Hickman,R丄.，Grever,M.R.和Malspeis，L(1995)Preclinicalpharmacologicevaluationofgeldanamycinasanantitumoragent.CancerChemother.Pharmacol.36:305-315.Takahashi，A.，Casais,C.，IchimuraK，和Shirasu，K.(2003)HSP90interactswithRARlandSGTlandisessentialforRPS2-mediateddiseaseresistanceinArabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA20:11777-11782.Tanida，S.，Hasegawa，T.和HigashideE.(1980)MacbecinsIandII，NewAntitumorantibiotics.I.Producingorganism,fermentationandantimicrobialactivities.JAntibiotics33:199-204.Tian，Z.画Q.，Liu，Y.，Zhang,D.，Wang,Z.等人(2004)Synthesisandbiologicalactivitiesofnovel17-aminogeldanamycinderivatives.BioorganicandMedicinalChemistry12:5317-5329.Uehara，Y.(2003)NaturalproductoriginsofHsp90inhibitors.CurrentCancerDrugTargets3:325-330.Vasilevskaya，I.A.，Rakitina，T.V.和O，Dwyer,P.J.(2003)Geldanamycinandits17-Allylamino-17-Demethoxyanalogueantagonizetheactionofcisplatininhumancolonadenocarcinomacells:differentialcaspaseactivationasabasisofinteraction.CancerResearch63:3241-3246.Watanabe,K.,Okuda，T.，Yokose，K"Furumai,T.和Mamyama，H.H.(1982)Actinosynnemamimm，anewproducerofnocardicinantibiotics.J.Antibiot.3:321-324.Weber,J.M.，Losick，R.(1988)Theuseofachromosomeintegrationvectortoamaperythromycinresistance和productiongenesinSacharopolysporaerythraea(Streptomyceserythraeus)Gene68(2)，173-180Wegele，H"Mtiller,L.和Buchner,J.(2004)Hsp70和Hsp90画arelayteamforproteinfolding.RevPhysiolBiochemPharmacol151:1-44.Wenzel，S.C"Gross,F，Zhang,Y"Fu,丄，Stewart,A.F.和Mtiller,R(2005)HeterologousexpressionofamyxobacterialnaturalproductsassemblylineinPseudomonadsviaRed/ETrecombineering.Chemistry&Biology12:249-356.Whitesell,L"Mimnaugh,E.G.,DeCosta,B.，Myers,C.E.和Neckers，L.M.(1994)InhibitionofheatshockproteinHSP90-pp60v-srcheteroproteincomplexformationbybenzoquinoneansamycins:Essentialroleforstressproteinsinoncogenictransformation.Pro"Natl.Acad.Sei.USA91:8324-8328.Winklhofer,K.F.，Heller,U.，Reintjes，A.和TatzdtJ.(2003)InhibitionofcomplexglycosylationincreasestheformationofPrPsc.Traffic4:313-322.WorkmanP.(2003)AuditingthepharmacologicalaccountsforHsp90molecularchaperoneinhibitors:unfoldingtherelationshipbetweenpharmacokinetics和pharmacodynamics.MolecularCancerTherapeutics2:131-138.Workman,P.和Kaye，S.B.(2002)Translatingbasiccancerresearchintonewcancertherapeutics.TrendsinMolecularMedicine8:S1-S9.Young,J.C.;Moarefi，I.和Hartl，U.(2001)Hsp90:aspecializedbutessentialproteinfoldingtool.J.Cell.Biol.154:267-273.本申请、其说明书和权利要求部分，可以作为任何后续申请的优先权基础。此类后续申请的权利要求可以要求保护本文中所述的任何特征或特征的组合。它们可以采用产品、组合物、方法、或用途权利要求的形式，并可以例如包括但不限于下列权利要求。权利要求1.根据下列式(I)的18，21-双脱氧麦克菌素类似物，或其可药用的盐其中R1代表H、OH、OMe；R2代表H或Me；R3代表H或CONH2；R4和R5或者都代表H或一起代表键(即，C4至C5是双键)；R6代表H或F；R7代表H或F；和R8代表H或F。2.根据权利要求1的化合物，其中R!代表H。3.根据权利要求1的化合物，其中R，代表OH。4.根据权利要求1至3的任一项的化合物，其中R2代表H。5.根据权利要求1至4的任一项的化合物，其中R3代表CONH2。6.根据权利要求1至5的任一项的化合物，其中R4和R5—起代表键。7.根据权利要求1至5的任一项的化合物，其中R4和R5各自代表H。8.根据权利要求1至7的任一项的化合物，其中R6、R7和Rs都代表H。9.根据权利要求1至7的任一项的化合物，其中R6、R7和Rs不都代表H。10.根据权利要求1的化合物，其中R,代表H，R2代表H，以及R3代表CONH2、以及R4和Rs各代表H。11.根据权利要求1的化合物，其中Ri代表OH，R2代表H，以及R3代表CONH;j、以及R4和Rs各代表H。12.根据权利要求1的化合物，其中R，代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs^^表H，R6、R7和Rs^(戈表H。13.根据权利要求l的化合物，其中R，代表OH，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs^f、表H，R6、R7和Rs^f戈表H。14.根据权利要求l的化合物，其中Ri代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H,R6代表F、以及R7和Rs各代表H。15.根据权利要求l的化合物，其中R,代表OH，R2代表H,R;j代表CONH2、R4和Rs各代表H,R6代表F、以及R7和Rs各代表H。16.根据权利要求1的化合物，其中R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H,R6代表H、R7代表F和Rs代表H。17.根据权利要求l的化合物，其中R,代表OH，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H，R6代表H、R7代表F和Rs代表H。18.根据权利要求l的化合物，其中R,代表H，R2代表H,R3代表CONH2、R4和Rs各代表H，R6和R7各代表F和Rs代表H。19.根据权利要求l的化合物，其中R，代表OH,R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H，R6和R7各代表F和Rs代表H。20.根据权利要求l的化合物，其中R,代表H，R2代表H,R3代表CONH2、R4和Rs^R表H,R6、R7和Rs^R表F。21.根据权利要求l的化合物或其可药用的盐，其是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>22.根据权利要求l的化合物或其可药用的盐，其是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>23.根据权利要求l的化合物或其可药用的盐，其是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>24.根据权利要求l的化合物或其可药用的盐，其是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>25.根据权利要求l的化合物或其可药用的盐，其是26.根据权利要求1的化合物或其可药用的盐，其是27.药物组合物，其包含根据权利要求1至26中任一项的18，21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐，以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。28.根据权利要求1至26中任一项的18，21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐，其用作为药物。29.根据权利要求1至26中任一项的18，21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、痦疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗。30.根据权利要求1至26中任一项的18,21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐，其用作为用于治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗的药物。31.治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗的方法，其包括向需要其的患者施用有效量的根据权利要求1至26中任一项的18,21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐。32.根据权利要求1至31的任一项的18，21-双脱氧麦克菌素或其可药用的盐、组合物、用途或方法，其中18，21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐与其它治疗联合施用。33.根据权利要求32的18,21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐、组合物、用途或方法，其中其它治疗选自氨甲蝶呤、亚叶酸、泼尼松、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春喊、长春瑞滨、多柔比星、他莫昔芬、托瑞米芬、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗HER2单克隆抗体(例如，HerceptinTM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM)、放射疗法和手术。34.才艮据权利要求32的18，21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐、组合物、用途或方法，其中其它治疗选自博来霉素、卡培他滨、顺铂、阿糖胞苷、环磷酰胺、多柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲酰四氢叶酸、氨甲蝶呤、米托蒽醌、包括紫杉醇和多西他赛的紫衫烷类、长春新碱、长M和长春瑞滨；激素疗法、阿那曲唑、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、泼尼松、他莫昔芬和托瑞米芬；单克隆抗体疗法例如曲妥珠单抗(抗-Her2)、西妥昔单抗(抗-EGFR)和贝伐珠单抗(抗-VEGF);以及蛋白激酶抑制剂例如伊马替尼、达沙替尼、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、坦西莫司；蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如伏立诺他；血管发生抑制剂如舒尼替尼、索拉非尼、来那度胺，放射疗法和手术。35.根据权利要求32的18，21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐、组合物、用途或方法，其中其它治疗选自常规化疗药物如顺铂、阿糖胞苷、环己基氯乙基亚硝基脲、环磷酰胺、吉西他滨、异环磷酰胺、甲酰四氢叶酸、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂以及包括紫杉醇在内的紫杉烷类和长春地辛；激素疗法例如阿那曲唑、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮和泼尼松；单克隆抗体疗法例如西妥昔单抗(抗-EGFR);蛋白激酶抑制剂如达沙替尼、拉帕替尼；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如伏立诺他；血管发生抑制剂如舒尼替尼、索拉非尼、来那度胺；mTOR抑制剂如坦西莫司；以及伊马替尼。36.生产根据权利要求1至26的任一项的18,21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌抹，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素或其类似物；b)向所述菌林饲喂非天然的起始单元；c)在用于生产18，21-双脱氧麦克菌素类似物的合适的条件下培养所述宿主菌林；和d)任选地分离所生产的化合物。37.根据权利要求36的方法，其中所述方法额外包括步骤e)缺失或灭活一个或多个起始单元生物合成基因或其同源物，所述步骤通常在步骤c)前发生。38.根据权利要求36或权利要求37的方法，其中所述方法额外包括步骤f)缺失或灭活一个或多个后-PKS基因，所述步骤通常在步骤c)前发生。39.权利要求36至38的任一项的方法，其中步骤b)的非天然起始单元是3-氨基苯甲酸。40.权利要求36至38的任一项的方法，其中步骤b)的非天然起始单元是5-M-2-氟苯甲酸。41，权利要求36至38的任一项的方法，其中步骤b)的非天然起始单元是5-M-3-氟苯曱酸。42.权利要求36至38的任一项的方法，其中步骤b)的非天然起始单元是5-M-2，3-二氟苯曱酸。43.权利要求36至38的任一项的方法，其中步骤b)的非天然起始单元是5-氨基-2，3，6-三氟苯甲酸。44.根据权利要求36至43的任一项的方法，其中步骤a)中菌抹是麦克菌素生产菌林。45，根据权利要求36至44的任一项的方法，其中步骤a)中菌林M于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活一个或多个起始单元生物合成基因。46.才艮据权利要求36至45的任一项的方法，其中步骤a)中菌林M于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活一个或多个后-PKS基因。47.根据权利要求46的方法，其中步骤a)中菌林是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了mbcM以及任选地其它后-PKS基因。48.根据权利要求47的方法，其中步骤a)中菌林是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了mbcM。49.根据权利要求47的方法，其中步骤a)中菌林是基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了mbcM、mbcMTl、mbcMT2、mbcP和mbcP450。50.基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了mbcM以及任选地其它后-PKS基因。51.基于麦克菌素生产菌林的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了mbcM，以及任选地其它后-PKS基因和/或起始单元生物合成基因。52.根据权利要求50或51的被改造的菌林，其中已经缺失或灭活了mbcM。53.根据权利要求50或51的被改造的菌抹，其中已经缺失或灭活了mbcM、mbcMTl、mbcMT2、mbcP和mbcP450。54.根据权利要求50至53的任一项的被改造的菌抹，其中麦克菌素生产菌抹是珍贵束丝》文线菌(j/)m"》sm附)或奇迹束丝方文线菌附,'ra附)。55.根据权利要求50至54的任一项的被改造的菌林在制备18,21-双脱氧麦克菌素类似物或其可药用的盐中的用途。56.根据权利要求55的用途，其中18，21-双脱氧麦克菌素类似物是由权利要求1至26的任一项定义的。全文摘要本发明涉及在例如治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗中有用的18，21-双脱氧麦克菌素类似物。本发明还提供了生产这些化合物的方法和它们在药物中的用途，特别是在癌症或B细胞恶性肿瘤的治疗和/或预防中的用途。式(I)，其中R₁代表H、OH、OMe；R₂代表H或Me；R₃代表H或CONH₂；R₄和R₅或者都代表H或者一起代表键(即C4至C5是双键)；R₆代表H或F；R₇代表H或F；以及R₈代表H或F。文档编号C07D225/00GK101460465SQ200780016558公开日2009年6月17日申请日期2007年5月9日优先权日2006年5月9日发明者C·马丁,M·张,N·科茨,S·盖瑟,S·莫斯,W·沃乌斯登申请人:百奥帝卡技术有限公司