花生过敏源蛋白的特征肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种花生过敏源蛋白的特征肽及其应 用。
【背景技术】
[0002] 花生也是一种常见的过敏源食物，由它引起的过敏反应占食物过敏的1%~ 20%。目前，公认的花生致敏蛋白有13种。其中，Ara hi和Ara h2是主要花生过敏源，分 别约占花生蛋白总量的12~16%和5. 9-9. 3%，都能被90%以上的花生过敏患者血清所识 另Ij。Ara hi在天然状态下主要是以单聚体和三聚体形式存在的水溶性蛋白，包含23个线性 IgE结合位点。Ara h2存在两种异构体，包含10个线性IgE结合位点。Ara h2稳定性高、 耐酶解，主要原因是Ara h2含有大量二硫键，用以保持其结构稳定。Ara h2具有典型的胰 蛋白酶抑制剂的结构，并且经过烘烤处理后，Ara h2蛋白的抑制剂活性被显著提高。
[0003] 目前，检测食物中花生过敏源成分主要有2种方法。一种是基于DNA检测的方法， 如聚合酶链式反应（PCR)。该方法灵敏度高，特异性强，但是由于不直接检测致敏蛋白，故 无法进行定量分析。此外，现代食品工业可以将蛋白质和DNA完全分离开来，所以PCR法有 假阴性的风险。另外一种基于蛋白的检测方法，如酶联免疫法（ELISA)。此方法也具有高 灵敏度、高特异性等特点，但该应用方法在热加工食品中的检测结果通常会低于真实值，主 要因为热处理会使蛋白质变性，降低蛋白质溶解度，同时改变蛋白质表面位点，使其不易被 抗体正确识别。此外，ELISA法采用抗原抗体技术不可避免会产生交叉反应，导致假阳性现 象，也会影响最终检测结果。
[0004] 现阶段有人尝试将蛋白质组学与液质联用技术运用到对蛋白质的定性定量分 析中。Heick 等（Heick，J.，M. Fischer，and B. Flipping, First screening methodfor the simultaneous detection of seven allergens by liquid chromatography mass spectrometry. Journal of Chromatography A，2011. 1218(7) :p. 938-943)和 Shefcheck 等人（Shefcheck，K. J. and S. M. Musser? Confirmation of the allergenic peanut protein， Ara hi， in a model food matrix using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC/MS/MS). Journal of agricultural and food chemistry， 2004. 52(10) :p. 2785-2790)先后建立应用酶解技术和液质联用技术检测花生过敏蛋白的 方法。Lutter P 等（Lutter，P.，V.Parisod，and H.Weymuth，Development and validation of a method for the quantiftcation of milk proteins in food products based on liquid chromatography with mass spectrometric detection. Journal of AOAC Intemational，2011. 94(4) :p. 1043-1059.)在检测过程中，在预处理结束后加入了稳 定同位素标记的特征肽作为内标，以校正基质效应对质谱离子化带来的影响。Zhang等 (Zhang， J. ， et al. ， Determination of bovine lactoferrin in dairy products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on tryptic signature peptides employing an isotope-labeled winged peptide as internal standard. Analytica chimica acta，2014. 829 :ρ· 33-39.)和 Chen 等（Chen，Q.， et al. ， Quantification of bovine β -casein allergen in baked foodstuffs based on ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Food Additives&Contaminants:Part A，2015. 32(1) :p. 25-34)人在稳定同位素标记的特征肽 的基础上，根据蛋白质原有序列，向氮端和碳端各延长了 6-8个氨基酸。该多肽在酶解之前 加入样品中，可在酶的作用下形成同位素标记的特征肽，所以它除了能对离子化过程进行 校正之外，还能校正基质对酶切过程造成的干扰，使建立的方法较之前的方法更加准确可 与巨O
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种花生过敏源蛋白的特征肽、内标物和试剂盒以及质谱联用检测 花生过敏源蛋白的方法，该方法具有较高的灵敏度、回收率和精密度。
[0006] 一种花生过敏源蛋白的特征肽，氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR。
[0007] 上述特征肽分别从花生致敏蛋白Ara hi和Ara h2酶解后产生的多肽中筛选获 得，其具有高度特异性、良好的稳定性和较高的灵敏度。
[0008] 针对上述花生过敏源蛋白的特征肽，进行同位素标记，获得同位素标记的特征肽 (简称：同位素特征肽），其氨基酸序列为DL*AFPGSGEQV*EK或NL*PQQCGL*R，其中L*为碳 氮全同位素标记的氨基酸。
[0009] 本发明还提供了一种用于检测花生过敏源蛋白的内标物，氨基酸序列为 IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ 或 QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中 L* 和 V* 为碳氮全同位 素标记的氨基酸。
[0010] 本发明还公开了一种液质联用检测花生过敏源蛋白的试剂盒，包括特征肽和内标 物，所述特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述内标物的氨基酸序列为 IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ 或 QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中 L* 和 V* 为碳氮全同位 素标记的氨基酸。
[0011] 上述试剂盒中还包括：同位素特征肽、二硫苏糖醇（DTT)、碘乙酰胺（IAA)、胰蛋白 酶、碳酸氢铵和甲酸。
[0012] 上述试剂盒可用于检测花生过敏源蛋白，尤其适合检测热加工食品中的花生过敏 源蛋白。
[0013] 本发明还提供了一种液质联用检测花生过敏源蛋白的方法，包括：
[0014] (1)配制系列含花生过敏原蛋白的特征肽和同位素标记特征肽的标准溶液，利用 液质联用进行分离检测，计算特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，线性回归得到方程Y =kX+b，其中Y为特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，X为特征肽的浓度；
[0015] 所述特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述同位素标记特征 肽的氨基酸序列为DL*AFPGSGEQV*EK或NL*PQQCGL*R ;
[0016] (2)取待测样品，与内标物混合溶于水后进行酶解，在相同条件下对酶解液利用液 质联用进行分离检测，计算特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，根据所述方程得到酶 解液中所述特征肽的浓度，最后计算得到样品中花生过敏源蛋白的含量。
[0017] 上述方法采用的是内标法，具体计算过程和原理如下：
[0018] 将花生过敏源蛋白的特征肽和经同位素标记的花生过敏源蛋白的特征肽配制成 系列浓度的标准工作曲线溶液，并通过液质联用的分析方法进行分离检测，制作标准工作 曲线，根据得到的标准工作曲线中花生过敏源蛋白的特征肽和同位素标记特征肽的峰面积 比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得到线性方程Y = kX+b，其中，Y为特征肽和同位素标 记特征肽的峰面积比，X为特征肽的摩尔浓度，单位为nM ;k为线性方程的斜率；b为线性方 程的截距；
[0019] 酶解后的酶解液采用上述相同条件的液质联用的分析方法进行分离检测，获 得酶解液中特征肽和同位素标记特征肽峰面积比，然后代入上述线性方程，即可计算得 到样液中花生过敏源蛋白的特征肽的摩尔浓度；最后，将该浓度代入含量计算公式Cx = (naXMrXXf2)/W，即可得到被测样品中花生过敏源蛋白的特征肽的含量C x(其中，Cx为花 生致敏蛋白浓度，单位为mg/100g;na为由线性方程获得