孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]孔鳐(Raja porosa)别名喀氏鳐，俗称劳板鱼、劳子、甫鱼、铧子鱼、锅盖鱼、虎色、夫鱼、鲂鱼，属于软骨鱼纲Chondrichthyes、鳐形目Rajiformes、鳐科Rajidae、鳐属Raja的鱼类。分布于北太平洋西部，中国的东海、南海及黄海、渤海均产之。
[0003]孔鳐亦为我国常见海洋药物，全身多部位可以入药，例如其肝味甘，性平。归胃、肺经。具有滋补强壮，明目，止痛，健骨等功效。对治疗夜盲症，软骨症，干燥性眼炎，营养不良，佝偻病，久病体虚，肺结核等疾病均有疗效，还用于孕妇及幼儿的滋补剂。并且具有散瘀止痛，祛风除湿，生肌敛疮，解毒消肿之功效。主治风湿性关节炎，疮疖，跌打肿痛，溃疡等症。现代研究证明，孔鳐软骨多糖和蛋白具有显著的生物活性，能够很好的抑制肿瘤新生血管的生成。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法包括以下步骤:
1)孔鳐软骨总蛋白粗提物的制备:称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的孔鳐软骨浸于4?6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA，pH 7 ?8)，于 4 °C下搅拌抽提 36 ?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min离心15?25 min,弃残渣收集上清液；上清液继续在4 °C、10000?12000 r/min离心15?25 min，取上清液用0.22 μπι微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液于4 °C下透析24?48 h，透析袋内溶液即为孔鳐软骨总蛋白粗提物。
[0006])孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取孔鳐软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 °C下静置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速离心20 min,取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得孔鳐软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白。
[0007])孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取孔鳐软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比lg:3?5 mL溶于Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9X104U/g)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90°C、10 min灭酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min离心15?25 min,弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液。
[0008])孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备:将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得抗氧化肽。
[0009]作为优选，所述的步骤1)中的孔鳐为孔鳐(Raja porosa)。
[0010]作为优选，所述步骤4)的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为:
离子交换树脂层析:将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45?55 mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；
凝胶柱层析:将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45?55 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性得1个高活性抗氧化肽Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)，ES1-MS 测定分子量为 700.71 Da0
[0011]再优选，所述RP-HPLC条件为:进样量10?15 μ L ;色谱柱Zorbax SB- C18 (250mmX4.6 mm, 5 μπι);流动相:水-乙腈梯度洗脱(0?32min乙腈浓度由0勾速升至50%)；洗脱速度0.6-1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
[0012]与现有技术相比，本发明所提供的孔鳐软骨蛋白抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。
【附图说明】
[0013]图1是本发明的DEAE-52离子交换树脂层析图。
[0014]图2是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G_15层析图。
[0015]图3葡聚糖凝胶S印hadex G_15制备酶解物的RP-HPLC分析。
[0016]图 4 Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)的质谱图。
[0017]图5 G1 y-G 1 u-G 1 u-G 1 y-Pro-Arg-G 1 y (GEEGPRG)的抗脂质氧化能力。
【具体实施方式】
[0018]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0019]实施例:
一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下:孔鳐软骨一软骨总蛋白—软骨60%丙酮沉淀蛋白一胰蛋白酶酶解一酶解物一超滤一离子交换层析一凝胶过滤层析一高效液相色谱制备一抗氧化肽。
[0020])孔鳐软骨总蛋白粗提物的制备:称取孔鳐porosa)软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的孔鳐软骨浸于4倍体积的1.0mol/L 盐酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA，pH 7.0)，于 4 °(:下搅拌抽提48 ho提取液在4 °C下以5000 r/min离心20 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 °C ,12000 r/min离心20 min，取上清液用0.22 μ m微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液于4 °C下透析48h，透析袋内溶液即为孔鳐软骨总蛋白粗提物。
[0021])孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取孔鳐软骨总蛋白粗提物，在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 °C下静置5 h后，于4 °C、10000 r/min高速离心20min,取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得孔鳐软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，得60%丙酮分级沉淀蛋白。
[0022])孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取孔鳐软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比lg:4mL溶于Tris-盐酸缓冲液(0.05mol/L，pH 8.0)，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(1.9父1041]/^)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min灭酶活，酶解液于4 °C ,12000 r/min离心20 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液