一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种食用菌蛋白肽?钙螯合物的制备方法，包括：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食用菌中的蛋白质；采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶对食用菌蛋白进行限制性酶解后，灭酶，制备食用菌蛋白酶解液；利用无机物氯化钙中的钙与食用菌蛋白肽螯合获得食用菌蛋白肽?钙螯合物。本发明通过碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法可显著提高食用菌蛋白的提取率；通过控制酶解时间可有效控制蛋白的降解程度；多肽?钙螯合物制备工艺简单；本发明制备的钙?肽螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙，必将成为钙补充剂的首选；本发明为食用菌的应用提供了一条新思路。
【专利说明】
一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，属于食品生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 钙是人体必需元素之一，参与机体多种生理活。缺钙会造成人体许多疾病，使人体 进入亚健康状态，因此，补钙成为人们长期关注的话题。传统的无机钙盐，如碳酸钙、磷酸 钙、氯化钙等，对维生素有一定破坏作用，生物学效价较低;有机钙盐，如柠檬酸钙、乳酸钙、 葡萄糖钙等，虽然钙吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且价格高。近年来，氨基酸螯合 钙由于易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙，而成为补钙首选。但是，研究 表明，多肽螯合钙由于其独特的螯合体制和转运机制，使其比氨基酸螯合钙更易于被吸收 且具有更快的吸收速度。因此，有一定生物功能的多肽螯合钙具有广阔的发展空间。
[0003] 食药用菌是一大类有大型子实体的高等真菌，俗称蘑菇或蕈，含有人体所需要的 多种营养成分，蛋白质含量非常高，如金针菇的蛋白质含量达20.9%，草菇中蛋白质含量达 25.9%，大大超过我们常食的蔬菜和粮食食品，也超过畜禽品的蛋白质含量。食药用菌富含 各类氨基酸，如香菇、平菇、银耳等氨基酸总量平均为15.76%(干重），必需氨基酸总量平均 为6.43% (干重），其味道鲜美与菇体内含大量游离氨基酸与核苷酸有关。因此，食药用菌中 的蛋白水解产生的多肽与普通动植物蛋白相比具有更丰富的生物活性和更高的营养价值。 [0004]利用生物技术对食药用菌(香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、 金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花、猴头菇等)进行蛋白质资源的深加工，进行生物 活性肽的筛选和提取分离，然后利用氯化钙进行螯合，制备多肽-钙螯合物。这种食药用菌 生物活性多肽-钙螯合物在不同酸碱条件下稳定性好，能显著提高钙元素的吸收率和利用 率，而且还具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂和降血糖等活性，有很高的开发价值和应用 前景，同时能提高食药用菌的附加值，为食药用菌资源的利用开辟了新的途径，具有广阔的 市场前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种食用菌蛋白肽-钙螯合物 的制备方法，具有工艺操作简便、安全性高的优点。
[0006] 本发明的食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，包括如下步骤： (1 )、利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食用菌中的蛋白质； (2) 、采用蛋白酶对食用菌蛋白进行有限酶解，灭酶，制备食用菌蛋白多肽复合物溶液； (3) 、采用固体高温混合法或者液体螯合法使无机物氯化钙中的钙与食用菌蛋白肽进 行螯合，制备食用菌蛋白肽-钙螯合物； (4) 、将食用菌蛋白肽-钙螯合物进行冷冻干燥。
[0007] 具体步骤如下： 步骤（1)中，所述碱溶酸沉法的具体步骤如下：首先将食用菌超微粉碎，将粉碎后的食 用菌与蒸馏水以1:20-60 w/v的比例混合，利用0.5-2wt.%的NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-l 1.0 ， 超声提取 10-50min ， 水浴提取 60-120min ， 温度 50-100 °C ， 提取后过滤， 滤液为碱提的 食用菌蛋白溶液，用盐酸调节碱提的食用菌蛋白溶液pH至2.5-4.0进行蛋白沉淀，3000-5000r/min离心5-10min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食用菌蛋 白。
[0008] 步骤（1)中，所述硫酸铵沉降法的具体步骤如下：首先将食用菌超微粉碎，将粉碎 后的食用菌与蒸馏水以l:20-60w/V的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达 40-60wt .%，3000-5000r/min离心5-10min得食用菌蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥 得食用菌蛋白。
[0009] 步骤(2)中，将食用菌蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0-5.0%，用0.5-2wt. % 的NaOH或K0H溶液将pH调节到7.0-11.0，温度保持在40-60 °C，加入1.0-5. Owt. %蛋白酶，水 解30-90min，灭酶，得到食用菌蛋白多肽复合物溶液。
[0010] 步骤(2冲所述酶采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
[0011] 步骤(3)中，将步骤(2)得到的食用菌蛋白多肽复合物溶液冷冻干燥，然后将氯化 钙粉末和食用菌蛋白肽冻干粉按照质量比1:6-5:6混合，高温100-150 °C加热制备食用菌蛋 白肽-钙螯合物;或者将步骤(2)得到的食用菌蛋白多肽复合物溶液中加入0.5-2mol/L氯化 钙溶液，两者体积比为6:1-6:5，搅拌均匀，调节pH3.0-9.0，在30-80 °C条件下持续反应1.0- 2. Oh，反应后冷却，离心分离去除杂质，滤液中加入3-5倍体积的75-95%( V/V)乙醇，沉淀静 置12-24h，离心去除上清液，获得食用菌蛋白肽-钙螯合物。
[0012] 步骤(4)中，螯合反应结束后，将食用菌蛋白肽-钙螯合物冷冻干燥。
[0013] 所述食用菌包括:香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、金针菇、 杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花、猴头菇等食药用菌中的一种。
[0014] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食用菌 中的蛋白提取率高，目前较少关于食用菌蛋白提取的文献报道;通过控制食用菌蛋白酶解 时间，得到具有高钙螯合活性的生物活性肽;通过与无机物氯化钙中的钙进行螯合，制备有 机的生物活性肽-钙螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、 可同时补充氨基酸和钙离子。本发明为食用菌的应用提供了一条新思路，为开发有机钙营 养补充剂与功能性食品提供理论依据和技术支持。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 第一步:将杏鲍菇超微粉碎，将粉碎后的杏鲍菇与蒸馏水以w/v 1:20的比例混合，利用 2%Na0H调节PH至9.0，超声提取10min，水浴提取60min，温度60 °C，提取后用纱布过滤，滤液 为碱提的杏鲍菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的杏鲍菇蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀， 4000r/min离心5min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得杏鲍菇蛋白， 其提取率达74.16%。
[0016]第二步:将杏鲍菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达3.0%，用NaOH溶液将杏鲍菇 蛋白溶液pH调节到9.0，温度保持在50°C，加入3.0%中性蛋白酶，水解90min，灭酶，得到杏鲍 菇蛋白多肽复合物溶液。
[0017]第三步：将杏鲍菇蛋白多肽复合物溶液按氯化钙与多肽体积比为1:6比例加入 1. Omol/mL氯化钙溶液，搅拌均匀，调节pH8.0，在30 °C条件下持续反应1. Oh，反应后冷却，离 心分离去除杂质，加入6倍体积75%的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得杏鲍菇蛋白 肽-钙螯合物。冷冻干燥。
[0018] 测定方法:待螯合反应结束后，准确移取5 mL未乙醇沉淀的反应液于50 mL离心 管中，加入30 mL无水乙醇，震荡，离心（8000 r /min，10 min)，测定沉淀物(螯合钙）中 的钙含量（Wo);同时再准确移取5 mL未乙醇沉淀的反应液，直接测定总钙含量（Wi)。
[0019]螯合率(％)= /Wi X 100% (1) 采用EDTA络合滴定法测定钙含量:精确移取试样。于50mL烧杯，加混合酸消化液5mL， 上盖表面皿置于电炉上加热消化如未消化好而酸液过少时，再补加几毫升混合酸消化液， 继续加热消化，直至无色透明为止。加几毫升水，加热以除去多余的硝酸待烧杯中液体接近 5 mL时，取下冷却，获得消化试样。分别吸取0.5mL试样消化液及空白于试管中，加1滴氰化 钠溶液和〇. 1 mL柠檬酸钠溶液，用滴定管加1.5 mL，1.25mol/L氢氧化钾溶液，加3滴钙红指 示剂，立即以稀释10倍H)TA溶液滴定，至指示剂由紫红色变蓝为止。
式(2)中： X:试样中钙含量，单位为毫克每百克(mg/100 g); T: EDTA滴定度，单位为毫克每毫升(mg/mL); V:滴定试样时所用H)TA量，单位为毫升(mL); Vo:滴定空白时所用H)TA量，单位为毫升(mL); f:试样稀释倍数； M:试样质量，单位为克(g)。
[0021]最终测定制备的杏鲍菇蛋白肽-钙螯合物的螯合率为89.7%。
[0022] 实施例2 第一步:将竹荪超微粉碎，将粉碎后的竹荪与蒸馏水以w/v 1:60的比例混合，利用1% NaOH调节PH至11.0，超声提取50min，水浴提取120min，温度100°C，提取后用纱布过滤，滤液 为碱提的竹荪蛋白溶液，用盐酸调节碱提的竹荪蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀，离心得沉 淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得竹荪蛋白，其提取率达72.81%。
[0023]第二步:将竹荪蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达3.0%，调节pH至7.0，温度保持 在60°C，加入3.0%复合蛋白酶，水解60min，灭酶，得到竹荪蛋白多肽复合物溶液。
[0024]第三步：将竹荪蛋白多肽复合物溶液按氯化钙与多肽体积比为1 : 2比例加入 0.5mol/mL氯化钙溶液，搅拌均匀，调节pH7.0，在30 °C条件下持续反应1. Oh，反应后冷却，离 心分离去除杂质，加入5倍体积95%的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得竹荪蛋白 肽-钙螯合物。螯合反应结束后，冷冻干燥。
[0025]待螯合反应结束后，准确移取5 mL未乙醇沉淀的反应液于50 mL离心管中，加入 30 mL无水乙醇，震荡，离心（8000 r /min，10 min)，测定沉淀物（螯合|丐）中的|丐含量（ W〇);同时再准确移取5 mL未乙醇沉淀的反应液，直接测定总钙含量（W〇。
[0026]螯合率(％)= WQ /WiXlOO% (1) 采用EDTA络合滴定法测定钙含量:精确移取试样。于50mL烧杯，加混合酸消化液5mL， 上盖表面皿置于电炉上加热消化如未消化好而酸液过少时，再补加几毫升混合酸消化液， 继续加热消化，直至无色透明为止。加几毫升水，加热以除去多余的硝酸待烧杯中液体接近 5 mL时，取下冷却，获得消化试样。分别吸取0.5mL试样消化液及空白于试管中，加1滴氰化 钠溶液和〇. 1 mL柠檬酸钠溶液，用滴定管加1.5 mL，1.25mol/L氢氧化钾溶液，加3滴钙红指 示剂，立即以稀释10倍H)TA溶液滴定，至指示剂由紫红色变蓝为止。
式(2)中： X:试样中钙含量，单位为毫克每百克(mg/100 g); T: EDTA滴定度，单位为毫克每毫升(mg/mL); V:滴定试样时所用H)TA量，单位为毫升(mL); Vo:滴定空白时所用H)TA量，单位为毫升(mL); f:试样稀释倍数； M:试样质量，单位为克(g)。
[0028] 最终测定制备的竹荪蛋白肽-钙螯合物的螯合率为92.8%。
[0029] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 蛋白提取:利用碱溶酸沉法提取食用菌蛋白或用硫酸铵沉降法提取食用菌蛋白； (2) 酶解:采用蛋白酶对提取的食用菌蛋白进行有限酶解，灭酶，制备食用菌蛋白多肽 复合物溶液； (3) 多肽-钙螯合物制备：利用固体高温混合法或者液体螯合法制备食用菌蛋白肽-钙 螯合物； (4) 将食用菌蛋白肽-钙螯合物进行冷冻干燥。2. 根据权利要求1所述一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于:所述食 用菌包括:香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹 荪、灵芝、灰树花、猴头菇等食药用菌中的一种。3. 根据权利要求1所述一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于:步骤（1) 中，所述碱溶酸沉法的具体步骤如下:首先将食用菌超微粉碎，将粉碎后的食用菌与蒸馏水 以1:20-60 w/v的比例混合，利用0.5-2wt. %的NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-11.0，超声提取 10-50min，水浴提取60-120min，温度50-100°C，提取后过滤，滤液为碱提的食用菌蛋白溶 液，用盐酸调节碱提的食用菌蛋白溶液pH至2.5-4.0进行蛋白沉淀，3000-5000r/min离心5-lOmin得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食用菌蛋白。4. 根据权利要求1所述一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于:步骤（1) 中，所述硫酸铵沉降法的具体步骤如下:首先将食用菌超微粉碎，将粉碎后的食用菌与蒸馏 水以1:20-60w/v的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt. %，3000-5000r/min离心5-10min得食用菌蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得食用菌蛋白。5. 根据权利要求1所述一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于:步骤(2) 中，所述酶解的具体步骤如下:将食用菌蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0-5.0%，调节 pH至7.0-11.0，温度保持在40-60°C，加入1.0-5. Owt. %蛋白酶，水解30-90min，灭酶，得到食 用菌蛋白多肽复合物溶液。6. 根据权利要求5所述的一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于所述酶 采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。7. 根据权利要求1所述一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于步骤(3) 中，所述固体高温混合法制备多肽-硒螯合物的具体步骤如下:将氯化钙粉末和食用菌蛋白 肽冻干粉按照质量比1:6-5:6混合，高温100-150°C加热制备食用菌蛋白肽-硒螯合物。8. 根据权利要求1所述一种食用菌蛋白肽-钙螯合物的制备方法，其特征在于:步骤(3) 中，所述液体螯合法制备多肽-硒螯合物的具体步骤如下:食用菌蛋白多肽复合物溶液加入 0.5-2mol/L氯化钙溶液，两者体积比为6:1-6:5，搅拌均匀，调节pH为3.0-9.0，在30-80°C条 件下持续反应1.0-2. Oh，反应后冷却，离心分离去除杂质，获得的滤液加入3-5倍体积的75-95%乙醇，沉淀静置12-24h，离心去除上清液，获得食用菌蛋白肽-钙螯合物。
【文档编号】C07K1/30GK105821104SQ201610187975
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】刘斌, 赵立娜, 陈濠, 陈紫红, 肖正, 林占熺, 吕旭聪, 赵超
【申请人】福建农林大学