酪蛋白衍生肽及其治疗用途的制作方法

专利名称：酪蛋白衍生肽及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及衍生于奶酪蛋白或与奶酪蛋白αS1部分N末端序列相似的生物活性肽。这些肽能够刺激并增强免疫应答，保护避免病毒感染，使血清胆固醇水平正常化，并能刺激造血。酪蛋白衍生肽无毒，可以用来治疗、预防免疫性疾病、高胆固醇血症、血液系统疾病和病毒相关性疾病。
背景技术：
营养物质中的生物活性分子很多食物除了营养价值外，消化过程中产生的某些部分和产物还具有影响生理过程的作用。这些“外营养”组分中的一部分以其活性形式存在于完整的营养品中，如母乳和初乳中的免疫球蛋白，豆制品中的植物雌激素，水果和维生素中的多酚抗氧化物。其他组分则加密于营养分子中，在消化或食物分解过程中以活性形式释放，如来自乳球蛋白的抗高血压肽[Kitts，D.D.(1999)，Can.J.Physiol.Pharmacol.724；423-434]。
乳蛋白中的生物活性乳蛋白中的主要成分酪蛋白，根据其电泳迁移性习惯上被定义为含有三个部分，α、β和γ[N.J.Hipp，et al.(1952)，Dairy Sci.，35272]。如今，根据每一亚群的氨基酸序列定义酪蛋白，包括αS1，αS2，β和κ[W.N.Engel et al.(1984)，J.Dairy Sci.671599]。
在消化过程中，酪蛋白主要在酸性蛋白酶，如凝乳酶(凝乳酶)、胰蛋白酶和胃蛋白酶的作用下进行蛋白裂解，产生更短的肽，这种肽通过与钙的螯合作用导致凝化。针对乳化合物的几项研究显示了酪蛋白相关性杀菌活性。美国专利3,764,670披露，酪蛋白的蛋白水平消化产物具有针对微生物的抗生素特性。以色列专利42863描述了一种含有酪蛋白N末端23个氨基酸的酪蛋白衍生肽，该肽具有抗菌活性。此外，酪蛋白或其衍生物还具有其他生理活性，如阿片样和生长因子样活性[Kitts，D.D.，(1999)ibid]。
在酪蛋白肽中还观察到免疫调节活性。Coste et al.(1992，Immun.Lett.3341-46)观察到，在应用β酪蛋白C末端衍生肽处理大鼠后，淋巴细胞增生能力增强。但是，这些研究中没有一项研究确定了这些酪蛋白肽中决定“外营养”作用的特异序列。
肿瘤治疗中的造血作用大剂量化疗后，特别是采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持的大剂量清髓性放化疗后，患者由于全血细胞减少而面临高度危险。在移植早期，粒细胞减少可以导致严重的、有时甚至是致命性感染并发症的发生，这些感染可以是常见细菌、病毒、真菌和寄生虫引起的。同样，血小板减少通常导致出血倾向，有时甚至需要长期依赖血小板。一旦发生血小板抵抗，出血事件就可能威胁生命，出血性并发症通常是致命的。由于粒细胞减少引起的危险可以通过支持性治疗手段得到部分缓解，最有效的方法是应用能够增强粒细胞重建的人重组细胞因子，特别是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。这些药物非常昂贵(大约每名患者每天需要200-400美圆)，由于过敏反应、发热、骨痛可以导致少见不良反应，偶尔发生血管渗漏综合征，包括心包炎和胸膜炎。有些不良反应也可能是由于这些造血生长因子刺激释放的其他细胞因子导致的。而且，这些造血生长因子在某些肿瘤细胞携带G-CSF或GM-CSF受体的患者中还禁止应用，如急性和慢性髓细胞白血病以及骨髓增生异常综合征。尽管通过应用造血细胞因子在全血细胞减少患者的治疗中取得了长足进展，但是在血小板减少的治疗方面却毫无建树。在大剂量化疗特别是ASCT后，患者面临血小板减少的危险可能持续数月，甚至长达3年，一些血小板减少症患者可能终生无法恢复。很多患者由于以前应用多种血液制品治疗而产生血小板抵抗，因此即使应用单一供体的血小板进行频繁密集输注，也可能使血小板减少症变得无法战胜，甚至只是暂时缓解也不可能。血小板抵抗和血小板减少症的长时间持续，是世界范围内ASCT中心(患者)死亡的常见原因。
目前，正在研究几种新的重组细胞因子，如重组人白细胞介素-3(rhIL3)和重组人白细胞介素-6(rhIL6)，作为增强巨核细胞生成和血小板重建的潜在物质。不幸的是，临床预试验显示，尽管rhIL3和rhIL6可以增强血小板重建，但是这些作用不显著，而且费时很长。
很明显，血小板减少症的长时间持续是目前临床骨髓移植中心的一个主要问题，对于这一问题，迄今为止尚无满意的解决方案。
因此，存在这样一种具有共识的需求，就是在避免上述限制的情况下，发展一种安全、便宜、疗效迅速、定义良好的造血细胞生成刺激因子，特别是巨核细胞生成刺激因子，这种因子将具有很大的优势。
酪蛋白的αS1部分可以通过多种方法从乳蛋白中获得酪蛋白αS1部分[D.G.Schmidthand T.A.J.Paynes(1963)，Biochim.，Biophys.Acta，78492；M.P.Thompsonand C.A.Kiddy(1964)，J.Diary Sci.，47626；J.C.Mercier，et al.(1968)，Bull.Soc.Chim.Biol.50521]，J.C.Mercier，et al(1968)(Eur.J.Biochem.2341)还测定了酪蛋白αS1部分的完整氨基酸序列。通过重组DNA技术，还克隆了牛酪蛋白αS1部分的基因组和编码序列，并进行了测序[D.Koczan，etal.(1991)，Nucl.Acids Res.19(20)5591；McKnight，R.A.，et al(1989)，J.Dairy Sci.722464-73]。文献记载了酪蛋白αS1部分N末端片段的蛋白水解和鉴定[JC.Mercier，et al(1970)(Eur.J.Biochem.16439；P.L.H.McSweeney et al.(1993)，J.Diary Res.，60401)，在摄入完整的乳蛋白后，经小肠吸收，哺乳动物血浆中出现该片段[Fiat，A.M.，et al.(1998)Biochimie，80(2)2155-65]。Meisel，H and Bockelmann，W.[(1999)，AntonieVan Leeuwenhoek，76207-15]在乳酸杆菌消化酪蛋白α和β部分形成的肽文库中探测了免疫肽、casokinin和酪啡肽的氨基酸序列。特别令人感兴趣的是，α和κ酪蛋白部分的C末端部分显示了抗聚集和溶血活性[Chabance，B.et al.(1997)，Biochem.Mol.Biol.Int.42(1)77-84；Caen J.etal.(1993)，J.Dairy Sci.76(1)301-310]。以前的研究记载了存在于αS1氨基酸序列N末端的潜在生物活性肽，但是没有提及应用这些蛋白片段、特异性序列或定义的合成肽来增强造血功能，预防病毒感染或调节自身免疫性疾病的发生。
发明概述根据本发明，提供了一种预防或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防病毒感染的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导造血的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖和分化的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导巨核细胞生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导红细胞生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导白细胞生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种诱导血小板生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗血小板减少症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗全血细胞减少症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗粒细胞减少症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高脂血症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高胆固醇血症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗葡尿的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗艾滋病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗HIV感染的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的方法，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防病毒感染的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导造血的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖和分化的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导巨核细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导红细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导白细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导血小板生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗血小板减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗全血细胞减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗粒细胞减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高脂血症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高胆固醇血症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗葡尿的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗糖尿病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗艾滋病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗HIV感染的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的药物组合物，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种在清髓性受体体内增强供体血液干细胞定殖的方法，该方法包括在受体接受供体血液干细胞捐献和植入前，应用αS1酪蛋白N末端部分衍生肽处理提供血液干细胞的供体。
根据本发明，还提供了一种在清髓性受体体内增强供体血液干细胞定殖的方法，该方法包括在受体接受供体血液干细胞植入前，应用αS1酪蛋白N末端部分衍生肽处理供体的血液干细胞。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗自身免疫性疾病。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗病毒性疾病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防病毒感染的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血干细胞增殖的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血干细胞增殖和分化的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导巨核细胞生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导红细胞生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导白细胞生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导血小板生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗血小板减少症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗全血细胞减少症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗粒细胞减少症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗高脂血症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗高胆固醇血症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗葡尿的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗糖尿病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗艾滋病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗HIV感染的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的用途，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持。
根据下述本发明优选实施方案的进一步特征，该肽是衍生于αS1酪蛋白断裂的片段。
根据本发明优选实施方案的进一步特征所述，该肽是合成肽。
根据本发明优选实施方案的进一步特征所述，该肽具有序列1-19公开的序列之一。
根据本发明，还提供了一种纯化的肽，该肽具有选自序列1-19的氨基酸序列。
根据本发明，还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种纯化的肽和药用载体，所述纯化肽具有选自序列1-19的氨基酸序列。
本发明通过提供肽治疗人类疾病，成功超越了目前已知处置的不足，所述肽衍生于αS1酪蛋白N末端部分，没有能检测到毒性，具有高度治疗效果。
附图简述本发明仅通过示例的方式参考附图进行描述。关于图中细节，应该强调的是，具体显示的部分仅是通过示例的方式，为了更好地阐释本发明优选实施方案，而且它的表现方式是为了提供据信是最有效而且最容易理解的方式，来描述本发明的原理和概念方面。就此方面而言，我们并未试图显示比基本理解本发明所需更为详细的本发明结构细节，结合附图，我们的描述会使本领域技术人员明了，在具体实践过程中，如何采取本发明的几种形式。
图中

图1a-b描述了在培养的鼠骨髓细胞中，应用天然酪蛋白衍生肽刺激自然杀伤(NK)细胞活性。在有(+)或没有(-)100μg/ml天然酪蛋白衍生肽存在的情况下，培养的鼠骨髓细胞对35S标记的YAC靶细胞的裂解作用，用YAC细胞释放到培养上清中的总放射活性分数(释放的35S％)来表示。图1a代表的NK活性为效应细胞∶靶细胞比率为25∶1。图1b代表的NK活性为效应细胞∶靶细胞比率为50∶1。
图2描述了在培养的人外周血干细胞(PBSC)中，应用天然酪蛋白衍生肽刺激自然杀伤(NK)细胞活性。培养的人PBSC对35S标记的K562靶细胞的裂解作用，用K562细胞释放到培养上清中的总放射活性分数(释放的35S％)来表示，其中，人PBSC来自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)处理的供体，并应用渐增浓度的天然酪蛋白衍生肽(25-500μg/ml)或不应用(0μg)天然酪蛋白衍生肽孵育。方块代表效应细胞∶靶细胞比率为100∶1，三角代表效应细胞∶靶细胞比率为50∶1。
图3a-3b描述了在培养的人外周血干细胞(PBSC)中，应用天然酪蛋白衍生肽刺激自然杀伤(NK)和T淋巴细胞(T)的增殖。培养的PBSC来自粒细胞集落刺激因子处理的供体，其中的NK和T细胞应用或不应用天然酪蛋白衍生肽孵育，NK和T细胞的增殖用细胞抗体结合百分比(％)来表示，所用抗体为抗CD3/FITC荧光抗T细胞抗体UCHT1，或抗CD56/RPE荧光抗NK细胞抗体MOC-1(DAKO A/S Denmark)。对照为FITC和RPE结合的抗鼠IgG抗体。图3a代表在应用(CD56+肽)或没有应用(CD56)100μg/ml天然酪蛋白衍生肽孵育10天后，培养的人PBSC与荧光抗体CD56(2个独立样本)的结合百分比。图3b代表在应用(+28)或没有应用(-28)100μg/ml天然酪蛋白衍生肽孵育28天后，培养的人PBSC细胞与荧光抗CD3(T细胞)抗体、抗CD56(NK细胞)抗体以及能够与CD3和CD56(T和NK样细胞)抗体同时结合的细胞百分比。
图4描述了在培养的人外周血干细胞(PBSC)中，应用合成酪蛋白衍生肽刺激自然杀伤(NK)细胞活性。培养的人PBSC(来自一名乳腺癌患者)对35S标记的K562靶细胞的裂解作用，用K562细胞释放到培养上清中的总放射活性分数(释放的％)来表示，其中，人PBSC应用渐增浓度的合成酪蛋白衍生肽(10-500μg/ml)或不应用(0μg)合成酪蛋白衍生肽孵育。肽代表αS1酪蛋白N末端部分起始氨基酸的1-8(8)，1-12(12)，1-22(J)，1-24(L)，1-25(M)和1-26(N)的N端序列(合成肽序列见下表3)。
图5a-c描述了应用天然酪蛋白衍生肽刺激多种来源的人培养细胞的增殖。人培养细胞与渐增浓度的天然酪蛋白衍生肽孵育14-21天后，其增殖情况用每个样本中整合的[3H]胸苷的量来表示。图5a代表两个样本(PBSCl，孵育15天；PBSC2，孵育20天)的人外周血干细胞标记元素的整合，所述人外周血干细胞应用或不应用(对照)50-600μg/ml天然酪蛋白衍生肽孵育。图5b代表应用或不应用(对照)50-600μg/ml天然酪蛋白衍生肽孵育培养的人骨髓细胞21天后，[3H]胸苷的整合情况。骨髓来自缓解期肿瘤患者(BM Auto，BM 1和BM 2)或健康志愿者(正常BM)。图5c代表应用或不应用(对照)50-1000μg/ml天然酪蛋白衍生肽孵育培养的人脐带血细胞14天后，[3H]胸苷的整合情况。脐带血细胞由两名独立的供者提供(C.B.1，C.B.2)。
图6显示了一张表，描述了来自人骨髓和脐带血的血液祖细胞与天然酪蛋白衍生肽孵育后的增殖情况。反映培养细胞增殖情况的相对细胞数×104/ml，是通过下面实施例部分所述的计数细胞法测定的。来自健康志愿者的骨髓(骨髓)和来自正常分娩的脐带血(脐带血)在生长因子和AB血清存在的情况下分别孵育13(脐带血)或14(骨髓)天，孵育期间，添加或不添加渐增浓度的天然酪蛋白衍生肽(25-500μg)。
图7描述了清髓性骨髓移植小鼠应用天然酪蛋白衍生肽处理后，刺激外周血白细胞的重建。细胞计数代表白细胞的数量(×106/ml，应用血球计计数)。小鼠(每组10只)接受致死剂量的放射照射，并在9.6天进行同基因骨髓移植(每只鼠106个细胞)，每只鼠还静脉给予1mg天然酪蛋白衍生肽(实验组-+-)或1mg人血清白蛋白(对照组---)。
图8描述了清髓性骨髓移植小鼠应用天然酪蛋白衍生肽处理后，刺激血小板的重建。血小板(PLT)计数代表血小板的数量(×103/ml，应用血球计计数)。小鼠(每组60只)接受致死剂量的放射照射，并在第1天进行同基因骨髓移植(每只鼠106个细胞)，每只鼠还静脉给予1mg天然酪蛋白衍生肽(肽组闭合方框)或1mg人血清白蛋白(HAS组开放方框)。
图9a-f描述了应用荧光显微镜记录的人培养T淋巴细胞对FITC-结合的天然酪蛋白衍生肽的穿透和核摄取。F1和F2是FITC-结合的天然酪蛋白衍生肽的相同部分。如下述实施例部分所述，将Sup-T1细胞与100μg/ml的FITC-结合天然酪蛋白衍生肽共同孵育。孵育期间，清洗细胞，去除游离的标记物质，应用福尔马林固定，准备应用激光扫描共焦显微镜观察、记录。图9a-9f是在连续的孵育期间选择的细胞图象，显示FITC-结合的天然酪蛋白衍生肽穿过Sup-T1细胞膜(图9a，9b)，并集中在细胞核(图9c-9f)。
图10显示了一张表，描述了在与天然酪蛋白衍生肽共同孵育后，Sup-T1淋巴细胞的刺激增殖情况。将Sup-T1细胞(每孔5000)与渐增浓度(50-1000μg/ml)的天然酪蛋白衍生肽共同孵育，培养后在指定时间计数每孔细胞数，并用[3H]胸苷脉冲作用18小时。增殖指数是三个样本中[3H]胸苷的平均整合量与未用天然酪蛋白衍生肽处理的培养细胞(对照)的整合量的比率。
图11显示了一张表，描述了天然酪蛋白衍生肽抑制HIV-1感染CEM淋巴细胞的情况。如下实施例部分所述，在与HIV-1病毒接触前，将CEM细胞与渐增浓度(50-1000μg/ml)的天然酪蛋白衍生肽共同预孵育指定时间(3，24和48小鼠)。感染后第15天，如下实施例部分所述，计数细胞数量，并应用P34抗原法检测HIV-1的感染严重程度。对照培养物为IFCEM细胞未经天然酪蛋白衍生肽预处理而直接与HIV-1病毒接触，以及UIF在相同条件下，培养的CEM细胞未经天然酪蛋白衍生肽处理，并不接触HIV-1病毒。
图12描述了在雌性非肥胖糖尿病小鼠中应用天然酪蛋白衍生肽预防少年型(I型，IDDM)糖尿病的情况。雌性NOD小鼠接受每周一次或两次100μg天然酪蛋白衍生肽注射治疗5周(共注射6或11次)(三角)，或未给予治疗作为对照(方块)，治疗后230天期间，间隔监测葡尿情况。所有的对照小鼠都出现了葡尿，随后死亡。
图13显示了一张表，描述了肿瘤患者注射天然酪蛋白衍生肽后，刺激造血的情况。5名正在接受化疗或已经化疗的女性肿瘤患者的外周血，如上所述，在肌内注射天然酪蛋白衍生肽前(n)后(n+...)，分别计数白细胞总数(WBC，×103)，血小板总数(PLT，×103)，红细胞总数(RBC，×103)和血红蛋白量(g/dl)。患者1是G.T.；患者2是E.C.；患者3是E.S.；患者4是J.R.；患者5是D.M.。
图14描述了天然酪蛋白衍生肽在急性髓细胞白血病(M-1)血小板抵抗患者中刺激血小板生成的情况。血小板重建情况用外周血血小板(PLT，×106/ml)数量变化来表示，血小板计数如上所述，在肌内注射(如下实施例部分所述)100μg天然酪蛋白衍生肽后的指定时间间隔进行。
图15描述了天然酪蛋白衍生肽在急性髓细胞白血病(M-2)血小板抵抗患者中刺激血小板生成的情况。血小板重建情况用外周血血小板(PLT，×106/ml)数量变化来表示，血小板计数如上所述，在肌内注射(如下实施例部分所述)100μg天然酪蛋白衍生肽后的指定时间间隔进行。
优选实施方案陈述本发明涉及衍生于奶酪蛋白或与奶酪蛋白αS1部分N末端序列相似的生物活性肽，含有该生物活性肽的组合物，以及在下述方面应用该生物活性肽的方法，如刺激并增强免疫应答，保护避免病毒感染，使血清胆固醇水平正常化，并刺激造血。该酪蛋白衍生肽无毒，可以用来治疗、预防，例如，免疫性疾病、高胆固醇血症、血液系统疾病和病毒相关性疾病。
参考附图和伴随的描述文字，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细阐述本发明至少一个实施方案前，应该理解，本发明在应用方面并不限于下列描述或实施例阐述的细节。本发明可以包括其他实施方案，也可以用其他多种方式进行实践或操作。同样，应该理解，本文应用的短语或术语目的在于阐述的方便，而不应该理解为是对本发明的限制。
本文所用术语“治疗”包括对疾病病程的基本抑制、延缓或逆转，对疾病临床症状的基本减轻。
本文所用术语“预防”包括基本防止一种疾病临床症状的出现。
本文所用术语“肽”包括原态肽(或者降解产物、合成肽或重组肽)和拟肽(典型的，合成肽)，如类肽和半类肽，它们是肽类似物，可能具有，例如，在机体中使肽更加稳定的修饰作用。这些修饰作用包括但不限于环化，N末端修饰，C末端修饰，肽键修饰，包括但不限于CH2-NH，CH2-S，CH2-S＝O，O＝C-NH，CH2-O，CH2-CH2，S＝C-NH，CH＝CH或CF＝CH，主干修饰和残基修饰。制备拟肽化合物的方法是本领域众所周知的，并在例如，Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press(1992)中有详细描述，该文献在此引入，作为参考。这方面更细节的内容将在本文后半部分给予。
因此，根据本发明，肽可以是环化肽。环化可以通过，例如氨基键形成达到，如，通过在链的不同位点(-CO-NH或-NH-CO键)整合谷氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、Orn、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)达到。主干与主干的环化可以通过整合修饰的氨基酸达到，所述修饰的氨基酸化学式为H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2，其中n＝1-4，R可以是氨基酸的任意天然或非天然侧链。
还可以通过引入两个半胱氨酸残基形成S-S键，达到环化。其他侧链与侧链的环化可以通过在化学式为-(-CH2-)n-S-CH2-C-的分子间形成相互作用键而达成，其中n＝1或2，这可以通过，例如整合半胱氨酸或同型半胱氨酸，使其游离的巯基与，例如溴乙酰赖氨酸、Orn、Dab或Dap反应而达成。
肽内的肽键可以采用下述键来取代，例如N-甲基键(-N(CH3)-CO)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-aza键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任意烷基，如甲基，carba键(-CH2-NH)、羟乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH＝CH-)、retro amide键(-NH-CO-)、肽衍生物(N(R)--CH2-CO)，其中R是自然存在于碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可以在肽链上的任意键发生，甚至可以同时发生几(2-3)处。
可以应用合成的非天然酸如TIC、naphthylelanine(Nol)、苯丙氨酸的环甲基衍生物、苯丙氨酸或氧甲基酪氨酸的卤化衍生物来取代天然芳香氨基酸，色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸。
下面的表1-2列出了所有天然氨基酸(表1)和非传统或修饰氨基酸(表2)。
表1
表2
本发明的肽可以以单独的形式应用，也可以成为等分的一部分，如蛋白质，还可以成为显示等分的一部分，如显示细菌和噬菌体。本发明的肽还可以在某一多肽链或共价交联的侧链中进行化学修饰，成为具有活性的二聚体或多聚体。
此外，本发明的肽可以包括至少4个、任选至少5个、任选至少6个、任选至少7个、任选至少8个、任选至少9个、任选至少10个、任选至少11个、任选至少12个、任选至少13个、任选至少14个、任选至少15个、任选至少16个、任选至少17个、任选至少18个、任选至少19个、任选至少20个、任选至少21个、任选至少22个、任选至少23个、任选至少24个、任选至少25个、任选至少26个、任选至少27和60个、或更多氨基酸残基(在本文还可称为氨基酸)。
因此，应该理解，本文所用术语“氨基酸”或“氨基酸”，包括20种天然氨基酸；这些氨基酸通常在体内进行翻译后修饰，包括，例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他少见氨基酸，包括但不限于2-氨基脂肪酸，羟赖氨酸，异构锁链赖氨素，nor-valine，正亮氨酸和鸟氨酸。而且，术语“氨基酸”还同时包括D型和L型氨基酸。
本文所用术语“衍生于αS1酪蛋白N末端部分”是指如本文该术语所定义的肽，例如，αS1酪蛋白的裂解产物(这里指天然酪蛋白衍生肽)，根据αS1酪蛋白N末端部分氨基酸序列化学合成的合成肽(这里指酪蛋白衍生的合成肽)，与αS1酪蛋白N末端部分相似(同源)的肽及其功能同系物，例如，特征在于一个或多个氨基酸发生取代的肽，例如但不限于允许取代，维持至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的相似性。本文所用术语“同系物”和“功能同系物”是指含有插入、缺失和取代的肽，但这些修饰作用不会影响该肽的生物活性。
本文所用术语“αS1酪蛋白”是指哺乳动物的αS1酪蛋白，哺乳动物包括但不限于家畜哺乳动物(如母牛、绵羊、山羊、母马、骆驼、鹿和水牛)、人和海产哺乳动物。下面提供了一系列已知氨基酸序列的αS1酪蛋白，其GenBank(NCBI)编号和来源CAA26982(绵羊(绵羊))，CAA51022(山羊(山羊))，CAA42516(普通牛(牛))，CAA55185(现代人)，CAA38717(猪(猪))，P09115(兔)和O97943(camelusdromedurius(骆驼))。
本文所用术语“N末端部分”是指从αS1酪蛋白起始60个氨基酸中衍生的αS1酪蛋白的M个氨基酸，其中M可以是5-60之间的任意整数(包括整数5和60)。优选地，该术语指αS1酪蛋白的起始M个氨基酸。
本发明的肽可以如前所述从乳中提取获得，也可以通过固相肽合成法获得，后者是一种本领域技术人员已知的标准方法。可以通过本领域技术人员已知的标准技术对本发明肽进行纯化处理，如高效液相层析(HPLC)。可以应用多种酶和/或化学方法，进行乳酪蛋白裂解，获得本发明肽。
在下面的进一步详细描述和实施例部分中，本发明肽具有多种治疗效果。在实施例部分中提供了多种试验方法，通过这些方法，按照本发明的教义内容，本领域普通技术人员可以测定某种特别设计的肽是否具有特定疗效。
本文描述的任意一种肽都可以单独应用，也可以制备成药物组合物，用来治疗或预防疾病。这种组合物包括，例如本文描述肽的任意一种活性成分，以及药用载体。
本文所用的“药物组合物”是指这样一种制剂，包括一种或多种本文描述的肽，以及其他化学组分，如适宜药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是能够更加容易地将化合物用于机体。
在下文中，术语“药用载体”是指载体或稀释剂，所述载体或稀释剂不会导致机体的显著激惹，也不会影响所用化合物的生物活性和性质。载体的实例如，但不限于丙二醇，盐水，乳剂以及有机溶剂和水的混合物。本文所用术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中的惰性物质，可以使化合物的应用更加容易。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，多种糖类和淀粉，纤维素衍生物，白明胶，植物油和聚乙烯二醇。
药物的制备和给药技术可以在下述文献中获得，“Remington’sPharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，latest edition。
适宜的给药途经可以包括，例如口服，直肠给药，经粘膜给药，经皮给药，小肠给药或肠道外给药，包括肌内注射、皮下注射和髓内注射以及鞘内注射、直接心室内注射、静脉注射、腹膜内注射、鼻腔内注射或眼内注射。
本发明药物组合物可以通过本领域众所周知的方法进行生产，例如，通过传统的混合、溶解、制粒、包糖衣、研磨、乳化、制备胶囊、entrapping或冻干方法。
因此，根据本发明的应用，药物组合物可以通过传统方式进行制备，应用一种或多种药用载体，包括赋形剂和佐剂，可以使活性肽更加容易地整合到药用制剂中。适宜的制剂有赖于所选的给药途经。
对于注射制剂，本发明肽可以以水溶液的形式制备，优选溶于生理兼容缓冲液，如Hank’s液，Ringer’s液或含有或不含有机溶剂的生理盐水缓冲液，所述有机溶剂如丙二醇，聚乙烯二醇。对于经粘膜给药制剂，制剂中应使用渗透剂。这些渗透剂在本领域众所周知。
对于口服给药制剂，可以通过将活性肽与本领域众所周知的药物载体结合而方便地制备。这些载体可以将本发明肽制备成片剂、丸剂、糖丸、胶囊、液体、胶体、糖浆、浆、悬液等，用于患者口服。口服应用的药物制剂可以应用固体赋形剂来制备，如果需要，在加入适宜的佐剂后，任选研磨获得的混合物，并将混合物制粒，获得片剂或糖衣剂的核心。具体地说，适宜的赋形剂是，填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、白明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧丙甲基纤维素、碳甲基纤维素钠；和/或生理可接受多聚体如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，还可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或褐藻酸或其盐类，如褐藻酸钠。
应用适宜的包衣处理糖丸的核心。为了这一目的，可以应用浓缩的糖溶液，所述糖溶液可以任选含有阿拉伯树胶，云母，聚乙烯吡咯烷酮，聚羧乙烯凝胶，聚乙烯二醇，二氧化钛，漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖丸包衣中添加染料或色素，来鉴别不同的活性成分剂量组合物，或赋予不同的活性成分剂量组合物以不同的特征。
可以口服的药物组合物包括应用白明胶制备的pushfit胶囊，以及应用白明胶和可塑剂制备的密封软胶囊，后者如甘油或山梨醇。Pushfit胶囊可以含有活性成分，以及填充剂如乳糖，结合剂如淀粉，润滑剂如云母或硬脂酸镁，并可选稳定剂。对于软胶囊而言，活性肽可以溶解或悬浮于适宜的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙烯二醇。此外，还可添加稳定剂。所有口服配方的剂量都应适宜所选给药途经。
对于口腔给药，组合物的形式可以是以传统方式制备的片剂或锭剂。
对于吸入给药，本发明肽可以以气雾剂的形式方便地给药，所述气雾剂的包装可以是加压罐，也可以是喷雾器，应用适宜的推进器，如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷或二氧化碳。对于加压气雾剂而言，剂量单位可以通过应用阀门控制配量而确定。用于吸入器和吹药器中的，例如白明胶胶囊和弹丸，可以制备含有化合物和适宜粉基如乳糖或淀粉的粉剂混合物。
本文所述的肽还可以制备用于非肠道给药，如通过弹丸注射或持续滴注给药。用于注射的制剂可以以单位剂量的形式存在，如以安瓿或多剂量容器的形式存在，可以任选添加防腐剂。组合物可以是溶于油性或水性载体的悬液、溶液或乳液，可以含有配方试剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
非肠道给药的药物组合物包括以水溶性形式存在的活性制剂的水溶液。此外，活性肽的悬液可以制备成适宜的油性注射悬液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯，甘油三酯或脂质体。水性注射悬液可以包括某些物质，这些物质能够增加悬液的粘性，如羧甲基纤维素钠，山梨醇或右旋糖苷。任选地，悬液可以含有适宜的稳定剂或可以增加肽溶解性的试剂，可以制备高度浓缩的溶液。
此外，在应用前，活性成分还可以是粉剂，然后与适宜的载体，如无病原体的消毒水进行组合。
本发明肽还可以制备成直肠应用的组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，应用，例如传统的栓剂基质如可可油或其他甘油酯。
本文所述的药物组合物还可以包括适宜的固体凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、白明胶和多聚体，如聚乙烯二醇。
本领域普通技术人员可以容易地确定本发明任意肽的最佳剂量以及定量方法。
根据本发明教义应用的任意肽，其治疗有效量，也称为治疗有效剂量，开始可以通过细胞培养或体内动物试验的方法估计。例如，可以在动物模型中获得某一剂量的循环浓度范围，包括IC50或IC100，与细胞培养测定一样。这些信息可以用来更准确地确定人类的应用剂量。起始剂量也可以通过体内数据来估计。根据这些原始指南，本领域普通技术人员能够确定人类的有效剂量。
而且，本文所述肽的毒性和疗效可以在细胞培养或实验动物中通过标准药理学方法来确定，如通过测定LD50和ED50。毒性和疗效的剂量比率是治疗指数，可以通过的LD50和ED50比率来表示。优选治疗指数高的肽。应用来自细胞培养试验和动物研究的数据，可以构成人类应用无毒性的剂量范围。这些肽的剂量优选位于包括ED50的循环浓度范围，同时毒性很小或没有毒性。剂量可以根据采用的剂型和给药途经在该范围内变化。具体的制剂、给药途经和剂量可以由医生根据患者的病情进一步选择(见如Fingl et al.，1975，InThe Pharmacological Basis ofTherapeutics，chapter 1，page 1)。
应该根据个体情况调整给药剂量和间隔，使活性成分的血浆水平足以维持治疗效果。一般患者口服给药剂量范围大约为50-2000mg/kg/次，通常大约为100-1000mg/kg/次，优选大约为150-700mg/kg/次，最优选大约为250-500mg/kg/次。在某些情况下，治疗有效血清水平可以通过每天多剂给药达到。在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员在没有进行不适当实验的情况下，可以优化局部治疗有效剂量。
根据所需治疗疾病的严重程度和治疗反应情况，给药可以是单剂给予缓释组合物，使治疗疗程持续数日至数周，或者直至达到疾病治愈或疾病减轻。
当然，给予的组合物的量应该根据治疗患者的情况、疾病的严重程度、给药方式以及处方医生的判断等进行制定。如果需要，本发明组合物可以以包装或计量装置的形式存在，如FDA批准的试剂盒，该试剂盒可以包括含有活性成分的一个或多个单位剂量形式。包装可以包括，例如金属或塑料衬托，如硬质泡沫塑料衬垫包装。包装或计量装置内可以同时放置给药说明书。包装或计量装置内还可以同时放置与容器内(物质)相关的通知，该通知由管理药物生产、应用或销售的政府机构给出，反映政府机构业已批准该组合物形式或用于人类或牲畜。例如，这些通知可以是美国食品与药物监督管理局批准的处方药标志或批准产品说明书。含有本发明肽，并与药用载体共同制备的组合物还可以生产置于适宜的容器中，并注明用于治疗或预防某种适应证或诱导某种所需事件。标签上的适宜适应证应包括治疗和/或预防自身免疫性疾病、病毒性疾病、病毒感染、血小板减少症、全血细胞减少症、粒细胞减少症、高脂血症、高胆固醇血症、葡尿和糖尿病，或诱导造血、造血干细胞增殖、造血干细胞增殖和分化、巨核细胞生成、红细胞生成、白细胞生成和/或血小板生成。
本发明的药物组合物可以用于维持和/或恢复血液系统构建，平衡血细胞计数，平衡血液中各种代谢产物的水平，包括糖、胆固醇、钙、尿酸、尿素和酶，如碱性磷酸酶。而且，本发明药物组合物还可以用于诱导血细胞增殖，调节白细胞和/或红细胞计数，特别是增加白细胞和/或红细胞计数，增加血液血红蛋白水平，以及调节血小板计数。
本文所用与某些生理参数相关的术语“平衡”是指使所指的参数水平发生变化，使其更接近正常值。
本文所用与某些生理参数相关的术语“正常值”是指介于健康人或动物数值范围内的数值。
在特别优选实施方案中，本发明肽可以平衡红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白水平。本发明药物组合物可以用于激活血细胞增殖。
此外，药物组合物可以用于治疗和/或预防造血干细胞性疾病，包括血小板、淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞性疾病，前白血病的(造血细胞)缺乏和功能异常，白血病和血小板减少症。
而且，药物组合物可以用来治疗和/或预防细胞增殖性疾病。在这方面，值得注意的是，本发明药物组合物在化疗或放疗期间，在刺激免疫应答、减轻不良反应、减轻化疗和放疗导致的呕吐和促进快速恢复方面具有特别优势。
而且，在治疗免疫缺陷相关性疾病的过程中，例如HIV和自身免疫性疾病，本发明药物组合物可以用来刺激人类免疫应答。
本发明组合物还可以用于兽医领域。
本发明药物组合物可以用来治疗和/或预防，例如，涉及血细胞水平异常的疾病，涉及造血干细胞产生和分化异常的疾病，治疗血小板、淋巴细胞和/或中性粒细胞性疾病，治疗前白血病和白血病，治疗血小板减少症。本发明药物组合物还可以用来治疗增殖性疾病和涉及免疫缺陷的疾病，如HIV，以及自身免疫性疾病。而且，本发明药物组合物可以用来在化疗或放疗期间刺激免疫应答，例如，减轻化疗相关性呕吐。
本发明还涉及抗菌药物组合物，该组合物包括至少一种本发明肽的活性成分，本发明还涉及应用本发明肽作为抗菌制剂。
因此，根据本发明，提供了一种预防或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗病毒性疾病的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防病毒感染的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导造血的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖和分化的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导巨核细胞生成的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导红细胞生成的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导白细胞生成的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种诱导血小板生成的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗血小板减少症的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗全血细胞减少症的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗粒细胞减少症的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高脂血症的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高胆固醇血症的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗葡尿的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗糖尿病的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗艾滋病的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗HIV感染的方法，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的方法，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持，该方法通过给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽而发挥疗效。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防病毒感染的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导造血的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导造血干细胞增殖和分化的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导巨核细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导红细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导白细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种诱导血小板生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗血小板减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗全血细胞减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗粒细胞减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高脂血症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗高胆固醇血症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗葡尿的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗糖尿病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗艾滋病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗HIV感染的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还提供了一种预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的药物组合物，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗自身免疫性疾病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗病毒性疾病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防病毒感染的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血干细胞增殖的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血干细胞增殖和分化的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导巨核细胞生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导红细胞生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导白细胞生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导血小板生成的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗血小板减少症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗全血细胞减少症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗粒细胞减少症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗高脂血症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗高胆固醇血症的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗葡尿的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗糖尿病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗艾滋病的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗HIV感染的用途。
根据本发明，还披露了αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的用途，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持。
根据本发明，还提供了一种纯化的肽，该肽具有选自序列1-19的氨基酸序列。
根据本发明，还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种纯化的肽和药用载体，所述纯化肽具有选自序列1-19的氨基酸序列。
本发明通过提供肽治疗人类疾病，成功超越了目前已知处置的不足，所述肽衍生于αS1酪蛋白N末端部分，没有能检测到的毒性，具有高度治疗效果。
在检视下述实施例后，本领域普通技术人员可以清晰地明了本发明的其他目标、优势和新特征，但所述实施例并非为了限制本发明。此外，上面所述本发明多个实施方案和方面以及后面权利要求部分的权利要求，都可以在下面的实施例中找到实验支持。
实施例参考下述实施例，与上面的描述文字一起，以非限制性举例方式阐释了本发明。
材料和实验方法天然酪蛋白衍生肽的制备如Hipp et al.(1952)，ibid.，所述，从牛乳中分离酪蛋白部分，并在30℃应用凝乳酶(也称为凝乳酶)(20ng/ml)进行彻底蛋白水解消化。反应完成后，加热溶液，使酶失活，然后应用有机酸、乙酸或三氯乙酸酸化，使消化液沉淀形成副酪蛋白盐。通过离心分离副酪蛋白盐，将含有感兴趣肽片段的上清部分进行透析，然后用更高浓度的酸沉淀caseicidin。将获得的caseicidin在再悬浮、透析和中和后冻干。如下所述，对获得的粉末制剂进行生物活性试验，并通过HPLC分离，进行肽分析。
对天然酪蛋白衍生肽进行HPLC分析应用HPLC分两阶段分离如上所述获得的天然酪蛋白衍生肽。开始，应用C18分离冻干的酪蛋白消化产物，反相应用0.1％水三氟乙酸(w/w)-乙腈梯度。根据214nm处的UV吸收值进行检测。然后，通过装备有电子发射源的HPLC-质谱(MS)法对样本进行分析。质量计算代表随着保留时间得出的离子化肽样本质量。分离后，应用气相微量测序仪(Applied Biosystems 470A)测定肽的氨基酸组成。
下面是代表性数据观察到8个典型肽峰，其中3个主峰的Rt值分别为17.79，19.7，23.02，另5个次要峰的Rt值为12.68，14.96，16.50，21.9和25.1，这些Rt值代表的分子量分别为2764，1697，1880，2616，3217，2333，1677和1669 Da。Rt值为17.79(对应于2764 Da)的23个氨基酸的肽主峰代表αS1酪蛋白的1-23个氨基酸，序列为RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF(序列16，见McSweeny et al.，1993，ibid，for the complete sequence of αS1 casein)。其他肽源于β酪蛋白的208-224位点，αS1酪蛋白的16-37位点和αS2样酪蛋白前体的197-222位点。其他肽也是存在的。
酪蛋白衍生肽的合成通过NoVetide Ltd.，Haifa，Israel，合成对应于αS1酪蛋白N末端8-26个氨基酸的长度渐增的肽，纯度＞95％(HPLC)。质量控制包括HPLC，质谱分析(EI)，氨基酸分析和肽含量。下表3提供了这些肽的序列。
表3名称 序列(N→C) 氨基酸数目 序列号X RPKHPIKH 8 1Y RPKHPIKHQ 9 21ARPKHPIKHQG1032ARPKHPIKHQGL 1143ARPKHPIKHQGLP 125A RPKHPIKHQGLPQ 136B RPKHPIKHQGLPQE147C RPKHPIKHQGLPQEV 158D RPKHPIKHQGLPQEVL 169E RPKHPIKHQGLPQEVLN 1710F RPKHPIKHQGLPQEVLNE1811G RPKHPIKHQGLPQEVLNEN 1912H RPKHPIKHQGLPQEVLNENL 2013I RPKHPIKHQGLPQEVLNENLL 2114J RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLR2215K RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF 2316L RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFF 2417M RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFV 2518N RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVA2619非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的少年型(I型，IDDM)糖尿病NOD小鼠是研究自身免疫性疾病和人类少年型糖尿病的常用动物模型。6周龄雌性NOD小鼠每周注射100μg天然酪蛋白衍生肽一次或两次，共治疗5次或11次。对照小鼠不接受治疗。根据葡尿情况确定疾病的严重程度，葡尿应用Combi试纸进行检测[Gross，D.J.et al.(1994)，Diabetology，371195]。结果用230天期间每个样本组无葡尿小鼠的百分比来表示。
刺激自然杀伤(NK)细胞增殖源于人外周血于细胞(PBSC)应用FICOLL梯度离心分离G-CSF处理个体的PBSC，然后用RPMI-1640培养基清洗细胞两次，接种于含有或不含指定天然酪蛋白衍生肽或合成酪蛋白衍生肽(0-500μg/ml)的1.5ml孔中。孵育2天后，通过检测35S标记的K562靶细胞(NEG-709A，185.00MBq，2.00 mCi EASYTAGth Methionine，L-[35S]43.48 TBq/mmol，1175.0 Ci/mmol，0.488ml，Boston USA)释放的放射活性，测定细胞的自然杀伤活性。在U型底96孔组织培养板中，每孔5×103靶细胞，与两种浓度的效应细胞(每孔2.5×104和5个×104细胞)共同孵育(效应细胞∶靶细胞比率为50∶1和100∶1)。在37℃，5％CO2，95％空气的条件下孵育细胞5小时，然后1000rpm离心细胞5分钟。在50μl样本上清液中测定35S的释放量。
源于小鼠骨髓(BM)细胞从未经处理的BALB/c和C57B1/6小鼠中收集骨髓。通过应用25号Gauge针头，向小鼠前后肢长骨注射培养基收获骨髓。应用RPMI 1640清洗吸出的细胞，然后用血球计计数，进行必需染色(20μl细胞溶于380μl乙酸-台盼兰)，然后以每毫升RPMI 16402-5×106个细胞的浓度将细胞接种于培养瓶中，所述RPMI 1640含有10％胎牛血清、抗生素和谷氨酰胺，含有或不含100μg/ml天然酪蛋白衍生肽。在37℃，5％ CO2，95％空气的条件下孵育培养细胞12-15天，然后以1500rpm离心10分钟收集细胞，计数，并接种于含有51Cr(铬-51，740MBq，2.00mCi活性)或35S(NEG-709A，185.00MBq，2.00mCiEASYTAGth Methionine，L-[35S]43.48 TBq/mmol，1175.0 Ci/mmol，0.488ml，Boston USA))标记的鼠淋巴细胞(YAC)的U型底培养孔中，接种的效应细胞∶靶细胞比率为25∶1或50∶1。NK活性以无细胞上清中放射活性百分比来表示。
培养中人细胞的增殖从健康或罹病患者中收集外周血(PB)。在去除血浆前，罹病患者除了应用G-CSF外，没有进行任何治疗。从知情同意的健康患者或化疗后缓解的罹病患者中获得骨髓(BM)细胞，方法是向髓腔注射培养基，然后回吸。在正常分娩过程中收集脐带血。用FICOLL梯度离心分离各种来源的人类细胞，然后用RPMI-1640培养基清洗2次，并以指定浓度接种于0.2ml平底组织培养孔中，所述培养孔中指定含有或不含天然酪蛋白衍生肽，或者含有或不含合成酪蛋白衍生肽。包括对照组在内，所有处理都重复3次。细胞增殖通过孵育指定时间后添加放射活性胸苷[胸苷(甲基-[3H]特异性活性6.7 Ci/ml 37 MBq/ml，ICN Corp.)]来检测。然后细胞与标记物共同孵育16-20小时后收获，应用培养基清洗2次。应用β闪烁计数器测定整合的放射活性。
K562白血病和结肠癌细胞系的增殖结肠和K562是业已建立的能够培养生长的肿瘤细胞系。两种细胞系在培养瓶中，以37℃，5％ CO2，95％空气的条件培养生长，在以每孔4×105个细胞(K562)或3×103个细胞(结肠)接种到组织培养孔前，应用培养基清洗2次。将天然酪蛋白衍生肽以指定浓度加入孔中，孵育9天(K562)或3天(结肠)后，加入如上所述的标记胸苷。如上所述收获细胞，测定放射活性摄取量。
在人外周血干细胞(PBSC)中应用荧光抗体测定NK和T细胞增殖通过去除血浆法从G-CSF处理的人类实验对象中收集外周血干细胞(PBSC)，应用FICOLL梯度离心分离细胞，应用含有10％胎牛血清的RPMI-1640清洗细胞2次，然后在培养瓶中以37℃，5％ CO2，95％空气的条件孵育细胞，所述培养瓶中含有或不含指定浓度的天然酪蛋白衍生肽。与天然酪蛋白衍生肽共同孵育10，14或28天后，应用抗CD3荧光抗体(CD3/FITC克隆UHCT1)、抗CD56荧光抗体(CD56/RPE克隆MOC-1)(DAKO A/S，Denmark)和作为对照的鼠IgG1/RPE和IgG1/FITC抗体，通过直接免疫荧光法检测出现的T细胞(CD3表面抗原)和NK细胞(CD56表面抗原)。应用荧光激活细胞分类法(FACS)和荧光显微镜进行荧光标记细胞的检测。
在培养的骨髓(BM)细胞中刺激造血鼠骨髓细胞多能集落(CFU-GEMM)中巨核细胞的增殖在无血清甲基纤维素IMDM培养基中，以37℃，5％ CO2，95％空气的条件培养源于8-12周龄C3H/HeJ小鼠的原代骨髓细胞(1×105/ml)，孵育8-9天。所述培养基非常适宜多能集落(CFU-GEMM)的生长，含有1％BSA(Sigma)，10-4M巯基甘油(Sigma)，2.8×10-4M人转铁蛋白(TF，Biological industries，Israel)，作为IL-3来源的10％WEHI-CM，以及2单位/ml的促红细胞生成素(rhEPO，R&D Systems，Minneapolis)。8-9天后，应用Olympus暗视野显微镜进行集落评分。应用微量移液器取出集落，进行细胞离心，然后应用May-Grunwald-Giemsa染色，进行分类计数。每次至少计数700个细胞。
人骨髓和脐带血中巨核细胞形成细胞和红细胞形成细胞的增殖应用健康人骨髓样本进行Histopaque-107(Sigma Diagnostics)密度梯度分离，获得纯化的单个核细胞(MNC)。在平板培养基中进行集落形成实验，所述平板培养基含有终浓度为0.92％的甲基纤维素(4000 centripase粉剂，Sigma Diagnostics)，再水合溶于Iscoves改良Dulbecco’s培养基，该培养基含有36mM重碳酸钠(Gibco)，30％胎牛血清(FBS)(Hyclone)，0.292mg/ml谷氨酰胺，100单位/ml青霉素核0.01mg/ml链霉素(Biological Industries，Beit Haemek)。收集正常分娩的脐带血，如上所述进行处理。
在24孔组织培养板(Greiner)中接种含有105MNC/ml的集落形成实验培养基，每孔0.33ml，重复3孔。在37℃，5％ CO2，95％空气和55％相对湿度的条件下进行孵育培养，每孔含有或不含指定浓度的天然酪蛋白衍生肽或合成酪蛋白衍生肽。14天后，平板进行集落评分，所述集落含有50个以上的细胞。应用高度特异性识别人类血小板糖蛋白的兔抗体和FITC结合的山羊抗兔IgG，通过间接免疫荧光法，鉴定巨核细胞。添加的生长因子包括15ng/ml leucomax(GM-CSF)(Sandoz Pharma)和5％v/v人植物血凝素-m(Difco Lab)诱导的条件培养基(CM)，诱导粒细胞、单核细胞集落(CFU-GM)发生。应用2单位/ml的促红细胞生成素(EPO)诱导红细胞集落形成。
此外，来自知情同意的志愿捐献者或进行自体骨髓移植患者的人骨髓细胞在含有10-1000μg/ml天然酪蛋白衍生肽的培养基中进行预培养，生长于半固体琼脂中，处理7或14天后，进行粒细胞-巨噬细胞造血集落(GM-CFU)评分。
知情同意的健康捐献者，其正常骨髓细胞的巨核细胞生成情况可以通过下述两种方法进行测定，一种是在含有或不含100μg/ml天然酪蛋白的液体培养基(RPMI-1640加10％人AB血清，谷氨酰胺和抗生素)中评价样本的巨核细胞数量，另一种是应用甲基纤维素实验评价集落形成情况。将2×105骨髓细胞接种于含有或不含天然酪蛋白衍生肽的标准生长因子组合(培养基)中。在甲基纤维素实验中，巨核细胞在接种后12-14天，应用反向显微镜进行计数。
应用天然酪蛋白衍生肽的临床试验在一系列试验中，在2小时期间将含有50mg天然酪蛋白衍生肽的单剂药物肌内注射用于受试者，共分3次注射。在指定间隔时间监测临床参数。在其他试验中，接受肿瘤和转移性疾病治疗和/或肿瘤和转移性疾病已经缓解的不同阶段患者应用天然酪蛋白衍生肽治疗一次或两次，监测外周血细胞计数的变化。
体外抑制HIV感染人淋巴细胞肽以冻干粉末形式提供的肽(可以是天然酪蛋白衍生肽，也可以是合成肽(长度为8-26个氨基酸，见表3，衍生于酪蛋白))在RPMI完全培养基中再悬，以终浓度为50-1000μg/ml加入细胞培养基中。
细胞几种新鲜分离的人类细胞(原代细胞)和细胞系已知对HIV-1的体外感染易感，尽管几乎任何CD4分子表面水平很低的细胞都可认为是HIV-1感染的潜在靶细胞。选择对HIV-1感染高度敏感的两种常用人类细胞系，CEM和Sup-T1。
CEM是人类T4淋巴母细胞样细胞系，最初衍生于G.E.Foley et al.[(1965)，Cancer 18522]描述的患有急性淋巴母细胞白血病的4岁白人女孩的外周血淡黄色衣。这些细胞在培养基中可以持续悬浮维持，并广泛用于感染、抗病毒制剂和中和抗体分析。
Sup-T1是人类T淋巴母细胞样细胞系，分离自一名患有非何杰金T细胞淋巴瘤的8岁男孩的胸水[Smith，S.D.et al.(1984)Cancer Research 445657]。该细胞表达高水平的表面CD4，在研究细胞融合、细胞病理效应和HIV-1感染中非常有用。Sup-T1细胞悬浮生长于富集培养基中。
培养基细胞生长于RPMI-1640完全培养基中，所述培养基还富集了10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺和2mM青链霉素(GIBCO)。
病毒应用的HIV病毒株是HIV-1IIIB，开始被命名为HTLV-IIIB。源于几名罹患艾滋病或相关疾病患者的外周血浓缩培养液被用来在H-9细胞中建立持久的生产性感染。该B亚型病毒在人类T细胞系中具有高度复制能力。储存溶液的病毒滴度为5.38ng/ml。
FITC标记肽应用FITC F-1300(荧光素异硫腈酸盐，异构体1，Sigma(F25o-2)St.Louis，MI，USA)，其最大激发/发射分别在大约494/520nm。胺反应性荧光素衍生物可能是最常见的用于共价标记蛋白质的荧光衍生试剂。通过将FITC与赖氨酸的氨基共价结合，制备FITC结合的天然酪蛋白衍生肽。
HIV-1 P24抗原俘获试验采用的HIV-1 P24抗原俘获试验试剂盒被设计用来定量HIV-1 P24核心抗原，该抗原与细胞内病毒生产的程度成正相关。该试剂盒购自SAIC-NCI-Frederick肿瘤研究所，P.O.Box B，Frederick，M.D 21702，USA的艾滋病疫苗程序，包括包被了抗HIV-1 P24单克隆抗体的96孔板，兔抗HIV P24血清一抗，羊抗兔IgG(H+L)过氧化物酶结合二抗，TMB过氧化物酶底物系统和裂解的HIV-1 P24标准物。应用Organon-Technica ELISA读数器在450nm处分析HIV-1 P24抗原俘获试验，参考波长为650nm。
HIV-1 P24抗原俘获ELISA在组织培养基中应用探测HIV-1 P24核心抗原的间接酶免疫试验测定HIV感染。组织培养上清与兔抗HIV-1P24抗原一抗反应，然后应用过氧化物酶结合的羊抗兔IgG使反应液显色。通过加入4N H2SO4终止反应，其中，产生的颜色深浅程度与组织培养上清中存在的HIV-1抗原量成正比。
实验室生物危险水平(BL-3)所有的病毒生产、分离和感染，HIV-1感染细胞的组织培养，含有P24抗原上清的收获，P24抗原俘获ELISA，都是在Hebrew大学Hadassah医学院的BL-3实验室进行的，并且符合NIH和CDC(USA)设定的生物安全实践标准。
流式细胞计数应用FACSort细胞分类仪(Becton & Dickinson，SanJose，CA.USA)(i)在HIV-1感染前，测定CD4阳性CEM和sup-T1细胞的百分比，以确认每个实验中感染程度是相同的；以及(ii)探测在细胞质和细胞核中存在与FITC结合的天然酪蛋白衍生肽的T细胞。
CO2孵育箱实验期间，HIV-1病毒培养产生的细胞，应用天然酪蛋白衍生肽进行预处理的细胞和病毒，以及与HIV-1进行进一步孵育的细胞，都在湿润的CO2孵育箱中保存。
HIV感染培养的人CD4+细胞细胞(CEM，Sup-T1)与几种渐增浓度的天然酪蛋白衍生肽(50-1000μg/ml)或合成酪蛋白衍生肽(10-500μg/ml)预孵育3，24(合成和天然肽)和48(只有天然肽)小时，然后每孔加入HIV-1IIIB(终浓度为45 pg/ml)。HIV-1IIIB业已与肽预孵育3小时，然后加入组织培养板的细胞中(5000细胞/孔)。对照组是IF(感染组，细胞与HIV-1共同培养，但没有肽)，UIF(未感染组，细胞不与HIV-1和肽共同培养)和UIF+Ch(未感染+天然酪蛋白衍生肽组，细胞在天然酪蛋白衍生肽存在的情况下{50-1000μg/ml}培养)，来检测天然酪蛋白衍生肽和合成酪蛋白衍生肽对细胞活性和生长的作用。在感染后7，10和14天(收获P24抗原培养上清的日子)计数细胞活性和增殖率。收获细胞和组织培养上清(培养基)，并立即在1/10体积的10％TritonX-100中裂解。这些样本在37℃再孵育1小时，然后-80℃保存，直至进行p24抗原检测。
共焦显微镜应用连接于TW Zeiss Axiovert 135M反向显微镜的Zeiss LSM 410共焦激光扫描系统探测与FITC结合的肽向细胞内的穿透，所述扫描系统采用激光扫描共焦显微镜技术。在37℃，5％CO2，95％空气的孵育箱中，将与FITC结合的天然酪蛋白衍生肽与T细胞共同孵育，孵育后，应用磷酸缓冲盐水(PBS)清洗细胞3次，去除未结合的FITC肽。应用3.8％福尔马林固定细胞10分钟，用PBS清洗2次，在进行显微镜检视前将细胞再悬于50-100μl PBS中。从不同孵育时间点(15分钟，30分钟，1小时，1.5小时和3小时)选择的细胞图象显示了在其细胞质和细胞核中存在不同数量的FITC结合天然酪蛋白衍生肽，这些图象保存在3.5”Zip驱动器中(230MB)，并应用Photoshop软件进行图象处理。胸苷整合实验为了检测天然酪蛋白衍生肽对T细胞增殖的作用，在96孔平底培养板中加入不同浓度的天然酪蛋白衍生肽(1μg/ml，储存于RPMI中)，所述培养板中含有培养的Sup-T1细胞(5000细胞/孔)，如HIV-1感染Sup-T1细胞部分所述。细胞进行计数，并通过台盼兰排出法检测细胞活性。在每一时间点(3，7，10和14天)应用[3H]胸苷脉冲处理细胞18小时(过夜)，并用玻璃纤维滤器收获，进行放射活性检测(细胞DNA中整合的[3H]胸苷量与细胞增殖程度成正比)。
在正常、清髓处理和移植受体小鼠和豚鼠中天然酪蛋白衍生肽的毒性高达5000mg/kg动物体重的天然酪蛋白衍生肽以单剂或分3剂的形式肌内或静脉注射给正常。实验应用多品系小鼠，包括BALB/c，C3H/HeJ和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。小鼠在处死前观察10个月、处死后进行尸检(毒性检测)，或者观察200天(生存率)。豚鼠每只接受单剂肌内注射20mg天然酪蛋白衍生肽。15天后处死豚鼠，进行病理检查。
在骨髓移植受体小鼠中白细胞和血小板的重建BALB/c小鼠接受致死性放射照射，放射源距离皮肤70cm，放射剂量为50cGy/分钟，总照射剂量600cGy。如上所述，放射照射小鼠进行同基因骨髓重建，并遵循双盲协议，在24小时后每只小鼠静脉注射1mg天然酪蛋白衍生肽，合成酪蛋白衍生肽(13-26个氨基酸，见上表3)，或人血清白蛋白(对照组)。根据处理后6-12天指定时间间隔收集的外周血细胞计数测定白细胞的重建情况。根据处理后6-15天指定时间间隔收集的眼窝后丛血的细胞计数测定血小板的重建情况，其中眼窝后丛血被吸入到肝素化毛细管中。
在另外的一系列实验中，CBA小鼠接受致死性放射照射(900 cGy)，然后如上所述应用天然酪蛋白衍生肽或人血清白蛋白进行重建和处理。如上所述，进行血小板重建情况检测。
骨髓移植受体小鼠的重建C57/Black/6小鼠接受致死性放射照射，放射源距离皮肤70cm，放射剂量为50cGy/分钟，总照射剂量600cGy。在遵循双盲协议的条件下，放射照射小鼠进行同基因骨髓重建，所述骨髓来源小鼠在骨髓抽取前1天应用1mg/鼠的天然酪蛋白衍生肽处理或未经处理。在一个实验中，监测小鼠存活18天。在另一个实验中，小鼠在10天后处死，监测脾定殖情况。
实验结果天然酪蛋白衍生肽从凝乳有时不支持细菌生长这一观察结果开始，从乳蛋白中分离出一种具有细菌杀伤性质的酪蛋白片段(Katairkatchalsky，et al.美国专利号3,764,670)。从天然酪蛋白蛋白裂解产物中得到的粗制肽可以通过下述方法制备，包括酸沉淀酪蛋白蛋白裂解消化产物的可溶性部分，透析并冻干。在长期储存后检测该粗制制剂的生物活性时，应该指出，在冻干并储存于4℃的条件下，该粗制制剂保持活性(体外和体内)至少12个月。
如上所述，为了鉴定天然酪蛋白衍生肽中包含的活性肽，应用高效液相层析(HPLC)对冻干粗制制剂进行分馏。分析的所有冻干样本显示了相似的保留时间特征，与上述内容一致。
因此，天然酪蛋白制剂衍生的粗制肽的一种主要组分为αS1酪蛋白N末端片段。
天然酪蛋白衍生肽在啮齿类动物和人类中无毒在小鼠、豚鼠和人类志愿者中进行的大剂量天然酪蛋白衍生肽的短期和长期效果研究证实，该制剂没有毒性、致畸性和不良反应。在一系列实验中，将单剂剂量为预计有效剂量1750和12500倍的天然酪蛋白衍生肽肌内注射给致死剂量照射并接受同基因骨髓移植的小鼠。处理后8个月进行小鼠的标准病理尸检，结果没有发现对内脏器官的毒性作用和任何异常。在豚鼠中进行的类似毒性实验——单剂肌内注射20mg天然酪蛋白衍生肽后2周，也没有发现异常。在另一系列实验中，给健康小鼠应用大剂量天然酪蛋白衍生肽，2周后检测血液学参数，结果发现对这些参数没有影响，这些参数包括白细胞(WBC)，红细胞(RBC)，血红蛋白(HGB)，电解质，血糖等。第三系列实验测试了在小鼠和大鼠中重复应用100mg/kg体重的大剂量(制剂)2周，结果在尸检中，没有发现变态反应、迟发性皮肤或变态反应，也没有病理改变。在测试天然酪蛋白衍生肽对放射照射、骨髓重建的BALB/c和C3H/HeJ小鼠长期存活的影响作用时发现，治疗组小鼠的存活率(27只BALB/c和C3H/HeJ小鼠中18只存活，66％)明显超过白蛋白处理的对照组的存活率(26只BALB/c和C3H/HeJ小鼠中4只存活，15％)。在应用天然酪蛋白衍生肽处理的小鼠中进行的致畸性实验[详细内容参见，例如Drug Safety in Pregnancy，Folb andDakes，p.336，Elsevier；Amsterdam，NewYork，Oxford(1990)]发现，该肽对任何生长参数都没有影响。
与在啮齿类动物中测试发现其没有毒性或不良反应一样，天然酪蛋白衍生肽在用于人类时，也是安全的。比较7名健康志愿者在肌内注射天然酪蛋白衍生肽之前、期间、之后7天的血样和尿样发现，没有任何临床指标发生变化。也没有观察到其他不良反应。
因此，在啮齿类动物中应用天然酪蛋白衍生肽进行大剂量长期治疗，没有发现明显的毒性、病理性、变态反应性、致畸性、血清学或其他任何不良反应。而且，对具有短期和长期并发症危险的放射照射小鼠而言，应用天然酪蛋白衍生肽在200-300天期间，具有明显的存活优势。这些结果，以及在健康人类志愿者中通过注射应用天然酪蛋白衍生肽没有出现任何不欲反应，清楚地表明，非肠道应用该肽，非常安全。
骨髓移植重建的受体小鼠C57/Black/6小鼠接受致死性放射照射，然后应用同基因骨髓进行重建，所述骨髓来源小鼠在骨髓抽取前1天应用1mg/鼠的天然酪蛋白衍生肽处理或未经处理，结果发现，接受处理组小鼠骨髓的照射小鼠存活率大大超过接受未处理小鼠骨髓的照射小鼠(照射10天后，18只接受处理组小鼠骨髓的照射小鼠中有15只存活；而照射10天后，17只接受未处理小鼠骨髓的照射小鼠中只有4只存活)。与接受未处理小鼠骨髓的照射小鼠脾脏相比，接受骨髓处理组小鼠骨髓的照射小鼠脾脏，每个脾脏包括的集落数大约是前者的2-3倍(0-3个集落比1-5个集落)。
天然酪蛋白衍生肽刺激淋巴细胞增殖天然杀伤(NK)细胞和细胞毒T细胞对于免疫系统保护机体免受感染病原体和肿瘤细胞侵袭至关重要，因为这两种细胞均具有活性细胞毒作用，而且能够分泌免疫调节淋巴因子。如在艾滋病或化疗后出现的免疫缓和，导致T或NK细胞活性异常减弱。当来自BALB/c和C57B1/6小鼠的正常骨髓细胞在有100μg/ml天然酪蛋白衍生肽存在的情况下培养时，可以始终观察到靶细胞溶解增强2倍以上(图1)。用粒细胞集落刺激因子处理献血者，应用这些献血者的外周血干细胞进行类似实验，实验中即使天然酪蛋白衍生肽的用量少到10μg/ml，也显示了更加显著的呈浓度依赖性的靶细胞溶解(图2)。
在另一系列应用健康人类献血者PBSC的实验中，天然酪蛋白衍生肽在培养10天(图3a)和14天(图3b)后，增加了NK和T细胞发生的比例，在28天时，更使该比例达到3倍以上。天然酪蛋白衍生肽对PBSC细胞的免疫刺激作用在T和NK细胞开始水平较低的献血者中更加显著(图3a-b)。因此，天然酪蛋白衍生肽可以在正常鼠和人血液祖细胞中刺激T淋巴细胞和NK细胞的增殖。
合成酪蛋白衍生肽刺激人淋巴细胞体外增殖当αS1酪蛋白前1-16个残基的合成酪蛋白衍生肽与健康和肿瘤患者的PBSC共同孵育时(见下)，观察到显著增强的NK细胞活性。当非何杰金淋巴瘤和乳腺癌患者的PBSC与少到10μg/ml的肽共同孵育培养2天后，靶细胞溶解最多(是对照组的3-＞5倍)，所述肽含有αS1酪蛋白前10个或更多残基(图4)。在相同条件下，没有一种测试肽对健康献血者PBSC培养物中的NK细胞活性具有显著影响。因此，含有αS1酪蛋白N末端序列至少前10个残基的肽，即使该肽浓度很低，仍能选择性刺激肿瘤患者细胞中淋巴细胞的体外增殖。
刺激人血液祖细胞造血血液祖细胞可以分化成多种血液细胞巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、淋巴细胞、红细胞和巨核细胞。祖细胞在骨髓中含量丰富，但在应用粒细胞集落刺激因子处理后的外周血(PBSC细胞)和新鲜的脐带血中也存在。将渐增浓度(50-600μg/ml)的天然酪蛋白衍生肽加入人骨髓、PBSC和脐带血培养物中，可以通过测定[3H]胸苷整合，观察到细胞增殖的加强(图5a-5c)。在浓度为300μg/ml，培养15天后，对人PBSC增殖作用最显著(图5a)。与天然酪蛋白衍生肽(600μg/ml)孵育14天后(而不是7天后)，可以观察到对脐带血细胞更强的作用([3H]胸苷整合增加3-4倍)(图5b)。在4名捐献者中，来自其中3名的培养骨髓细胞在孵育21天后，也对天然酪蛋白衍生肽(300μg/ml)反应强烈(整合增加3-5倍)(图5c)。因此，天然酪蛋白衍生肽可以刺激骨髓以及其他来源的人类血液祖细胞增殖。有趣的是，在类似条件下，将培养的人K562(慢性髓细胞白血病)和结肠(结肠癌)细胞系与高浓度(高达500μg/ml)天然酪蛋白衍生肽共同孵育，结果对[3H]胸苷的整合量没有影响。因此，天然酪蛋白衍生肽可以刺激人类血液祖细胞的增殖，但不刺激肿瘤细胞的生长。
酪蛋白衍生肽刺激巨核细胞生成天然酪蛋白衍生肽在培养的鼠骨髓细胞中刺激巨核细胞祖细胞增殖骨髓中，多个核的巨核细胞源于原始干细胞，然后成熟成为巨细胞，每个巨核细胞都会产生数千个血小板细胞。血小板对于血凝块的形成至关重要，而血小板减少症则是清髓性状态中(化疗或放疗后)一个令人关注的主要问题。
原代骨髓细胞培养可以经诱导形成CFU-GM(粒细胞和巨核细胞)集落和CFU-GEMM(粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞)集落，前者可以产生巨核细胞，后者则包括更多血细胞类型。集落计数反映了特异性祖细胞的扩增，细胞数量反映增殖率，分化细胞计数反映哪个具体的细胞系得到发育[Patenkin，D.et al.(1990)，Mol.Cel.Biol.10，6046-50]。在与促红细胞生成素和IL-3共同孵育的鼠培养骨髓细胞中，添加25μg/ml天然酪蛋白衍生肽8天，CFU-GEMM的数量较对照组增加2.5倍，CFU-GEMM中每集落的相对细胞数量增加3倍。在一系列类似实验中，向与促红细胞生成素和条件培养基(见材料和实验方法)共同孵育的骨髓细胞中添加天然酪蛋白衍生肽，可以刺激浓度依赖性早期和晚期巨核细胞百分比的增加(不添加肽，15％巨核细胞；添加500μg/ml天然酪蛋白衍生肽，巨核细胞百分比达50％)。因此，应用天然酪蛋白衍生肽处理8天，在鼠原代骨髓培养物中可以刺激显著增加的巨核细胞形成和发育。
合成酪蛋白衍生肽在培养的鼠骨髓细胞中刺激巨核细胞祖细胞增殖与上述实验类似，在相似的实验条件下，αS1酪蛋白前10和11个氨基酸的合成酪蛋白衍生肽在孵育8天后，对鼠骨髓细胞CFU-GEMM增殖具有很强(超过10倍)的刺激作用。而对αS1酪蛋白前12-26个氨基酸的合成酪蛋白衍生肽观察到的刺激作用则有些温和，但仍可感知。
天然酪蛋白衍生肽在培养的人骨髓细胞中刺激巨核细胞生成在类似条件下，将100μg/ml天然酪蛋白衍生肽加入健康捐献者骨髓细胞培养物中，无论是否添加其他刺激因子(GM-CSF，CM)，CFU-GM集落形成均增加。在有促红细胞生成素存在的条件下，天然酪蛋白衍生肽还可以刺激红细胞形成集落。应用促血小板生成素(TPO)处理人骨髓细胞，可以刺激巨核细胞(MK)集落形成。在TPO处理过的细胞中添加300μg/ml天然酪蛋白衍生肽，可以在MK集落增殖方面使其增加2倍以上(不添加肽，每2×105个细胞形成16个集落，添加天然酪蛋白衍生肽，每2×105个细胞形成35个集落)。
在其他造血因子存在的条件下，如促红细胞生成素、人IL-3、hSCF和AB血清，与天然酪蛋白衍生肽孵育14天，可以使人骨髓细胞中CFU-GEMM集落数增加近3倍(添加500μg/ml天然酪蛋白衍生肽，158个集落，只有造血因子，68个集落)，但对培养的脐带血CFU-GEMM集落形成的影响要小一些(1.5倍)。培养的人骨髓和脐带血集落中的相对细胞计数反映了对添加25μg/ml天然酪蛋白衍生肽的巨核细胞增殖情况(见图6所示表)。因此，将培养的人原代骨髓和脐带血细胞与天然酪蛋白衍生肽共同孵育，可以刺激定向巨核细胞和红细胞集落的发育和增殖。
天然酪蛋白衍生肽可以刺激放射和骨髓移植后的体内造血清髓性治疗可以导致威胁生命的血小板和白细胞数量降低，尽管给予血细胞和生长因子治疗，这种情况仍可持续存在。下面的内容显示了放射和骨髓移植后天然酪蛋白衍生肽的作用。
小鼠同基因骨髓移植后，天然酪蛋白衍生肽可以增强白细胞和血小板的重建致死剂量照射后(600 cGy)，最低限度骨髓重建，BALB/c小鼠(n＝60)静脉注射1mg/鼠天然酪蛋白衍生肽和骨髓细胞。在7-14天期间，与接受人血清白蛋白的对照组相比，观察到外周血白细胞计数的显著增加(图7)。无论治疗组还是对照组，照射后骨髓移植小鼠的外周血血小板计数在处理后长达8天的时间内受到同等程度的抑制。但是，到第9天，应用天然酪蛋白衍生肽处理的小鼠显示了明显优势，到第13天，较人血清白蛋白处理对照组(血小板计数)增加2倍(图8)。因此，在应用有限数量的骨髓细胞移植后，天然酪蛋白衍生肽可以增强血小板和白细胞的重建。预期在应用最佳数量而不是有限数量的骨髓细胞重建时，这种作用可能进一步增强。
小鼠同基因骨髓移植后，合成酪蛋白衍生肽可以增强白细胞的重建致死剂量照射后(600 cGy)，最低限度骨髓重建，BALB/c小鼠(每个合成肽组n＝5，对照组n＝10)腹膜内注射1mg/鼠合成酪蛋白衍生肽(长度为13-26个氨基酸，见表3)和骨髓细胞。在10-14天期间，与接受人血清白蛋白的对照组(第10天16.7×106细胞/dl；第12天46.4×106细胞/dl)相比，应用具有13个氨基酸(第10天17.2×106细胞/dl；第12天65.4×106细胞/dl)和17个氨基酸(第10天27.4×106细胞/dl；第12天52.0×106细胞/dl)的肽，观察到外周血白细胞计数的显著增加。因此，在应用有限数量的骨髓细胞移植后，合成酪蛋白衍生肽可以增强白细胞的重建。
天然酪蛋白衍生肽可以抑制HIV-1病毒对T淋巴细胞系的体外感染为了研究天然酪蛋白衍生肽的免疫刺激和抗病毒效应机制，在体外感染HIV-1病毒前，应用天然酪蛋白衍生肽处理易感Sup-T1和CEM培养人T细胞。如上所述，荧光显微镜检查发现，在与Sup-T1细胞共同孵育时，FITC结合天然酪蛋白衍生肽(100μg/ml)可以穿越Sup-T1细胞(图9a-f)。15分钟后，可以在细胞质中观察到少量标记物(图9a-b)。30分钟时(图9c-d)，细胞质中可以观察到更多的标记物，但核摄取还非常有限。1小时后(图9e-f)，在细胞质中还可观察到FITC标记的天然酪蛋白衍生肽，但绝大部分标记物集中在细胞核内。应用流式细胞仪分析Sup-T1细胞证实，孵育后5分钟开始，对标记的天然酪蛋白衍生肽的摄取增加。
天然酪蛋白衍生肽可以增强人淋巴细胞增殖在培养基中存在天然酪蛋白衍生肽，在14天的培养期间，可以导致Sup-T1细胞计数的增加。孵育7天时，观察到的细胞数量的最大增加是50μg/ml天然酪蛋白衍生肽(42％)，10天时是1000μg/ml(30％)，14天时是600μg/ml(32％)。通过测定培养细胞[3H]的胸苷整合量，提供了增殖指数，反映了细胞数量的增加，其中观察到的最显著的效应是应用100μg/ml天然酪蛋白衍生肽第10天时(图10)。14天时下降的增殖指数可能反映了细胞的过度生长和营养物质的耗竭。
合成酪蛋白衍生肽可以增强人淋巴细胞增殖在培养基中存在合成酪蛋白衍生肽(表3列出的所有肽)，在10天的培养期间，可以导致Sup-T1细胞计数的增加。这种增加作用在所有合成肽中类似。观察到的感染细胞中细胞数量增加最大的是250μg/ml肽(8氨基酸-80％)。在500μg/ml肽(8氨基酸-33％)。
天然酪蛋白衍生肽抑制HIV-1感染人淋巴细胞在与HIV-1共同孵育前3，24或48小时，应用天然酪蛋白衍生肽(50-1000μg/ml)预处理易感CEM淋巴细胞，与未经处理的对照细胞相比，处理过的CEM细胞细胞增殖加强，病毒感染水平下降。感染后15天进行细胞计数和HIV P24抗原实验，结果发现，与600-1000μg/ml天然酪蛋白衍生肽孵育3小时后，可以100％抑制病毒感染，与50和600μg/ml肽孵育24小时后，感染抑制率分别为98％和99％。未发现孵育时间延长更有效(图11)。尽管渐增浓度的天然酪蛋白衍生肽在感染后3和24小时可以增强细胞增殖，但在这些生长最快速的培养物中，病毒感染的抑制也最显著。在HIV-1感染前，应用天然酪蛋白衍生肽预处理Sup-T1细胞，观察到更引人注目的细胞增殖增强和HIV-1感染抑制(预处理3小时、24小时和48小时，病毒感染的平均抑制率分别为96.7％，88.7％和95.7％)。因此，天然酪蛋白衍生肽可以进入培养的人淋巴细胞及其细胞核内，增强细胞生长，显著降低CD4+细胞对HIV-1感染的易感性。同样，天然酪蛋白衍生肽预期可以用于预防HIV感染，以及HIV感染和艾滋病患者的感染后治疗。
天然酪蛋白衍生肽可以预防非肥胖糖尿病(NOD)小鼠发生葡尿非肥胖糖尿病(NOD)小鼠可以自发发生少年型(I型，IDDM)糖尿病，该病是一种自身免疫性疾病，可以导致胰岛β细胞发生炎症，最终导致患病、死亡。雌性NOD小鼠特别易感，显示的证据是早在5周龄时，就要巨噬细胞侵袭胰岛间质。每周1次或2次注射100μg天然酪蛋白衍生肽共5周(总计注射6或11次)，可以完全有效地预防与疾病发作和病程有关的葡尿。在200天时，100％未经处理的对照小鼠(n＝5)成为糖尿病小鼠，并随后死亡，而治疗组小鼠(n＝5)100％保持正常血糖，在230天时，全部存活(图12)。因此，天然酪蛋白衍生肽可以有效保护遗传易感小鼠免于该自身免疫性炎症性疾病的发生。
天然酪蛋白衍生肽的临床试验按照指示，每次给患者肌内注射50μg天然酪蛋白衍生肽，分1-3次注射。
天然酪蛋白衍生肽刺激肿瘤患者造血按照指示，在6名肿瘤患者接受天然酪蛋白衍生肽给药前和给药后，检测其血液学指标，这6名患者已经化疗或正在接受化疗。要特别注意血小板(PLT)、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)的变化，这些指标分别代表血小板、白细胞和红细胞的生成情况。
G.T.，(女性患者)患者罹患卵巢癌，行子宫切除术，然后化疗。在手术后两个月和两个半月时肌内注射两次天然酪蛋白衍生肽。在第一次和第二次给予天然酪蛋白衍生肽期间，没有进行化疗。第一次注射后6天，第二次注射后7和13天进行血液化验，结果发现血小板和WBC组分均有相当可观的增长，同样，RBC也有增长(图13)。
E.G，.(女性患者)患者由于小叶癌于1983年行乳房根治术，6年后罹患胃转移癌。在开始化疗前3天，她接受肌内注射天然酪蛋白衍生肽，化疗后10天接受第二次(肽注射)。尽管在化疗后10天和16天血液计数显示血液学指标抑制减轻，而血液学指标抑制在化疗后非常常见，但在第一次注射后3天，也就是化疗前就观察到了天然酪蛋白衍生肽最显著的效果(图13)。
E.S.，(女性患者)患者患有广泛转移的播散性乳腺癌，于1987年首次发现。2年后，她接受了第一次肌内注射天然酪蛋白衍生肽，23天后，接受了第二次。在此期间，没有给予其他治疗。血液化验提示，首次治疗后7天，PLT数量显著增加，第二次治疗后7天，RBC和WBC数量显著增加(图13)。
J.R.，(女性患者)患者的诊断是乳腺癌伴骨转移。她在开始化疗前8天接受了一剂天然酪蛋白衍生肽肌内注射，14天后接受了另一次。清晰可见的最显著的效果是在化疗诱导的骨髓抑制后，WBC水平的迅速回升(图13)。
D.M.，(女性患者)患者罹患肝癌，伴广泛播散性转移。在接受化疗前10，8和6天，她接受了3次肌内注射的天然酪蛋白衍生肽。第二系列注射始于化疗后10，12和14天。尽管在化疗前第一系列注射后就观察到该制剂对血液学指标的显著作用，最引人注目的改善是在第二系列天然酪蛋白衍生肽注射后，化疗后受到抑制的指标迅速回升，达到正常细胞计数(图13)。
因此，给肿瘤患者应用天然酪蛋白衍生肽，可以导致血液学指标的改善，特别是增强红细胞、白细胞和血小板的生成，并能调节并缩短化疗诱导的血液组分抑制时段。
在合并抵抗性血小板减少症的移植受体中，天然酪蛋白衍生肽可以刺激血小板生成合并严重出血的长期输血抵抗性血小板减少症可能是骨髓输注的一个威胁生命的并发症，特别是当传统治疗无效时。两名罹患严重抵抗性血小板减少症的患者应用天然酪蛋白衍生肽进行了治疗。
M-1(女性患者)32岁，患有急性髓细胞白血病，在自体干细胞输注后完全缓解。她曾经历两次威胁生命的出血事件，包括肺出血以及软腭巨大阻塞性血肿。在输注后超过114天的时间内，血小板计数对rhIL-3，rhIL-6，静脉应用γ球蛋白和重组促红细胞生成素治疗完全没有反应。应用50μg天然酪蛋白衍生肽肌内治疗一次后，她的状况立即得到改善，所述天然酪蛋白衍生肽是分3次注射的。在血小板计数迅速恢复正常的同时(图14)，她肢体末梢用力时出血和patechyae的现象也减轻了，她能够恢复行走，并且回到外国的家，没有任何并发症和不良反应。
M-2(男性患者)30岁，患有急性髓细胞白细胞，在自体干细胞输注后第二次完全缓解，但存在完全的血小板计数抵抗以及胃肠道大出血。他需要每天输注组合细胞，并且发生了低白蛋白血症，对应用rhIL-3，rhIL-6和γ球蛋白的多种治疗没有反应。在输注后86天，应用50μg天然酪蛋白衍生肽肌内治疗一次后，观察到血小板的迅速重建(图15)以及出血的逐渐停止，所述天然酪蛋白衍生肽是分3次注射的。不再需要其他进一步治疗，患者血小板计数正常，完全没有症状。
因此，以1mg/kg体重的剂量分3次肌内应用天然酪蛋白衍生肽一个疗程，在血小板计数迅速重建和消除由于长期输注所致抵抗性血小板减少症引起的伴致命性出血事件的临床症状方面有效。
天然酪蛋白衍生肽降低家族性高脂血症患者甘油三酯和LDL-胆固醇水平M.S.(女性患者)患者是有高脂血症家族史的38岁女性。应用天然酪蛋白衍生肽治疗前，血液生化指标发现总胆固醇(321mg/dl)、甘油三酯(213mg/dl；正常范围45-185mg/dl)和LDL-胆固醇(236.4mg/dl；正常范围75-174mg/dl)水平升高。应用50μg天然酪蛋白衍生肽分3次肌内给药后1个月，高脂血症稳定了；总胆固醇水平下降到270mg/dl，甘油三酯为165mg/dl，LDL-胆固醇为201mg/dl，虽然仍高于正常范围，但较治疗前水平已有显著下降。没有给予其他治疗。因此，应用天然酪蛋白衍生肽治疗相较于不治疗，可以显著降低人高脂血症。
天然酪蛋白衍生肽在一例隐性出血患者中刺激正常球蛋白血症形成D.G.(男性患者)患者是一名75岁男性，由于长期隐性出血导致贫血和低球蛋白血症(RBC，HGB，HCT，MCH和MCHC均下降)。接受50μg天然酪蛋白衍生肽分3次肌内注射后1个月，观察到贫血的显著减轻。2个月后，尽管还存在隐性出血，但RBC达到正常值(4.32而非3.44M/μl)，HGB增加(11.3而非8.9g/dl)，HCT，MCH和MCHC全部改善，接近正常值。因此，注射天然酪蛋白衍生肽一剂似乎能够刺激人红细胞生成，减轻由于失血导致的贫血。
应该指出，本发明的某些特征，为了表达清楚，是以不同实施方案的方式给出的，这些特征可以在单一实施方案中结合应用。相反，本发明的多种特征，为了表达简便，是以单一实施方案的方式给出的，这些特征也可以分开应用或以任何适宜的亚结合方式应用。
尽管本发明是以结合特定实施方案的方式进行阐述的，但很显然，本领域技术人员可以进行改变、修饰或变化。因此，本发明应该包括属于后附权利要求宗旨和范围之内的所有这些改变、修饰和变化。本说明书提及的所有公开发表物、专利、专利申请和用编号确定的序列均在此全文引入，作为参考，其程度就象每篇单独的公开发表物、专利、治疗申请或序列特意、单独指示在此引入，作为参考。此外，本申请中引用或提及任何参考文献并不意味着认为这些参考文献是本发明的现有技术。
序列表<110>Z.斯德尔曼(Sidelman，Zvi)<120>酪蛋白衍生肽及其治疗用途<130>01/21676<150>IL 134，830<151>2000-03-01<160>19<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>8<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>1Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>2Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln1 5<210>3<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>3Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly1 5 10<210>4<211>11<212> PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>4Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>5Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro1 5 10<210>6<211>13<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln1 5 10<210>7<211>14<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>7Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu1 5 10<210>8<211>15<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>8Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val1 5 10 15<210>9<211>16<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>9Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15<210>10<211>17<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>10Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn<210>11<211>18<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>11Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu<210>12<211>19<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>12Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn<210>13<211>20<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>13Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu20<210>14<211>21<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>14Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu20<210>15<211>22<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>15Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu Arg20<210>16<211>23<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>16Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe20<210>17<211>24<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>17Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe20<210>18<211>25<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>18Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val20 25<210>19<211>26<212>PRT<213>人工的<220><223>合成肽<400>19Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala20 2权利要求
1.预防或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
2.预防或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
3.预防病毒感染的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
4.诱导造血的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
5.诱导造血干细胞增殖的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
6.诱导造血干细胞增殖和分化的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
7.诱导巨核细胞生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
8.诱导红细胞生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
9.诱导白细胞生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
10.诱导血小板生成的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
11.预防或治疗血小板减少症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
12.预防或治疗全血细胞减少症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
13.预防或治疗粒细胞减少症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
14.预防或治疗高脂血症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
15.预防或治疗高胆固醇血症的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
16.预防或治疗葡尿的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
17.预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
18.预防或治疗艾滋病的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
19.预防或治疗HIV感染的方法，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
20.预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的方法，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持，该方法包括给需要的受体应用治疗有效剂量的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽。
21.权利要求1-20的任意一种方法，其中所述肽是衍生于αS1酪蛋白断裂的片段。
22.权利要求1-20的任意一种方法，其中所述肽是合成肽。
23.权利要求1-20的任意一种方法，其中所述肽具有序列1-19公开的序列之一。
24.预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
25.预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
26.预防病毒感染的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
27.诱导造血的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
28.诱导造血干细胞增殖的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
29.诱导造血干细胞增殖和分化的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
30.诱导巨核细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
31.诱导红细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
32.诱导白细胞生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
33.诱导血小板生成的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
34.预防或治疗血小板减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
35.预防或治疗全血细胞减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
36.预防或治疗粒细胞减少症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
37.预防或治疗高脂血症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
38.预防或治疗高胆固醇血症的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
39.预防或治疗葡尿的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
40.预防或治疗糖尿病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
41.预防或治疗艾滋病的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
42.预防或治疗HIV感染的药物组合物，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
43.预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的药物组合物，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持，该药物组合物包括，作为活性成分的αS1酪蛋白N末端部分衍生肽和药用载体。
44.权利要求24-43的任意一种药物组合物，其中所述肽是衍生于αS1酪蛋白断裂的片段。
45.权利要求24-43的任意一种药物组合物，其中所述肽是合成肽。
46.权利要求24-43的任意一种药物组合物，其中所述肽具有序列1-19公开的序列之一。
47.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗自身免疫性疾病的用途。
48.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗病毒性疾病的用途。
49.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防病毒感染的用途。
50.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血的用途。
51.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血干细胞增殖的用途。
52.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导造血干细胞增殖和分化的用途。
53.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导巨核细胞生成的用途。
54.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导红细胞生成的用途。
55.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导白细胞生成的用途。
56.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于诱导血小板生成的用途。
57.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗血小板减少症的用途。
58.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗全血细胞减少症的用途。
59.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗粒细胞减少症的用途。
60.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗高脂血症的用途。
61.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗高胆固醇血症的用途。
62.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗葡尿的用途。
63.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗糖尿病的用途。
64.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗艾滋病的用途。
65.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗HIV感染的用途。
66.αS1酪蛋白N末端部分衍生肽用于预防或治疗与清髓性大剂量放化疗相关的疾病的用途，所述清髓性放化疗采用自体骨髓或外周血干细胞移植(ASCT)或异体骨髓移植(BMT)支持。
67.权利要求47-68的任意一种用途，其中所述肽是衍生于αS1酪蛋白断裂的片段。
68.权利要求47-68的任意一种用途，其中所述肽是合成肽。
69.权利要求47-68的任意一种用途，其中所述肽具有序列1-19公开的序列之一。
70.一种纯化的肽，具有选自序列1-19的氨基酸序列。
71.一种药物组合物，包括纯化的肽和药用载体，所述肽具有选自序列1-19的氨基酸序列。
72.一种在清髓性受体体内增强供体血液干细胞定殖的方法，该方法包括在受体接受供体血液干细胞捐献和植入前，应用αS1酪蛋白N末端部分衍生肽处理提供血液干细胞的供体。
73.一种在清髓性受体体内增强供体血液干细胞定殖的方法，该方法包括在受体接受供体血液干细胞植入前，应用αS1酪蛋白N末端部分衍生肽处理供体的血液干细胞。
74.一种在清髓性受体体内增强血液干细胞定殖的方法，该方法包括在受体接受血液干细胞植入前，应用αS1酪蛋白N末端部分衍生肽处理该血液干细胞。
全文摘要
衍生于奶酪蛋白或与奶酪蛋白αS1部分N末端序列相似的生物活性肽。这些肽能够刺激并增强免疫应答，保护避免病毒感染，使血清胆固醇水平正常化，并能刺激造血。酪蛋白衍生肽无毒，可以用来治疗、预防免疫性疾病、高胆固醇血症、血液系统疾病和病毒相关性疾病。
文档编号A61P37/02GK1427725SQ01808959
公开日2003年7月2日 申请日期2001年3月1日 优先权日2000年3月1日
发明者Z·斯德尔曼 申请人:蔡13医疗研究团体有限公司