专利名称：一种制备酪蛋白磷酸肽的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及到一种制备酪蛋白磷酸肽的方法。
背景技术：
酪蛋白磷酸肽(CPPs)是以牛乳酪蛋白为原料经单一或复合酶催化水解、分离、纯化而制得的含有成簇磷酸丝氨酸的一种天然生物活性多肽。它可作为无机离子的载体，在PH中性至微碱性的动物小肠下端，能与钙离子、亚铁离子和锌离子等结合，阻止金属离子与磷酸根产生沉淀，使小肠内可溶性的钙、铁和锌的浓度增加，从而促进这些必需金属离子的吸收和利用。此外，在动物和人的试验中，CPPs表现出抗龋齿、抗骨丢失、增强受精和胚胎发育等的作用。我国居民平均每天钙摄入量只有405.4mg,只占每日推荐量的50%左右，在有些地区儿童佝偻病的发病率可达40%，骨质疏松症也是困扰老人的常见疾病之一。因此，对于我国来说，全民补钙显得尤为重要。而补钙时不仅要注重钙的摄入，更要注重钙的吸收。而CPPs由于能够促进钙吸收的这一功能，其市场应用前景相当广阔。目前酪蛋白磷酸肽的主要生产方法是酶解法，即在水解罐中用蛋白酶对底物酪蛋白进行水解，水解结束后高温灭酶，再调节反应液PH使未水解的酪蛋白沉淀，离心后喷雾干燥而制得。工艺过程中主要存在以下问题:1、酶不能循环利用，生产成本高。2、产酶酶解不彻底。3、产品纯度低，质量得不到保证。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种制备酪蛋白磷酸肽的方法，尽可能的提高原料的利用率和广品的品质。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:一种制备酪蛋白磷酸肽的方法，该方法包括如下步骤:(I)在酪蛋白中加入蛋白酶进行酶解反应；(2)利用超滤膜分离出酶解产物酪蛋白磷酸肽；(3)超滤后的产物酪蛋白磷酸肽经纳滤膜脱盐处理后即得；(4)超滤膜截留液继续加入蛋白酶进行酶解反应，重复步骤(2)和(3)。步骤(I)和(4)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶中的任意一种或几种的混合物。步骤(I)和(4)中，所述的酶解反应条件为:温度3(T60°C，搅拌速度5(T300rpm，反应时间0.5 5h，酪蛋白原始反应浓度为2(T200g/L，蛋白酶浓度为0.2^2g/L, pH为6 9。步骤(2)中，所述的超滤膜为聚砜超滤膜，膜截留分子量为1000 10000道尔顿。步骤(2)中，所述的超滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。步骤(3)中，所述的纳滤膜为聚砜纳滤膜，膜截留分子量为150 1000道尔顿。步骤(3)中，所述的纳滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
有益效果:本发明相对于现有技术具有如下优点:1、重复利用酶液和底物，降低生产成本。2、利用超滤膜和纳滤膜组合分离酪蛋白磷酸肽，得到高品质的产品。3、本发明所涉及的反应条件温和，能耗低，适合大规模连续化生产。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:向反应釜中加纯水20L，开搅拌200rpm，加热至45°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白2Kg，将pH调至7.0 ;投入木瓜蛋白酶10g。酶解I小时后，将料液降温到30°C以下，用6000道尔顿的卷式超滤膜超滤，浓缩到4L，收集透过液至离心液收集罐。浓缩液加纯水到16L回到酶解罐中，升温到45°C，调节pH为7.0，继续酶解。酶解I小时后，将料液降温到30°C以下，超滤浓缩到4L，收集透过液到离心液收集罐。浓缩液再一次加纯水到16L回到酶解罐中，升温到45°C，调节pH为7.0，继续酶解，Ih后酶解结束。调pH4.6灭酶。用离心机离心，离心液至离心液收集罐 。用300道尔顿的卷式纳滤膜纳滤离心液，纳滤到IOL后，在纳滤罐中添加纯水，继续纳滤。添加6次共60L纯水脱盐，将物料最终纳滤到5L。喷干得到产品
1.03kg, CPP 含量 16.3%，蛋白含量 90%。实施例2:向反应釜中加纯水20L，开搅拌150rpm，加热至50°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白lKg，将pH调至6.5 ;投入中性蛋白酶8g。酶解2小时后，将料液降温到30°C以下，用3000道尔顿的中空纤维超滤膜超滤，浓缩到4L，收集透过液至离心液收集罐。浓缩液加纯水到16L回到酶解罐中，升温到50°C，调节pH为6.5，继续酶解。酶解2小时后，将料液降温到30°C以下，超滤浓缩到4L，收集透过液到离心液收集罐。浓缩液再一次加纯水到16L回到酶解罐中，升温到50°C，调节pH为6.5，继续酶解，2h后酶解结束。调pH4灭酶。用离心机离心，离心液至离心液收集罐。用500道尔顿的板式纳滤膜纳滤离心液，纳滤到IOL后，在纳滤罐中添加纯水继续纳滤。添加6次共60L纯水脱盐，将物料最终纳滤到5L。喷干得到产品490kg, CPP含量15.4%，蛋白含量89%。实施例3:向反应釜中加纯水20L，开搅拌300rpm，加热至55°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白2Kg，将pH调至8.0 ;投入复合蛋白酶10g。酶解3小时后，将料液降温到30°C以下，用4000道尔顿的卷式超滤膜超滤，浓缩到4L，收集透过液至离心液收集罐。浓缩液加纯水到16L回到酶解罐中，升温到55°C，调节pH为8.0，继续酶解。酶解3小时后，将料液降温到30°C以下，超滤浓缩到4L，收集透过液到离心液收集罐。浓缩液再一次加纯水到16L回到酶解罐中，升温到55°C，调节pH为8.0，继续酶解，3h后酶解结束。调pH4灭酶。用离心机离心，离心液至离心液收集罐。用300道尔顿的卷式纳滤膜纳滤离心液，纳滤到IOL后，在纳滤罐中添加纯水，继续纳滤。添加6次共60L纯水脱盐，将物料最终纳滤到5L。喷干得到产品
0.99kg, CPP 含量 16.0%，蛋白含量 91%。
权利要求
1.一种制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)在酪蛋白中加入蛋白酶进行酶解反应； (2)利用超滤膜分离出酶解产物酪蛋白磷酸肽； (3)超滤后的产物酪蛋白磷酸肽经纳滤膜脱盐处理后即得； (4)超滤膜截留液继续加入蛋白酶进行酶解反应，重复步骤(2)和(3)。
2.根据权利要求1所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，步骤(I)和(4)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶中的任意一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，步骤(I)和(4)中，所述的酶解反应条件为:温度3(T60°C，搅拌速度5(T300rpm，反应时间0.5飞h，酪蛋白原始反应浓度为2(T200g/L，蛋白酶浓度为0.2^2g/L, pH为6 9。
4.根据权利要求1所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的超滤膜为聚砜超滤膜，膜截留分子量为1000 10000道尔顿。
5.根据权利要求1或4所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，步骤⑵中，所述的超滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
6.根据权利要求1所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的纳滤膜为聚砜纳滤膜，膜截留分子量为150 1000道尔顿。
7.根据权利要求1或6所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的纳滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
全文摘要
本发明公开了一种制备酪蛋白磷酸肽的方法，该方法包括如下步骤(1)在酪蛋白中加入蛋白酶进行酶解反应；(2)利用超滤膜分离出酶解产物酪蛋白磷酸肽；(3)超滤后的产物酪蛋白磷酸肽经纳滤膜脱盐处理后即得；(4)超滤膜截留液继续加入蛋白酶进行酶解反应，重复步骤(2)和(3)。本发明方法操作简单，设备要求低，收率高，产品质量好。
文档编号C07K1/34GK103114118SQ20131005468
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月20日 优先权日2013年2月20日
发明者陈晓春, 蔡家栋, 张磊, 黄小权, 盛兵, 汤亦文, 李淑亚 申请人:南京同凯兆业生物技术有限责任公司