一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，属于提取纯化分离领域。
【背景技术】
[0002] 蛋黄蛋白粉是蛋黄卵磷脂工业化生产的副产物，越来越来的学者对其进行了综合 研究并取得了一些进展。卵黄高磷蛋白（Phosvitin，PV)是脱脂蛋黄蛋白粉中的主要含磷 蛋白，一级结构中含有217个氨基酸残基，其中124个是丝氨酸残基，约占总氨基酸残基含 量的56%。已有众多研究表明，卵黄高磷蛋白可与Ca 2+，Mg2+，Mn2+，Co2+，Sr2+，Fe 2+，Fe3+等 结合。由于卵黄高磷蛋白与金属离子结合牢固，不易被水解，使得其生物学效价较低，不 利于营养吸收。现已证实，能与钙形成可溶性络合物的主要功能团是磷酸酰丝氨酸，所以 将磷酸酰丝氨酸残基含量高的卵黄高磷蛋白进行水解，其水解产物卵黄高磷蛋白磷酸肽 (Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)可作为很好的钙吸收促进剂，不仅能增加 钙在小肠内 的吸收及其在体内的蓄积，而且卵黄高磷蛋白磷酸肽诱导的钙代谢无需维生素 D的参与， 且能促进铁、锌等离子的吸收。
[0003]目前关于卵黄高磷蛋白磷酸肽研究仅限于实验室水平。常规的PPPs制备方法是 先从蛋黄粉中提取出卵黄高磷蛋白PV，然后对PV进行处理，纯化得到PPPs。也有报道，是 先对蛋黄粉进行脱脂，然后对脱脂后的蛋黄粉进行处理得到粗多肽，再纯化得到PPPs。采用 的纯化方法为乙醇钙沉淀法、膜分离法和离子交换树脂等方法。乙醇钙沉淀法虽然方法简 单，但是有机试剂用量大，对环境有一定的污染；膜分离法膜污染情况严重，需要进行清洗 维护；离子交换树脂法需要使用前和再生时进行处理，操作复杂。也有报道是磁纳米颗粒富 集法进行纯化的，但是磁纳米颗粒不仅稳定性差（重复使用三次时已不能发生吸附），而且 洗脱过程中使用的咪唑溶剂不符合食品领域的应用。
【发明内容】
[0004] 为了克服目前卵黄高磷蛋白磷酸肽（Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)，纯化过 程中存在的上述问题，本发明一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，直接以利用蛋黄卵磷脂 生产的副产物为原料，省去脱脂步骤，然后进行脱磷、酶解，制备粗多肽。本发明采用介孔/ 大孔 TiO2 (macro-mesoporous titanium dioxide，MMTD)为富集材料，直接将 PPPs 特异性 吸附出来，然后根据1102的性质进行洗脱（碱性条件下PPPs与TiO 2发生离子排斥反应）， 操作简便、节省时间，不仅提高了吸附效率，也大大减少了生产成本。
[0005] 本发明提供了一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，所述方法是先将蛋黄蛋白粉进 行部分脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行酶解，得到粗多肽，再 采用介孔/大孔TiO 2M料对粗多肽进行吸附，洗脱，即得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。
[0006] 所述蛋黄蛋白粉，在本发明的一种实施方式中，是蛋黄卵磷脂生产中的副产物。
[0007] 所述吸附、洗脱，在本发明的一种实施方式中，是将粗多肽配制成浓度为6mg/ mL-22mg/mL的溶液，按每30mL粗多肽溶液加入Ig介孔/大孔1102材料，在pH 1. 0-6. 0下 震荡吸附5-60min，然后过滤，洗涤滤渣以去除表面吸附的杂质，然后用碱性溶液将滤渣表 面富集的卵黄高磷蛋白磷酸肽进行洗脱。
[0008] 所述粗多肽溶液，在本发明的一种实施方式中，粗多肽浓度为12mg/mL-20mg/mL。
[0009] 所述pH，在本发明的一种实施方式中，pH 2. 5-4。
[0010] 所述吸附，在本发明的一种实施方式中，吸附时间为5-30min，优选5-20min。
[0011] 所述吸附，在本发明的一种实施方式中，是在15-25°C，150-220rpm进行。
[0012] 所述洗脱，在本发明的一种实施方式中，是使用0. 05-0. 20m〇L/L的NaOH溶液。
[0013] 所述吸附、洗脱，在本发明的一种实施方式中，条件是：pH为3.0,粗多肽浓度为 17mg/mL，吸附时间为20min。
[0014] 所述部分脱磷处理，在本发明的一种实施方式中，是采用碱法脱磷。
[0015] 所述部分脱磷处理，在本发明的一种实施方式中，是将蛋黄蛋白粉置于碱性溶液 中，搅拌处理，然后超滤除去磷酸根离子。在本发明的一种实施方式中，脱磷率为48-64%。
[0016] 所述部分脱磷处理，在本发明的一种实施方式中，具体是：将蛋黄蛋白粉置于 0. 1-0. 2mol/L的NaOH溶液中，37°C条件下搅拌3h进行碱法脱磷处理，将处理后的溶液进行 超滤除去磷酸根离子（超滤膜为3000K，回流口压力为5~IOpsi，进口压力为20~30psi)。
[0017] 所述酶解，在本发明的一种实施方式中，是将经脱磷处理的蛋黄蛋白粉（脱磷率 为48-64% )和水加入酶解反应器中，搅拌均匀，在37-50°C，pH 7. 0-9. 0条件下，加入胰蛋 白酶进行酶解；酶解结束后进行灭酶处理，得到含有PPPs的蛋黄蛋白水解多肽，即粗多肽； 所述底物蛋黄蛋白粉的浓度为〇. 5-2. 0%，酶：底物=1:20-1:200。在本发明的一种实施方 式，水解度为12%以上。
[0018] 所述酶解，在本发明的一种实施方式中，时间为0. 4-4h。优选50-100min。
[0019] 所述酶解，在本发明的一种实施方式中，是在50°C、pH 8的条件下进行，底物蛋黄 蛋白粉的浓度为1% (m/v)，酶与底物质量比为5:100。灭酶处理后，先调节pH至中性，再 冷冻干燥得粗多肽。
[0020] 所述介孔/大孔TiO2，在本发明的一种实施方式中，是采用溶胶凝胶法得到的。
[0021] 所述介孔/大孔TiO2，在本发明的一种实施方式中，是按照以下步骤制备得到的： 柠檬酸溶于乙醇中，搅拌，然后加入氨水溶液，继续搅拌，之后将钛酸四正丁酯在搅拌状态 下，逐滴加入上述溶液，搅拌，然后静置；然后依次用水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤 后的材料干燥，最后将上述材料置于马弗炉中进行煅烧；其中每〇. 3g的柠檬酸，加入ISmL 质量浓度为25% -28%的氨水和5mL钛酸四正丁酯。
[0022] 所述介孔/大孔TiO2，在本发明的一种实施方式中，是按照以下步骤制备得到的： 每〇. 3g的柠檬酸溶于乙醇中，搅拌30min，然后加入质量浓度为25% -28%氨水溶液18mL， 继续搅拌l〇min，之后将5mL钛酸四正丁酯在搅拌状态下，逐滴加入上述溶液，继续搅拌lh， 然后静置；然后依次用水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤后的材料干燥，最后将上述材 料置于550°C煅烧4h。
[0023] 所述溶解柠檬酸的乙醇，在本发明的一种实施方式中，为40mL 95%无水乙醇。
[0024] 所述煅烧，在本发明的一种实施方式中，煅烧条件为550°C，4h。
[0025] 本发明还要求保护按照上述方法得到的卵黄高磷蛋白磷酸肽，以及其在食品方面 的应用。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] (1)本发明提供的卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集方法操作简单、分离纯化周期较短， 适合工业化应用；从吸附、清洗到洗脱整个过程在1~3小时内完成；而常规乙醇沉淀法 时间为2-3个小时，膜分离法时间为4个小时，且步骤繁多，膜容易污染；（2)本发明方法 所得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品的N/P为4. 3-5. 0,与目前报道方法得到的磷酸肽相比，纯度 较高；（3)本发明方法还对现有的脱磷方法和酶解方法进行了改进，直接对蛋黄蛋白粉进 行碱法脱磷，脱磷率可达64%，酶解的水解度为15.67% ;同时采用具有规则的孔道结构与 较大的比表面积的介孔/大孔TiO2富集PPPs，吸附效率高，吸附量可达42-53mg/g(PPPs/ MMTD)，远远高于已有报道。
【附图说明】
[0028] 图1 :介孔/大孔1102材料的扫描电镜。
【具体实施方式】 [0029] 脱磷率：
[0030] 根据GB/T 5009. 87- 2003,通过分光光度计法对脱磷前后的EYP进行磷含量的测 定。通过下述公式进行脱磷率的计算：
[0032] p :EYP 的脱磷率（％ )
[0033] Cpl:脱磷前EYP中磷的含量（mg/g)
[0034] Cp2:脱磷后EYP中磷的含量（mg/g)
[0035]水解度（DH):
[0036] 根据反应过程中记录所消耗的NaOH溶液的体积，按下述公式进行计算：
[0038] DH :脱磷EYP的水解度（％ )
[0039] VNaffl:滴定过程中消耗的NaOH的体积（mL)
[0040] CNaffl:反应使用的NaOH的摩尔浓度（m〇L/L)
[0041] MP :底物中蛋白质的总量（g)
[0042] α :氨基酸解离度（50°C，pH = 8. 0 时，I/ a = L 13)
[0043] htot:每克蛋白质中肽键的克当量（8.38)
[0044] N/P ：
[0045] 计算方法如以下公式：
[0047] r :待测样品中N和P的摩尔比
[0048] CN:待测样品中N的含量（mg/g)
[0049] Cp:待测样品中P的含量（mg/g)
[0050] 31 :P的相对分子质量
[0051] 14 :N的相对分子质量
[0052] 实施例1 :蛋黄蛋白粉部分脱磷方法
[0053] 将蛋黄蛋白粉置于0. 05-0. 2mol/L的不同浓度的NaOH溶液中，37°C条件下搅拌3h 进行碱法脱磷处理，将处理后的溶液进行超滤除去磷酸根离子（超滤膜为3000K，回流口压 力为5~lOpsi，进口压力为20~30psi)，比较了不同浓度的NaOH溶液处理下蛋黄蛋白粉 的脱磷率。
[0054] 结果显示 0· 05mol/LNa0H，脱磷率为 27%;0· Imol/LNaOH，脱磷率为 46%;0· 15mol/ L时，脱磷率为53% 2mol/L时，脱磷率为64%。
[0055] 实施例2 :部分脱磷的蛋黄蛋白粉的酶解
[0056] 对部分脱磷处理的蛋黄蛋白粉进行酶解，结果发现脱磷率低，导致水解度低。但是 如果脱磷过度，得到的PPPs持钙功能降低。所以选用脱磷率在46 % -64 %的脱磷后的蛋黄 蛋白粉进行酶解。
[0057] 酶解过程如下：将脱磷蛋黄蛋白粉和去离子水加入酶解反应器中（底物浓度为 1 % )，50°C水浴循环加热，待溶液搅拌均匀后，调节pH至8. 0,将一定量的胰蛋白酶加入上 述溶液（酶：底物=5 :100)，反应过程中用0. lmol/L的NaOH溶液进行滴定，维持pH为8.0， 反应时间4h。酶解结束后将上述反应溶液置于90°C条件下，IOmin处理进行灭酶处理，冷却 后将酶解液PH调至7. 0。最后将酶解液进行冷冻干燥得到含有PPPs的蛋黄蛋白水解多肽 (简称粗多肽）。采用脱磷率在64%的蛋黄蛋白粉的酶解的水解度为15. 67%。而且在Ih 内就可以得到14%以上的水解度。
[0058] 实施例3 :介孔/大孔1102材料的制备