专利名称：含有以得自酪蛋白的肽为渗透剂和碳酸氢根离子为缓冲剂的透析液的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于医学透析方法的液体，尽管不是绝对的，特别是，用于持续不卧床腹膜透析(CAPD)技术中的腹膜透析。
在人体中，通过包括透析，渗透和超滤(下文统称为“透析”)的扩散过程，溶质从一种体液转移到另一种中。不需要的溶质，毒素和过量的水通过在肾中透析而从血流转移出以便排出体外。在肾功能障碍的情况下，适应的医学治疗方法通常是肾移植或者体外血液透析。优选的治疗是肾移植，但这取决于是否可得到可相容组织型的供体肾。外科手术过程长，而且因此人力和装置费用昂贵，尽管通过给药，在很大程度上是可控制的，但是仍可能发生移植肾的排异反应。但由于患者此后可能会有或多或少的正常生活型，所以移植仍是优选的治疗方法。
血液透析是肾移植的替代方法。根据肾功能障碍的严重程度，患者需要或多或少地经常进行透析。从患者血流中取出血液，然后通过透析装置，在所述透析装置中，将血液与选择性的可渗透膜(例如是纤维素或合成的聚合材料制成的)接触，其远端与透析液接触。根据扩散规律，血液中的溶质被跨膜运输到透析液中，然后通过超滤除去水。
血液透析通常是在医院门诊部，在医疗指导下完成，尽管可以由患者在家中完成，但他或她应该在经过培训后能够谨慎地观察过程。在家中没有适当的条件或患者因一种或另一种原因而不能观察，就应该排除在家中透析。透析装置昂贵而且需要经常规消毒来进行大量的保养。
血液透析极端地限于患者。例如，如果不在治疗中心的附近，他或她就得在他或她的指定地点在透析单位进行治疗。总之，肾透析对于患者的治疗形式有严格的限制，在医院中透析患者要参与，如果在家中完成，要求患者进行大量的合作并注意详细的过程。与所述方法有关的硬件设备也很昂贵。
腹膜透析现在是一种很成熟的方法，可以用它作为体外血液透析的替代来用于因除肾衰竭本身外的医疗条件，血液透析不适用或使用血液透析不方便的患者。
在腹膜透析中，经一导管将透析液导入到患者腹内的腹腔中，然后会通过作为半透膜的腹膜除去毒素和水。液体充斥在腹腔内保留一段适当的时间，然后排出。
在持续不卧床腹膜透析(CAPD)中，经外科手术，植入一永久性的导管通过患者的腹壁，通常由于过程简单，患者自己从消毒液的软扁袋通过所述导管就可将透析液导入。导入透析液后，患者简单地卷起连着的扁袋，在他或她的衣服口袋中，将其放入并保持与导管相连，然后在透析通常中就可自由地进行正常活动。过一段时间后，在重力下他或她排尽用尽的液体使其回到扁袋中进行处理，然后再导入新鲜的液体。因此，透析是连续的，这种方法的优点在于在透析过程中不会间歇性地破坏患者的身体化学。液体更换的频率随患者的不同而不同，但每24小时可以是大约4次。
在任何形式的透析中，透析液应该按需要含有基本上是等渗浓度的生理离子。用这种方法可以使生理离子不必要的损失降到最小，而且因施加过大的渗透压而带来的钝化患者膜和血细胞的危险也降到最低。在损失的生理离子中，可以提到的有Na+，Mg2+，Ca2+，和Cl-。在克分子渗压浓度例如约300mOsm/Kg的透析液中，生理盐可以是约250mOsm/Kg。
除生理盐外，在透析液中通常还包括有效的渗透剂，它提供使不需要物质如脲从患者血流中跨过透析膜所需的额外克分子渗压浓度，不论是肾透析装置还是患者的腹膜。在选择损失渗透压时必须小心以便在跨透析膜时提供不太高的渗透压。此外，在万一通过透析膜漏出的情况下，它应该是无毒的，而且在它跨透析膜时对患者没有不利的影响。从合乎需要来说，它还应该有足够该的分子量以便尽可能地减少通过透析膜的扩散，但又不能很高以致在透析液中其重量浓度很高而产生所需的克分子渗压浓度。
在透析液中常常包含糖，最常用的是葡萄糖以给与所需的渗透梯度。导入到腹腔中的几乎任何物质均可找到其最终进入血流的途径，所述途径因整个腹膜不完整而得到增强，这在需要治疗的患者中并不少见。尽管身体有足够的能力代谢多余的糖，但是在透析液中所包含糖的长期影响是不令人满意的而且在某些患者如糖尿病患者中，会构成不能接受的医疗危险，因此要将胰岛素导入到透析液中会给患者带来进一步的困难。
以前已经建议用寡-和多糖作为有效的渗透剂。但是这些物质应能透过腹膜，然后发生导致解聚的水解作用，但与单糖有关的不可接受的疾病又会发生。已经研究了如山梨醇，木糖醇，多葡萄糖和果糖等物质来用于腹膜透析，但尚未被广泛地接受。
还已经建议加入各种聚合物，包括含至少10摩尔％天冬氨酸，谷氨酸或其组合的合成多肽和蛋白质的钠盐。在US-A-4339433中描述了该建议。需要大量所述的高分子量物质以得到所必需的克分子渗压浓度。
另一种方法是在透析液中含甘油作为有效的渗透剂。在WO-A-82/03987中描述了该方法。但是甘油分子相当小，因而很容易透过透析膜。当患者患有待治疗的糖尿病时，它就不能存在于透析溶液中。
在医药中广泛地使用氨基酸混合物来治疗各种医学疾病，而且有潜力在透析液中用作渗透剂。它们是无毒的，而且身体对其非常耐受，但由于分子量低并且小，所以它们很溶液穿过腹膜，而且由于非常迅速以致会损失渗透梯度，从而导致溶质从透析液中反向流到循环中。但是在这方面，以前的工作肯定了这些物质是无毒性的。
在某些医药适应症中用蛋白质水解产物溶液(例如可以酶水解酪蛋白来得到)来进行注射。通过部分除去或恢复或增加一种或多种氨基酸来对其进行修饰。它们可以含有醇，葡萄糖或其他适宜静脉内注射的碳水化合物。
US-A-4906616涉及一种透析液，它含有通过蛋白水解酶对奶蛋白质的酪蛋白酸钠部分作用而得到的蛋白质水解产物作为保持透析液克分子渗压浓度的有效试剂。
在肾功能不全中，代谢性酸中毒是透析要解决的问题之一。为了达到该目的，在透析溶液中掺入缓冲物质，在CAPD液中，开始是碳酸氢盐(Boen，S.T..，Peritoneal Dialysis in Clinical Medicine，C.C.Thomas；springfield IL，US，1964，p45)。但是，发现含碳酸氢盐的葡萄糖为基础的液体会在腹膜内沉淀碳酸钙和碳酸镁。另外，由于在高温高压消毒时，不溶性盐的形成和葡萄糖与碳酸氢盐的作用，含碳酸氢盐，钙和镁和葡萄糖的腹膜透析溶液极难制备消毒和贮存(Biasioli，S.et ai.，sodiumLactate and other buffers for dialysis，ContemporayDialysis，10，46，1982)。可以用乳酸盐，偶尔用乙酸盐代替碳酸氢盐作为缓冲剂。但是，一般被接受的是，用在CAPD中正常使用的35mmol/l乳酸盐溶液不能完全校正代谢性酸中毒。此外，已经报道说乳酸盐和乙酸盐均会产生副作用和代谢问题(Biasioli，S.et al.，Buffers in peritonealdialysis，Journal of Artificial Organs，10，3-8，1987)。相同的作者还说明在高温高压消毒过程中为避免葡萄糖的焦糖化所需的含葡萄糖溶液的低pH，以及乳酸盐的非生理浓度会以出乎患者意料的结果损坏腹膜。
如果只将碳酸氢钠给与患者就没有在腹膜内沉淀不可溶碳酸盐的危险，但它在CAPD中应是理想的缓冲剂。
在过去10年间，为了达到该目的已经作了大量的努力。这无例外地包括在一透析袋中通过一薄隔膜将在一室中的葡萄糖透析溶液与在该袋第二个室中的碳酸氢钠溶液分开。在将要使用前，将隔膜弄破，在袋内混合溶液得到碳酸氢盐缓冲的葡萄糖透析液。尽管有人认为该溶液在校正尿毒症酸中毒中是有效的(Feriani，M，et al.，Continuous ambulatoryperitoneal Dialysis Internatinal 13(Suppl.2)588-91，1993)，但从慢性治疗的治疗的实践上讲，认为这种方法有点笨拙而且不方便。此外，所述系统的生产比在单室的袋中制备液体更复杂。这种方法显然不理想，但目前，在葡萄糖基的透析液中，是获得与用碳酸氢盐代替乳酸盐作为缓冲剂相关的好结果所必需的方法。
本发明的目的之一是提供没有上述限制的透析液。另一目的是提供碳酸氢盐缓冲的透析液，适用于CAPD，它在贮存后没有碳酸氢镁或碳酸氢钙或碳酸镁或碳酸钙沉淀。
因此，本发明提供透析液，它含有i)一种有效的渗透剂，含有通过蛋白水解酶对蛋白质或蛋白质混合物的作用可得到的一种或多种肽，和ii)包含碳酸氢根离子的缓冲剂。
在本发明的一个实施方案中，所述蛋白质或蛋白质混合物包含酪蛋白。就这点而论，通常方便地是使用牛酪蛋白。其他蛋白质源如蛋白蛋白或乳清蛋白也可以用在从中的可得到本发明透析液中所用多肽的蛋白质或蛋白质混合物中。
很容易大量得到酪蛋白。适宜的级是食品级酪蛋白。这通常是从奶，优选从牛奶中生产.在pH7.0或更大的溶液中，它作为酪蛋白酸钠而存在，假定用例如氢氧化钠实现pH的调节。在牛酪蛋白的情况下，已经完全阐明了磷蛋白混合物中每种的结构。结果，用具有高比活性的蛋白水解酶，例如胰蛋白酶处理酪蛋白或酪蛋白酸钠后，形成了含有可预测模式分子大小的肽混合物，原因在于所述酶在对酶攻击敏感的相关位点裂解了蛋白质。一般来讲，当用胰蛋白酶作为蛋白水解酶时，理论上肽混合物的平均分子量为约1000道尔顿(用排阻层析确定的值)。所述肽混合物含有少量分子量为约250-约500道尔顿的肽片段，以及很少分子量为约1800到约3000道尔顿的较大片段。如果需要，通过在pH4.5-5.1沉淀可以除去较大的片段。占总肽含量＜10％的较小片段不从平均分子量为约1000的主要肽组分中分离出来。通过用第二种蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶进行酶水解可以进一步降低平均分子量。另外，可以用膜筛出比所需大小大或小的分子。
在透析液中优选的碳酸氢根离子浓度为20-40meq/l。
可以用于形成在本发明透析液中所包含的肽混合物的蛋白水解酶是胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰酶，链霉蛋白酶或其组合。可以用两种或多种酶的混合物从所选的蛋白质，如酪蛋白形成肽混合物。另外，可以依次使用两种或多种酶，可以或不必除去在加入第二种酶前加入的第一种酶。
本发明的透析液一般具有的克分子渗压浓度为约100到约400mOsm/Kg，优选为约250到约350mOsm/Kg。有效的渗透剂在总克分子渗压浓度中通常产生约25到约100mOsm/Kg，通常由生理盐提供平衡。
本发明透析液的pH一般为约6.6-7.6。
本发明的透析液除任何生理学可接受的盐外，还含有足够有效的渗透剂以使所述液体的克分子渗压浓度为约25到约100mOsm/Kg。除通过蛋白水解酶对蛋白质，如酪蛋白的作用而可得到的或得到的肽外，透析液还可包含少量另一种渗透剂，如葡萄糖或甘油。所述少量渗透剂通常给与透析液以0到约5mOsm/Kg的克分子渗压浓度。
优选的，本发明的透析液基本上没有葡萄糖和甘油。应该理解，本文公开的透析液还可以含有包含选自钠，钙，氯，乳酸根，柠檬酸根和镁离子的生理盐。
利用通过蛋白水解酶，如仅胰蛋白酶或胰蛋白酶接着胰凝乳蛋白酶作用于牛酪蛋白而得到的肽混合物，作为有效的渗透剂代替葡萄糖提供了形成含碳酸氢盐的稳定透析液的可能。这些溶液在生理范围内可以有任何特定的所需pH值，而且最值得注意的是6.6到7.6之间。它们还可以调节CAPD中所需的Na+，Mg2+，Ca2+和Cl-的浓度，优选的基本上在等渗量。由于在本发明的透析液中用33-35meq/l碳酸氢盐代替了乳酸盐，所以不再需要乳酸盐。上述所提到的与乳酸盐的使用有关的不利副作用和代谢问题因这种含碳酸氢盐液体的使用而得到避免。这在本领域已知的葡萄糖基液体中代表了一种显著的优点。
已经表明，按下述制备的并以适用于CAPD的浓度含肽，HCO3-，Cl-，Na+，Ca2+和Mg2+的液体当在接近20℃和pH7.2体外贮存数月没有沉淀。没有沉淀归因于以足以溶解Ca2+和Mg2+的量存在的肽的化学特性。
下面，借助说明来描述制备本发明含碳酸氢盐之肽基液体的过程。实施例1将市售食品级牛酸性酪蛋白，80g悬浮在无热原的水中，900ml，30℃，然后将3M氢氧化钠边搅拌边逐滴加入，以便pH不会超过7.5。当蛋白质溶解完全后，最终将pH调到pH7.5，加入溶解在30ml0.001-盐酸的晶体胰蛋白酶，320mg。在30℃保持混合物，用玻璃电极监测pH，通过加入3M氢氧化钠以中和因胰蛋白酶作用于酪蛋白而释放的酸。大约2小时水解完全。在此阶段，加入溶解在30ml0.001-盐酸的晶体胰蛋白酶，320mg，然后将反应混合物在30℃，pH7.5再保持2小时。此后，通过逐渐加入3M盐酸而将pH降到4.6。在20℃过夜放置后，在此期间出现少量的絮状沉淀，通过过滤使混合物澄清。依次使溶液通过polysulphone膜过滤，所述polysulphone膜具有所述保留分子量大于10000的分子的能力，此后通过排除分子量为5000的polysulphone膜进行第二次过滤。所得的肽混合物含有分子量为300到1000道尔顿的肽，所述肽混合物的平均分子量为约700到约800道尔顿。用用质谱仪确定该值范围。它没有酶。
向由此得到的溶液中加入足够的3M-氢氧化钠溶液以使pH达到6.7，此后，按如下加入生理量的Na+，Ca2+，Mg2+，Cl-和HCO3-Na+130-145m.equvi/l；Ca2+1.5-2.5m.equvi/l；Cl-90-110m.equvi/l；HCO3-/30-35m.equvi/l；和Mg2+0-2.0m.equvi/l。通过逐滴加入3M-氢氧化钠，将所得溶液的pH调到7.0-7.5。克分子渗压浓度接近300mOsm/Kg，一般为约303-352mOsm/Kg，若在245-305mOsm/Kg左右，一般在252-299mOsm/Kg左右，可能归因于盐，所述盐对应肽混合物有约50mOsm/Kg。
通过用水在制备过程中的适当时候稀释可以降低对由肽混合物提供的总克分子渗压浓度的贡献或最初使用较强的酪蛋白溶液可以提高对由肽混合物提供的总克分子渗压浓度的贡献。
通过孔大小为0.2微米的微孔过滤而使该溶液灭菌。较所得的溶液消毒，没有热原和残留的酶活性。
用非尿毒症实验室大鼠完成初级体內试验，将上述溶液注射到所述大鼠的腹腔内。在大鼠中未观察到疾病作用。所述溶液既没有毒性，也不是致免疫的，是有效的透析剂。实施例2按实施例1所述将市售食品级牛酪蛋白，80g进行蛋白水解降解，除删去用胰凝乳蛋白酶处理外。所得的液体仅在其组成肽的平均分子量方面与实施例1中生产的有所不同，在本例中是约1000道尔顿。含碳酸氢盐的该液体的样品在于室温贮存长达3年后，未产生肉眼可见的沉淀。
权利要求
1一种透析液，含有i)一种有效的渗透剂，含有通过蛋白水解酶对蛋白质或蛋白质混合物的作用可得到的一种或多种肽，和ii)包含碳酸氢根离子的缓冲剂。
2根据权利要求1的透析液，其中所述蛋白质或蛋白质混合物含有酪蛋白。
3根据权利要求2的透析液，其中所述酪蛋白含有牛酪蛋白。
4根据权利要求1-3的任一透析液，其中蛋白水解酶含有胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰酶，链霉蛋白酶或其组合。
5根据权利要求1-4的任一透析液，其中所述碳酸氢根离子的浓度为20-40meq/l。
6根据权利要求1-5的任一透析液，其中所述液体的克分子渗压浓度为约100-约400mOsm/Kg。
7根据权利要求1-6的任一透析液，其中所述pH为约6.6到-约7.6。
8根据权利要求1-7的任一透析液，其中所述液体基本上没有葡萄糖。
9根据权利要求1-8的任一透析液，它还含有包含选自钠，钙，氯，乳酸根，柠檬酸根和镁之离子的生理盐。
全文摘要
本发明公开了用于医学透析方法的液体，它含有一种或多种蛋白质(如酪蛋白)作为有效的渗透剂和碳酸氢根离子作为缓冲剂。另外，所述透析液还可含有生理盐。
文档编号A61K31/19GK1150759SQ95193388
公开日1997年5月28日 申请日期1995年6月2日 优先权日1994年6月2日
发明者T·吉尔克里斯特, W·曼森 申请人:吉尔泰克有限公司