专利名称：一种抗高血压的酪蛋白活性肽及其生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酪蛋白活性肽，特别涉及一种从酪蛋白中生产具有抗高 血压功能的活性肽的方法，以及由该方法制得的具有抗高血压功能的酪蛋白 活性肽及其应用。
背景技术：
动物乳，常见的如牛乳是一种成分复杂的生物流体，其中蛋白质含量为32g/L,主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，而酪蛋白大约占80% (26g/L)，是 含磷的几种蛋白质的复合体，以胶体形式存在于牛乳中。牛乳蛋白质在营养 上是优质的全价蛋白质，蕴藏着多种生物活性肽片段，在生理上有许多作用。血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE) (EC3.4.15.1) 是一种多功能的两条肽链组成的酶，ACE是一种膜结合外在金属蛋白酶，主 要存在于血管内皮细胞以及其他种类的细胞。人体肾脏可以分泌一种特异性 的蛋白酶，即肾素。肾素作用于血管紧张素(一个存在于血管中相对分子质 量为57Kda的糖蛋白)可以释放出一种无活性的血管紧张素I (十肽 DRVYIHPFHL)， ACE可以使无活性的血管紧张素I的C-末端水解两个氨基 酸后转变成有活性血管紧张素II(八肽DRVYIHPF)，血管紧张素II可以降 低血液的流速，减少肾脏水分和盐的分泌，会导致血管平滑肌收縮，引发高 血压，同时ACE可水解血管舒缓激肽使其失活，而血管舒缓激肽可以舒张 血管，使血压降低。目前文献报道的大部分降血压肽产品为ACE抑制物(ACEI)，但没有 经过动物实验的验证环节，很难确定为是真正的抗高血压活性肽产品。例如 1982年，Maruyama等(Maruyama S.， Suzuki H. A peptide inhibitor ofangiotensin I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein . Agric. Biol. Chem. 1982,46:1393-1399.)采用胰蛋白酶水解酪蛋白，首次从酪蛋白中获得 了具有抑制ACE活性的三种肽Pro-Pro、 Ala-Pro、 Ala-Hyp;而有些具有降 血压功能的活性肽是经过酪蛋白发酵产生，而不是通过酶解作用产生，例如 用Z. /^/v幼'cws和S. cwevWae发酵得到的酸奶，以5mL / kg(体重)的剂量 饲喂SHR，可在6 8 h内明显地降低其心脏收縮压(MaenoM， YamamotoN， Takano T. Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Z^ctoZ^c/// ^ /ze/ve"cws CP 790. J Dairy Sci. 1996,79:1316-1321.)。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种从酪蛋白中生产具有抗高血压功 能的活性肽的方法，以及由该方法制得的具有抗高血压功能的酪蛋白活性 肽。本发明人选用碱性蛋白酶Alcalase，通过控制一定的条件，如底物浓度、 酶与底物的用量比例、酶解温度、pH值及时间等来水解酪蛋白，经过纯化、 脱盐、干燥等常规后续处理步骤得到肽产品，意外地发现其不仅具有良好的 抑制ACE功能，还具有良好的降血压功能。因此，本发明通过下列技术方案来解决上述技术问题 一种从酪蛋白中 生产具有抗高血压功能的活性肽的方法，其包括酶解反应及将酶解物脱盐的 步骤，其中所述的酶解反应中底物为酪蛋白水溶液，酶选用蛋白酶Alcalase， 酶的用量为0.072AU/g酪蛋白，整个反应过程中的温度控制在55°C~60°C， pH在8.4~8.6范围， 一般酶解时间为5~6小时左右。其中，底物酪蛋白的浓度太低太高，反应均不易控制。本发明优选的底 物浓度约为12 18w/v%，当浓度低于12%时，易造成酶浪费，反之当浓度 超过18%时，酪蛋白水溶液太浓稠，不利于在酶解过程中进行搅拌，从而造成水解不彻底。本发明最优选的底物浓度则在15%左右，此时，浓度适合， 最利于搅拌，水解反应均衡。本发明所采用的蛋白酶Alcalase的酶活力为2.4AU/g，故其用量换算成 占酪蛋白的重量百分比为3%。通过控制酶解条件在上述范围，根据下列公式，可计算出本发明酶解液 的水解度为25%。,、薛解液中游离氨基氮酪蛋白水解度(DH)=-x 100%样品中总含氮量其中，酪蛋白水解后产生的游离氨基氮采用甲醛滴定法测定(北京大学生物系生化教研室主编，生物化学实验指导，北京人民教育出版社)，样品酪蛋白中的总氮含量为150mg/g。根据本发明，酶解液的水解度达25%时 即为本发明酶解反应终点。同常规，所述的酶解反应通常采用酶反应器进行。在酶反应器中，按照 常规方法将酪蛋白溶于水中而制得所述的酪蛋白水溶液，不同的是控制溶解 温度为55。C 60。C， pH为8.4~8.6。较佳地，所述酶解反应的pH优选8.5。同常规，所述酶解反应还包括去除未水解酪蛋白的步骤，较佳地包括将 酶解反应结束后的水解液冷却至室温，调节pH为4.6析出沉淀，以10000rpm 速度离心30分钟除去沉淀的未水解酪蛋白。根据本发明，所述的酶解物脱盐最优选采用大孔树脂DA201-C， 70%的 乙醇为洗脱液对酶解物进行脱盐处理，比较集中的在大约1小时将大部分吸 附的肽洗脱下来，解吸附率为82%，脱盐率达到98%，利用DA201-C对蛋 白水解液进行动态脱盐处理达到很好的效果，而且无毒害。显然，如有与大 孔树脂DA201-C性质类似的大孔树脂也可以用于本发明。由于得到的酶解液体积太大，浓度太小，在用大孔树脂进行脱盐之前， 通常将酶解液浓縮或干燥。本发明可以采用现有干燥技术将酶解液千燥，优选冷冻干燥等低温干燥方法，以更好地保存活性成分。收集洗脱下来的溶液，按常规，可通过旋转蒸发等方法回收乙醇，得到 浓縮液。浓缩液喷雾干燥后得到淡黄色的粉末样品即为本发明抗高血压肽。本发明生产方法有以下优点1) 所用器械、试剂、树脂价格便宜，来源方便，有利于大规模加工生产；2) 生产过程中温度、pH等条件易控制，生产方法重复性很好，简便；3) 大孔树脂脱盐易于操作，效果好。而本发明抗高血压的酪蛋白活性肽即为由上述的方法制得的酪蛋白活性肽。体外试验显示其是优良的ACEI，而动物体内试验则进一步显示本发 明的酪蛋白活性肽具有良好的降血压功效。因此，本发明酪蛋白活性肽可用 于制备抗高血压的药品或饮食品。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。 实施例11、采用酶反应器进行酶的反应(1) 酪蛋白溶解将1000ml水加入反应器中，升温至最佳温度55'C左右，称取150g酪 蛋白(上海化学试剂公司)，在磁力搅拌下缓慢、逐渐放入水中，用2mol/L NaOH调节pH至8.5左右，在55'C的条件下使酪蛋白全部溶解，使反应器 中酪蛋白的浓度为15% (w/v， g/ml)。(2) 酶解按照酶活力单位/底物重量为0.072AU/g酪蛋白的比例，加入4.5g食品 级蛋白酶Alcalase (诺维信生物技术有限公司，2.4L，酶活力2.4AU/g)，维 持反应温度为55°C,并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2mol/L NaOH维持酶解液的pH为8.5左右，酶解时间为5小时。采用甲醛滴定法测定酶解液 中的游离氨基氮为5.625g，根据上述公式计算得水解度为25%。 (3)冷却、干燥以上述水解度时为反应终点，将酶解液快速冷却至室温，用10% (v/v) 的盐酸调pH值至4.6，待沉淀析出后，以10000r/min速度离心30min除去 未水解的酪蛋白。离心后得到的上清液真空浓缩后，冷冻干燥。2、 大孔树脂脱盐用水将样品溶解，样品浓度为40mg/ml，采用大孔树脂DA201-C (江阴 市有机化工厂)进行脱盐，70% (v/v)的乙醇为洗脱液，比较集中的在大约 1小时将大部分吸附的多肽洗脱下来，解吸附率为82%，脱盐率达到98%。3、 干燥样品收集上述洗脱液，旋转蒸发回收乙醇，得到浓縮液。将浓縮液进一步喷 雾干燥后得到本发明抗高血压肽的淡黄色的粉末样品。 实施例2将上述步骤l (1)酪蛋白溶解及步骤l (2)酶解过程中的温度改为60 'C， pH为8.6，底物浓度为12% (w/v， g/ml)，余同实施例1，制得本发明 抗高血压肽。实施例3将上述步骤l (1)酪蛋白溶解及步骤l (2)酶解过程中的温度改为58 °C， pH为8.4,底物浓度为18% (w/v， g/ml)，余同实施例1，制得本发明 抗高血压肽。试验实施例l抗高血压体外试验在5ml试管中分别加入200pl的5mmol/LHHL (马尿酰组氨酰亮氨酸) 溶液和作为ACEI的80^1的30u g/mL本发明的酶解液样品(实施例2步骤 1制得的脱盐前干燥品或步骤3制得的脱盐后干燥品溶于水制得)，于37°C 下保温3min，加入20|al血管紧张素转换酶(ACE 0.1U/ml)混匀后在37°C下保温30min。再加250W的l.ON盐酸溶液终止反应。在上述溶液中加入 1.7ml乙酸乙酯和硼酸钠缓冲液(pH8.3) 750ul的混合液中，经15s振荡混 匀后，静置5min，用移液管吸取l.Oml的乙酸乙酯层，在228nm处测吸光 度OD值。同时设立对照组(B)和空白组(C)，具体操作步骤如下表A(样品)B (对照)C (空白)100mU/mlACE(ul)00201N HCl(ul)002505mM HHL(ul)200200200ACEI(ul)80080硼酸钠缓冲液(ul)0750037。C水浴3min100mU/ml ACE(ul)2020037。C水浴30-60min1N HCl(ul)2502500ACEI(ul)0800硼酸钠缓冲液(ul)7500750乙酸乙酯(ml)1.71.71.715S振荡混匀静置5min取lml的乙酸乙酯层，采用N2吹干超纯水(ml)1.51.51.5228nm检测光吸收值ACE抑制活性(％) =[(B-A)/(B-C)]X100%A:在有ACE及ACE抑制物(ACEI)存在的条件下的OD值(实测值) B:无ACE抑制物存在的条件下测得的OD值(对照值) C:无ACE抑制物存在的条件下测得的OD值(空白值)脱盐前对ACE抑制活性为40.7%，脱盐处理后ACE抑制活性升高，样 品的活性升高幅度较大，达到80.1%。试验实施例2抗高血压动物体内试验采用RBP-1B型大鼠血压仪进行尾静脉测定血压的方法，测定大鼠的收 縮压(SBP)。在SHR大鼠清醒状态下，首先在4(TC的恒温箱内保温20min，采用 RBP-1B型大鼠血压仪进行尾静脉测定血压的方法，测定大鼠的收縮压 (SBP)。于实验前一周开始隔天测定大鼠的血压，待大鼠稳定适应后开始实 验记录。先测定灌胃前的大鼠血压(BP， mmHg)和心率(HR，次/min)， 然后500mg/kg剂量(根据大鼠的体重灌胃)样品(实施例1的活性肽)灌 胃，对照组予以同样剂量纯水灌胃，连续灌胃样品10天，测定灌胃样品后 的第ld、 3d、 5d、 7d、 9d、 10d大鼠血压和心率，而且测定第一天大鼠灌胃 样品后2h、 4h、 6h、 10h的血压和心率。每个测试点均测定2次大鼠的血压 和心率，2次测定的间隔时间约lmin，取2次测定值的平均值作为该测试点 大鼠的血压和心率值。SBP(mmHg)Odld3d5d7d9d7士SD/>值对照组192.0l卯.O191.2196.4194.4196.8192.7±2.31试验组202.2173.6170,4168.0169.6173.2176.1 ±12.86<0.05注将测得的数据用SPSS统计软件进行统计处理，采用t检验方法。试验结果表明，在产品应用过程中采用500mg^g剂量与对照组相比有 明显的降压作用。
权利要求
1、一种从酪蛋白中生产具有抗高血压功能的活性肽的方法，其包括酶解反应及将酶解物脱盐的步骤，其中所述的酶解反应中底物为酪蛋白水溶液，酶选用蛋白酶Alcalase，酶的用量为0.072AU/g酪蛋白，整个反应过程中的温度控制在55℃～60℃，pH在8.4～8.6范围，酶解时间为5～6小时。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酪蛋白水溶液由酪蛋 白在温度55。C 60。C， pH8.4 8.6条件下溶于水制得。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酪蛋白水溶液的浓度为 12~18w/v%。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述酪蛋白水溶液的浓度为 15%。
5、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶解反应还包括去除未 水解酪蛋白的步骤。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的去除未水解酪蛋白的 步骤包括将酶解反应结束后的水解液冷却至室温，调节pH为4.6，以 10000rpm速度离心30分钟除去沉淀。
7、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶解反应采用酶反应 器进行。
8、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶解物脱盐采用大孔 树脂DA201-C， 70%的乙醇为洗脱液对酶解物进行脱盐处理。
9、 一种由权利要求1~8任一项所述的方法制得的具有抗高血压功能的 酪蛋白活性肽。
10、 如权利要求9所述的酪蛋白活性肽在制备抗高血压的药品或饮食品 中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从酪蛋白中生产具有抗高血压功能的活性肽的方法，其包括酶解反应及将酶解物脱盐的步骤，其中所述的酶解反应中底物为酪蛋白水溶液，酶选用蛋白酶Alcalase，酶的用量为0.072AU/g酪蛋白，整个反应过程中的温度控制在55℃～60℃，pH在8.4～8.6范围，酶解时间为5～6小时。本发明还公开了该方法制得的酪蛋白活性肽。该活性肽具有良好的抗高血压功能，可用于制备抗高血压的饮食品或药品。
文档编号A61P9/12GK101326953SQ20071004220
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者霞 宫, 王荫榆, 郭本恒 申请人:光明乳业股份有限公司