专利名称：骨重建激活剂-酪脯肽及其药物组合物和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有激动骨重建(Bone remodeling)功能的成骨生长肽C端五肽 (0GP5)结构改造化合物，属于医药技术领域。
背景技术：
骨质疏松(OP)的发病机理较为复杂。至今已经明确的是更年期的激素分泌失调、 一些肿瘤诱发、化疗(如维甲酸、大量应用皮质激素等)等因素均可导致明显的骨量丢失、 骨疼痛以致多发性骨折。研究表明，骨组织中的破骨细胞及成骨细胞交替活化、互相制约的平衡是骨代谢的重要基础。因此一直破骨细胞及活化成骨细胞应该是改善骨代谢一场、修复骨组织的两个重要环节。然而目前临床上治疗OP的药物基本上是以破骨细胞为靶点的骨吸收抑制剂，如双膦盐类、雌激素及降钙素等为主。实践已经证明过分强调骨吸收抑制剂的应用，只能会削弱OP患者本已衰退的骨重建能力，进一步减少骨质重建部位，患者骨折率反而上升 [Blake, J. et al. JOGC, 2006, 28 (3) 185]，无益于骨质量的改善[丁晓颖，等.国外医学内科学分册，2004，3 (4) :175]。本发明涉及的酪脯肽系成骨生长肽C端五肽(0GP5)片段改构化合物。OGP为人体内源性可促进有丝分裂的含14个残基的活性肽。其C末端五肽(简称OGPQ为主要活性段，它可以促进实验动物的骨形成、增加骨密度及促使骨折的愈合[Chen Y. et al. J. Pept. Res. 2000,56 :147 ；Brager Μ. A. et al. J. Orthop. Res. 2000，18 :133]。0GP5 的作用靶点是成骨细胞，可望与以破骨细胞细胞为靶点的骨吸收抑制配合应用，达到使骨折率下降，真正改善骨质量的治疗效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一类新的骨重建激活剂，具体而言就是一类新的化合物酪脯肽。本发明要解决的另一个技术问题是提供含有这类化合物的药物组合物。本发明要解决的再一个技术问题是提供这类化合物在制备药物中应用。为解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案本发明以0GP5为先导结构，将第二位Gly改为环状的ftx)，N端的Tyr及右侧Phe可保留不变，也可以改为同样具有苯环结构的侧链。目标化合物中含有Tyr-Pro或Pro-Tyr片段是基本特点，因此取名为酪脯肽(Typrotide，简写TPT)。化合物主链的C端连有含HN (CH2) nC0NH (CH2) m (η及m = 1 10)结构的延长链为正序酪脯肽，或者N端连有大于4个单键长度的延长链则为反序酪脯肽。0GP5 =H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OHTPT 通式R1-X1-Pro-X2-X3-R2(I)
其中R1选自Suc (丁二酸单酰)、Ida(亚氨基二乙酸单酰)、Abu(Y-氨基丁酰)、 Aca (6-氨基己酰)、β-Ala、Gly (甘氨酰)或des (缺失)；X1,X2独立的选自Tyr (酪氨酰)Ihe (苯丙氨酰),Phe (4-N02)(对硝基苯丙氨酰)、 Trp (色氨酰)、Ser (Bzl) (0-苄基丝氨酰)、Thr (Bzl) (0-苄基苏氨酰)、HO-Ph-CO (对羟基苯甲酰)、Fer (3-甲氧基-4-羟基肉桂酰，阿魏酰)、Hna (羟基萘甲酰)、Pic (吡啶_2_甲酰)、Hip(N-苯甲酰基甘氨酰，马脲酰)或Ml (邻羟基苯甲酰，水杨酰)；X3 选自 β-Ala、Abu、Aca、Gly-Gly 或 des (缺失)；R2 选自 OH、NH2, Gol (H2NCH2CH2OH,甘氨醇)、NH (CH2) mCH3 并且 m 为 0 10 的整数、 NH(CH2)nOH并且η为0 10的整数。Tyr-Pro-Phe- β -Ala-NHEt1
Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHEt2
Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-Gol3
3-Hna-Pro-Ty-rβ -Ala-NHPr4
Hip-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr5
Fer-Pro-Phe (4_Ν02) -Aca-Go 16
Tyr-Pro-Phe (4-Ν02) -Aca-NHMe7
Fer-Pro-Phe- β -Ala-Gol8
Fer-Pro-Phe- β -Ala-NHPr9
Fer-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr10
Pic-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr11
Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe14
Ida-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe13
Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr14
Suc-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe15
Aca-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr16
Suc-Ser (Bzl)-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe17。
本发明还提供了酪脯肽的制备方法，所涉及的酪脯肽是通过化学合成的途径制备
的。其中有的是采用固相合成方式合成，有的产物也可由传统的溶液法合成。全部氨基酸原料均为Boc (叔丁氧羰酰基)保护形式。涉及的氨基酸原料为BOC-Tyr-0H、BOC-Pro-0H、 Boc-Phe-OH、Boc-Ser (Bzl) _0H、Boc-Phe (4-N02) _0H、Boc-Aca-OH、Boc- β -Ala-OH0 缩合试剂有Cl-HOBt (5-氯代-1-羟基苯并三唑)、HBTU (苯并三唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲鐺六氟磷酸盐)、DIC ( 二异丙基碳二亚胺)，其他试剂有NMM (N-甲基吗啉)，TEA (三乙胺)、TFA (三氟乙酸)、TESi (三乙基硅)。脱除Boc基的条件为50% TFA/CH2C12 (DCM)。氨解切除树脂试剂为 3O % MeNH2/Et0H,70% EtNH2/H20U00% PrNH2。本发明涉及的生物活性评价是以切除卵巢(OVX)的大鼠为OP动物模型，阳性对照药为阿伦磷酸钠(Alen)。酪脯肽的给药时限为切除卵巢后连续皮下注射12周。随后处死动物进行故形态学及动力学等指标的测定(详见实施例)。生物活性实验结果表明酪脯肽对OP患鼠的骨形态学各项指标，如BV/TV (骨小梁体积/全骨体积)、ΤΒ· Th (骨小梁宽度)、Tb. sp (骨小梁间隙)、Tb. N(骨小梁节点数)、0V/ BV(类骨质体积比)、0S/BS(类骨质表面比)，及骨动力学参数如sL. s/BS(四环素单标记长度与骨小梁周长比值)、dL. s/BS(四环素双标记长度与骨小梁周长的比值)，及骨矿化指标如MS/BS、MAR、MLT等均明显优于Alen组。其中多数指标均可反应骨重建的活跃情况，由此可证明本发明的酪脯肽对OP大鼠的骨重建激活发挥了重要作用。相比之下，阳性对照要 Alen没有任何激动骨重建的活性，此结果与双膦盐在临床上不能减少骨折，反而增加骨折率的不理想结果是一致的。本发明还提供了本发明化合物在制备与预防或治疗骨质疏松的药物组合物中的应用。在制备与肿瘤并发的骨疾病的药物中的应用。所述的与肿瘤并发的骨疾病选自高钙血症、骨疼痛、变形性骨炎或多发性骨髓瘤。在制备促进外科骨移植、创伤性骨折愈合的药物中的应用。所述的药物是和骨吸收抑制剂配合的续贯治疗药物。本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0. 1-95重量％。本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、 阴道、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括0/V型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、 粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、 颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种
微粒给药系统。为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、PH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；PH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、 氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0. 001-150mg/Kg体重，优选为0. l-100mg/Kg体重，更优选为 l-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。 当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。术语和简称
TPT酪脯肽；
Suc丁二酸单酰；
Ida亚氨基二乙酸单酰；
AbuY-氨基丁酰；
Aca6-氨基己酰；
Gly甘氨酰
Des缺失;
Tyr酪氨酰；
Phe苯丙氨酰；
Phe(4-N02)对硝基苯丙氨酰；
Trp色氨酰；
Ser(Bzl) :0_苄基丝氨酰；
Thr(Bzl) :0-苄基苏氨酰;
HO-Ph-CO 对羟基苯甲酰；
Fer3-甲氧基-4-羟基肉桂酰，又名阿
Hna:羟基萘甲酰；
Pic吡啶-2-甲酰；
Hip:N-苯甲酰基甘氨酰，又名马脲酰；
Sal邻羟基苯甲酰，又名水杨酰；
Gol=H2NCH2CH2OH,又名甘氨醇；
7CN 102532261 A0P:骨质疏松；0GP5 =H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OHBoc 叔丁氧羰酰基Cl-HOBt 5-氯代羟基苯并三唑；HBTU 苯并三唑-N，N，N，，N，-四甲基脲鐺六氟磷酸盐；DIC 二异丙基碳二亚胺；NMM :N-甲基吗啉；TEA 三乙胺；TFA:三氟乙酸；TESi 三乙基硅。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例1Tyr-Pro-Phe- β -Ala-NHEt (1)的合成①Boc- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备称取氯甲基树脂(取代度lmmol/g，交联度1%，粒度100-200目)重20g(20mmol)、 Boc-^-Ala-OH 11. 34g(60mmol)、K2CO3 8. ^g (60mmol)及 KI 0. 2g (0. 12mmol)，共同混合于300mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中。经60°C旋转反应24h后，滤除上清液。树脂依次用下列溶剂洗滤60°C DMF (X 3 次)、50% EtOH(乙醇)/H2O (X 3 次)、DMF (X 5 次)、60°C 95% K0H(X5次)、K2O(乙醚X2次)之后抽干。将树脂至于红外灯下，50°C干燥至恒重。称量得Boc- β -Ala-树脂23g，增重3. Og (理论AW = 3. 05g)，此步产率为98 %。②脱Boc基，中间体β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制备将上述的Boc-^-Ala-树脂在可密封的反应管内与230ml 50 % TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混摇10分钟，抽除酸液，再加入230mL 50% TFA/DCM，再摇动30分钟。 收集酸解液(用于下回的第一次脱Boc反应)。树脂依次经下列溶剂洗滤DCMX5、95% EtOHX 3、10% TEA/EtOAc(三乙胺 / 乙酸乙酯)X 2、DMFX 3、EtOHX 3、Et2OX 2、抽干备用。③二肽树脂Wie- β -Ala-0CH2-聚苯乙烯的制备羧基组分的活化取Boc-Phe-OH 1. 5g (6mmol)、Cl-HOBt 1. 02g (6mmol)、HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 67mL (6mmol)。混合反应三分钟后与2. 3g(2mmol) β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂混于肽反应管中。室温下摇动3h，滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤DMFX3、K0HX2、DMFX3、K0HX5、K20X2。取树脂样品 1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明β -Ala 上的氨基已被酰化完全，即Boc-Phe-OH已完全缩合上。经脱Boc基处理(与步骤②相同)， 得到二肽I^he-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体2. 59g。④三肽树脂Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备 以Boc-Pro-OH为羧基组分，按照上述步骤③的缩合及步骤②的脱Boc保护条件处理，得到三肽Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂2. 78g。
⑤四肽树脂Tyr-Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制备以Boc-Tyr-OH为羧基组分，按照上述的缩合及脱Boc基的条件处理，得到四肽树脂中间体3. 09g。⑥氨解切除树脂，产物1的制备取四肽树脂中间体Tyr-Pro-Phe-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯 1. 5g(Immol)与 8ml 含 70% H2NEt的水溶液及8ml THF (四氢呋喃)共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 30h,收集上清液。残余树脂再用95% KOH洗滤两次。合并滤液，并于50°C下减压蒸除溶剂。 基本除净溶剂后，加入5ml甲苯及IOml 95% Κ0Η，再减压蒸除微量水分。得到近白色的残渣，经无水K2O充分研碎，过滤收集粉状产物48aiig (理论值为523mg)，总收率为92. 1%， ESI-MS 分析 524. 2060 (M+H)。实施例2Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHEt (2)及 Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-Gol (3)的合成①按照实施例1中步骤①和②的条件，制备β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体2. 5g。②二肽树脂Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制备羧基组分的活化取Boc-Tyr-OH 1. 686g(6mmol)、Cl-HOBt 1. 02g(6mmol)、HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 67mL (6mmol)。混合反应三分钟后与2. 3g^nm0l) β-Ala-OCHdXi脂混于肽反应管中。室温下摇动池，滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤DMFX3、K0HX2、DMFX3、K0HX5Jt20X2。取树脂样品1 ^ig于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明β-Ala上的氨基已被酰化完全，即Boc-Tyr-OH已完全缩合上。经脱Boc基处理(与步骤②相同)，得到二肽 Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体2. 62g。③三肽树脂ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备以Boc-Pro-OH为羧基组分，按照上述步骤②的缩合及步骤②的脱Boc保护条件处理，得到三肽ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂2. 81g。④四肽树脂Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备以Boc-Tyr-OH为羧基组分，按照上述步骤②中的缩合脱Boc基的条件处理，得到四肽树脂中间体3. 13g。⑤氨解切除树脂，产物2的制备取四肽树脂中间体Tyr-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯 1. 6g(Immol)与 8ml 含 70% H2NEt的水溶液及8ml THF共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应30h，收集上清液。残余树脂再用95% KOH洗滤两次。合并滤液，并于50°C下减压蒸除溶剂。基本除净溶剂后，加入5ml甲苯及IOml 95 % Κ0Η，再减压蒸除微量水分。得到近白色的残渣，经无水肚20充分研碎，过滤收集得到产物2的粉末479mg(理论539mg)，总收率88. 8%,ESI-MS 分析 MO. 2113 (M+H)。取另一份步骤④得到的四肽树脂(1. 56g)与3ml的乙醇胺(50mmol)及15ml 95% KOH混合。室温摇动反应50h，收集滤液。残余树脂经95% KOH混合。室温摇动反应50h， 收集滤液。残余树脂经95% KOH洗滤两次，合并滤液。50°C下减压蒸除Κ0Η，得到粘稠的浅黄色残留液。加入200ml蒸馏水，放置汕。滤集白色沉淀。再用KOAc-nBuOHd 1) 200ml 混合，于分页漏斗中萃取，除去水层，有机层用水洗两次后，加无水硫酸钠干燥，浓缩蒸干，用K2O研磨，得粉状产物3重453mg (理论555mg)，总收率81. 6 %，ESI-MS分析 556.2301(M+H)。实施例3I-Hna-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (4)及 l-Hna-Pro-Tyr- β -Ala-Gol (5)的合成①按照实施例2中步骤① ③的条件，制备ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体 2. 8g。②四肽树脂I-Hna-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制备羧基组分的活化取I-Hna 1. 128g(6mmol)、Cl-HOBt 1. 02g(6mmol)、HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 89mL (8mmol)。混合反应三分钟后与2. 8g (2mmol) Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂混于肽反应管中。室温下摇动3h， 滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤DMFX3、EtOHX2, DMFX3、EtOHX5, Et2OX2。取树脂样品1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明Tyr上的氨基已被酰化完全，即Boc-Tyr-OH已完全缩合上。经脱Boc基处理(与步骤② 相同)，得到四肽I-Hna-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体2. 9g。③氨解切除树脂，产物4和5的制备取该中间体(1. 45g，lmmol)，与5ml丙胺及8ml THF共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应30h，收集上清液。残余树脂再用95% KOH洗滤两次。合并滤液，并于 50°C下减压蒸除溶剂。基本除净溶剂后，加入5ml甲苯及IOml 95% Κ0Η，再减压蒸除微量水分。得到淡黄色的残渣，经无水肚20充分研碎，过滤收集得到产物4的粉末510mg (理论重 560mg)，总收率为 91 %，ESI-MS 分析 556. 3850 (M+H)。取另一份步骤②得到的四肽树脂(1. 45g)与3ml的乙醇胺(50mmol)及15ml 95% KOH混合。室温摇动反应50h，收集滤液。残余树脂经95% KOH混合。室温摇动反应50h， 收集滤液。残余树脂经95% KOH洗滤两次，合并滤液。50°C下减压蒸除Κ0Η，得到粘稠的浅黄色残留液。加入200ml蒸馏水，放置汕。滤集白色沉淀。再用KOAc-nBuOHd 1) 200ml 混合，于分页漏斗中萃取，除去水层，有机层用水洗两次后，加无水硫酸钠干燥，浓缩蒸干， 用K2O研磨，得到产物5的粉末478mg(理论重56ang)，总收率为85. 0%，ESI-MS分析 563. 2131 (M+H)。实施例4Fer-Pro-Phe (4-N02) -Aca-Gol (6)及 Tyr—Pro—Phe (4-N02) -Aca-NHMe (7)的合成①Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备称取氯甲基树脂(取代度lmmol/g，交联度1%，粒度100-200目)重IOg (IOmmol)、 Boc-Aca-OH 6. 9g(30mmol)、K2C034. 14g(30mmol)及 KI 0. Ig (0. 06mmol)，共同混合于 150mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中。经60°C旋转反应24h后，滤除上清液。树脂依次用下列溶剂洗滤60°C DMF(X3 次)、50% EtOH (乙醇)/H20(X3 次)、DMF(X5 次)、60°C 95% K0H(X5次)、K2O(乙醚X2次)之后抽干。将树脂至于红外灯下，50°C干燥至恒重。将上述的Boc-Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂在可密封的反应管内与150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混摇10分钟，抽除酸液，再加入150mL 50% TFA/DCM,再摇动30分钟。 收集酸解液(用于下回的第一次脱Boc反应)。树脂依次经下列溶剂洗滤DCMX5、95% EtOHX3UO% TEA/Et0Ac(三乙胺 / 乙酸乙酯)X2、DMFX3、EtOHX3、K2OX2、抽干称量得Boc-Aca-0CH2-聚苯乙烯树脂10. 93g，增重0. 93g(理论Aff = O. 945g)，此步产率为98%。②二肽树脂Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯的制备羧基组分的活化取Boc-Phe (4-N02)-OH 1. 86g(6mmol)、Cl-HOBtl. 02g(6mmol)、 HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmLDMF中，全溶解后加入NMM 0. 67mL (6mmol)。混合反应三分钟后与2. 2g^nmOl)Aca-0CHd〗i脂混于肽反应管中。室温下摇动池，滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤DMFX3、K0HX2、DMFX3、K0HX5Jt20X2。取树脂样品1 ^ig于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明Aca上的氨基已被酰化完全，即Boc-Phe-OH已完全缩合上。将上述的树脂在可密封的反应管内与150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混摇10分钟，抽除酸液，再加入150mL 50% TFA/DCM，再摇动30分钟。收集酸解液(用于下回的第一次脱Boc反应)。树脂依次经下列溶剂洗滤 DCMX 5、95% EtOHX 3、10% TEA/EtOAc (三乙胺 / 乙酸乙酯)X 2,DMFX 3,EtOHX 3,Et2OX 2, 抽干称量得到二肽Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体2. 79g。③三肽树脂Pro-Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备以Boc-Pro-OH为羧基组分，按照上述步骤③的缩合及步骤②的脱Boc保护条件处理，得到三肽Pro-Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂3. Olgo④四肽树脂!^r-Pr0-Phe-Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备取上述步骤③的三肽树脂1. 5g，以阿魏酸为羧基组分，按照上述步骤②的缩合条件处理，得到四肽树脂中间体1. 55g。⑤四肽树脂Tyr-Pro-Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂的制备取上述步骤④的三肽树脂1. 5g，以Boc-Tyr为羧基组分，按照上述步骤②的缩合及脱保护条件处理，得到四肽树脂中间体1. 54g⑥氨解切除树脂，产物6和7的制备取步骤④所得四肽树脂中间体!^r-Pr0-Phe-Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂 1. 55g(0. 94mmol)与3ml的乙醇胺(50mmol)及15ml 95% EtOH混合。室温摇动反应50h， 收集滤液。残余树脂经95% KOH混合。室温摇动反应50h，收集滤液。残余树脂经95% KOH洗滤两次，合并滤液。50°C下减压蒸除Κ0Η，得到粘稠的浅黄色残留液。加入200ml蒸馏水，放置池。滤集白色沉淀。再用KOAc-nBuOHd 1) 200ml混合，于分页漏斗中萃取， 除去水层，有机层用水洗两次后，加无水硫酸钠干燥，浓缩蒸干，用肚20研磨，最后得到产物 6 重 559mg(理论值 639mg)，总收率 87. 5%, ESI-MS 分析 640. 2985 (M+H)。另取步骤④所得四肽树脂中间体Tyr-Pro-Phe G-NO2)-Aca-OCH2-聚苯乙烯树脂 1. 54g(0. 94mmol)与15ml含33% H2^e的水溶液混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应30h，收集上清液。残余树脂再用95% KOH洗滤两次。合并滤液，并于50°C下减压蒸除溶剂。基本除净溶剂后，加入5ml甲苯及IOml 95% Κ0Η，再减压蒸除微量水分。得到淡黄色的残渣，经无水K2O充分研碎，过滤收集得到粉状产物7重497mg (理论值596mg)，总收率 83. 5 %，ESI-MS 分析 597. 2984 (M+H)。实施例5Fer-Pro-Phe- β -Ala-Gol (8)及 Fer-Pro-Phe- β -Ala-NHPr (9)的合成①按照实施例1中步骤① ④的条件，制备Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯三肽中间体2. 5g。
②取上述三肽树脂2. 5g，以阿魏酸为羧基组分，按照上述实施例1中步骤③的缩合条件处理，得到四肽Fer-Pro-Phe-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体2. 62g。③按照实施例3中步骤③的方法，得到目标产物，结果为产物8重478mg，收率 86. 6 %，ESI-MS 分析553. 2721 (M+H)。产物 9 重 508mg,收率 92. 5 %，ESI-MS 分析 551. 2668 (M+H).实施例6Fer-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (10)及 Pic-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (11)的合成①按照实施例2中步骤① ③的条件，制备ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体 2. 8g。②取1. 4g上述步骤①的三肽中间体，按照实施例4中步骤④的条件，以阿魏酸作为羧基组分制备Fer-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体1. 45g。③取1.4g上述步骤①的三肽中间体，按照实施例4中步骤④的条件，以吡啶-2-甲酸作为羧基组分制备Pic-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体1. 4g。④氨解切除树脂，产物10和11的制备按照实施例3中步骤③的方法，以丙胺氨解得到目标产物的结果为产物10重 519mg，总收率91. 8%,ESI-MS分析567. 301 (M+H)。产物 11 重488mg，总收率85. 9%,ESI-MS 分析 569. 2983 (M+H).实施例7Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (12)及 Ida-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (13)的合成①按照实施例2中步骤① ③的条件，制备ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体 2. 8g。②取上述步骤①三肽树脂中间体1.4g，按照实施例2中步骤④的条件，制备 Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体 1. 56go③取上述步骤①三肽树脂中间体1.4g，按照实施例1中步骤②的条件，制备 Phe-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体 1. 54go④将上述步骤②和③的三肽树脂中间体分别置于两个固相反应管中。另取 Boc-Ida-OH 1. 4g(6mmol)、DIC 0. 76g(6mmol)溶于 15mLTHF 中，混合均勻后于冰水浴中搅拌反应4小时后，取一半体积的反应溶液加入到步骤②所得树脂的反应管中，另一半体积溶液加入到步骤③所得的树脂中间体中，混合均勻后向两个反应管中均加入NMMO. IlmL(Immol)和0. 3ml吡啶，室温下摇动混合反应他。。取树脂样品 1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106 °C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明 Tyr或Phe上的氨基已被酰化完全。经脱Boc基处理(与实施例1中步骤②相同)， 得到分别得到四肽Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体1. 55g和 Ida-Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体 1. 53go⑤按照实施例4中步骤⑥的甲胺解方法切除树脂，得到目标产物的结果为产物 12 重 576mg，总收率90. 0%，ESI-MS 分析641. 2640 (M+H)。产物 13 重578mg，总收率92. 6%, ESI-MS 分析 625. 2156 (M+H).实施例8
12
Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (14)及 Suc-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (15)的合成①按照实施例2中步骤① ③的条件，制备ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体 2. 8g。②取上述步骤①四肽树脂中间体1. 4g，按照实施例2中步骤④的缩合及脱保护条件，制备Tyr-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体1. 56g。③取上述步骤①四肽树脂中间体1. 4g，按照实施例2中步骤③的缩合及脱保护条件，制备Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体1. 54g④将上述步骤②和③的四肽树脂中间体分别置于两个固相反应管中。另取丁二酐1.4g(6mm0l)溶于15mL THF中，取一半体积的溶液加入到步骤②所得树脂的反应管中，另一半体积溶液加入到步骤③所得的树脂中间体中，混合均勻后向两个反应管中加入 NMMO. IlmL(Immol)和0. 3ml吡啶，室温下摇动混合反应乩。取树脂样品1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明Tyr或Phe上的氨基已被酰化完全。经洗涤和干燥处理，分别得到五肽Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体1. 55g和Suc-Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体1. 53g。⑤实施例4中步骤⑥的甲胺解方法，得到目标产物，结果为产物14重59aiig， 收率 90. 7%, ESI-MS 分析 654. 3057 (M+H)。产物 15 重 558mg,收率 91. 6%, ESI-MS 分析 610.2298(M+H).实施例9化合物Aca-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (16)的合成①按照实施例2中步骤① ③的条件，制备ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体1.4g。②取上述步骤①四肽树脂中间体1. 4g，按照实施例2中步骤③的缩合及脱保护条件，制备四肽Wie-Pro-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中间体1. 54g③五肽Aca-Phe-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体的制备羧基组分的活化取Boc-Aca-OH 0. 693g (3mmol)、Cl-HOBt 0. 51g (3mmol)、HBTU 1. 138g(3mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 44mL (4mmol)。混合反应三分钟后与1. 54g (Immol)四肽Phe-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体混于肽反应管中。室温下摇动池，滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤DMFX3、K0HX2、 DMFX 3、EtOHX 5、Et2OX 2。取树脂样品1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C 反应5分钟，树脂未见变蓝。表明Phe上的氨基已被酰化完全，即Boc-Aca-OH已完全缩合上。将上述的树脂在可密封的反应管内与150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混摇10分钟，抽除酸液，再加入150mL 50 % TFA/DCM，再摇动30分钟。收集酸解液 (用于下回的第一次脱Boc反应)。树脂依次经下列溶剂洗滤DCMX5、95% KOHX3、 10% TEA/EtOAc(三乙胺/乙酸乙酯)X2、DMFX3、EtOHX3、Et2OX2、抽干称量得到五月太 Aca-Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体 1. 65g。④按照实施例3中步骤③的丙胺解方法，得到产物16重561mg，总收率86. 3%, ESI-MS 分析 651. 4781 (M+H)。实施例10
化合物Suc-Ser (Bzl) -Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (17)的合成①按照实施例2中步骤① ③的条件，制备ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体1.4g。②四肽^r(Bzl)-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体的制备羧基组分的活化取Boc-Ser(Bzl)-OH 0. 885g(3mmol)、Cl-HOBtO. 51g(3mmol)、 HBTU 1. 138g(3mmol)，共同溶于 IOmLDMF 中，全溶解后加入 NMM 0. 44mL(4mmol)。混合反应三分钟后与1. 54g(Immol)四肽Phe-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体混于肽反应管中。室温下摇动池，滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤DMFX3、KOHX2、 DMFX 3、EtOHX 5、Et2OX 2。取树脂样品1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C 反应5分钟，树脂未见变蓝。表明Phe上的氨基已被酰化完全，即Boc-Aca-OH已完全缩合上。将上述的树脂在可密封的反应管内与150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混摇10分钟，抽除酸液，再加入150mL 50 % TFA/DCM，再摇动30分钟。收集酸解液 (用于下回的第一次脱Boc反应)。树脂依次经下列溶剂洗滤DCMX5、95% KOHX3、 10% TEA/EtOAc(三乙胺/乙酸乙酯)X2、DMFX3、EtOHX3、Et2OX2、抽干称量得到五月太 Ser (Bzl) -Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体 1. 7g。③取丁二酐0. 7g(3mmol)溶于15mL THF中，加入到步骤②所得的树脂中间体中， 混合均勻后向两个反应管中加入NMM 0. IlmL(Immol)和0. 3ml吡啶，室温下摇动混合反应他。取树脂样品1 2mg于小试管内，加入Kaiser试剂加热106°C反应5分钟，树脂未见变蓝。表明Ser上的氨基已被酰化完全。经洗涤和干燥处理，得到Suder(Bzl)-Pro-Tyr -β-Ala-OCH2-聚苯乙烯树脂中间体1. 7g。④按照实施例4中步骤⑥的甲胺解方法，得到目标产物17重58aiig，总收率 91. 1%, ESI-MS 分析 640. 2591 (M+H)。药理实验实验例1生物活性试验及结果(1)动物模型以4月龄雌性SD大鼠为实验动物，适应性饲养2周后，切除卵巢(OVX)，作为造成OP的模型。(2)分组情况，以下各组均为8只大鼠OVX组-切除卵巢，不给治疗剂SHAM组-假手术组，不给治疗剂Alen组-造模后每天给阿伦磷酸钠100 μ g/kg体重l/3dAlen组-每个骨重建周期(15d)的第二个五天给予Alen。另十天不给药，即缓冲液5d/Alen5d/空白5dTPT三个组-造模后给一种TPT 5d，第6 10天给Alen 5d，第11 15天不给任何治疗剂。(3)治疗剂的给药方式与剂量Alen-皮下注射，5 μ g/kg 体重/dTPT-10nmol/100g 体重/d
(4)药效评价指标BV/TV(% )骨小梁体积/全骨体积之比，值越高表明骨量越多Tb. Th(Um)骨小梁宽度，值越高疗效越好Tb. SP ( μ m)骨小梁间隙，值越小疗效越好
Tb. N每视野中的骨小梁节点，越多越好0V/BV(% )相对类骨质体积比，骨重建活跃指标，越高越有效0S/BS (% )相对类骨质表面比sLS/BS(% )四环素单标记长度与骨小梁周长的比值反映骨重建活性，表明骨小梁表面的激活频率，越高越好dLS/BS(% )四环素双标记长度与骨小梁周长的比值，意义同sLS/BSMS/BS(% )骨矿化表面，单位骨表面上的全部双标记面加上半数单标记面的总和，越高越好MAR ( μ m/d)矿化沉积率，越高越好MLT (d)矿化延迟时间，越短越好BFR(T) (μ m/d)组织水平的骨形成速率，数值越高越好(5)骨形态学及骨力学参数测定结果表1.骨形态学参数
权利要求
1.如通式⑴所示的酪脯肽化合物
2.根据权利要求1的化合物，其特征在于，所述的化合物选自如下群组 Tyr-Pro-Phe- β -Ala-NHEtTyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHEt Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-Gol 3-Hna-Pro-Tyr-β -Ala-NHPr Hip-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Fer-Pro-Phe (4_Ν02) -Aca-Go 1 Tyr-Pro-Phe (4-Ν02) -Aca-NHMe Fer-Pro-Phe- β -Ala-Gol Fer-Pro-Phe- β -Ala-NHPr Fer-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Pic-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe Ida-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Suc-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe Aca-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Suc-Ser(Bzl)-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe。
3.—种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-2中任一项的化合物和制药学上可接受的载体。
4.权利要求1-2中任一项的化合物在制备与预防或治疗骨质疏松的药物中的应用。
5.权利要求1-2中任一项的化合物在制备与肿瘤并发的骨疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述的与肿瘤并发的骨疾病选自高钙血症、骨疼痛、变形性骨炎或多发性骨髓瘤。
7.权利要求1-2中任一项的化合物在制备促进外科骨移植、创伤性骨折愈合的药物中的应用。
8.根据权利要求4-7中任一项的应用，其特征在于，所述的药物是和骨吸收抑制剂配合的续贯治疗药物。
全文摘要
本发明公开了一类骨重建激活剂-酪脯肽及其药物组合物和用途。具体而言，本发明对成骨生长肽C端五肽(OGP5)的结构改造而发现的一类具有激活骨重建活性的通式(I)所示的酪脯肽化合物，涉及新肽的结构设计、合成方法、与抑制骨吸收药物双膦盐配合的ADFR治疗实验性大鼠的骨质疏松(OP)。本发明的OGP5改构肽可以明显激活OP患鼠的骨重建，可望发展成一种改善骨质量、治疗OP、股骨头坏死及骨创伤的理想药物。
文档编号A61K38/07GK102532261SQ201010611949
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者卢飚, 杨潇骁, 林浩, 王德心, 邱明才, 韩香 申请人:中国医学科学院药物研究所