专利名称：一种蛋清抗氧化肽及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋清抗氧化肽及其制备方法。
背景技术：
中国是世界上最大蛋品生产和消费国，2005年全国城镇居民家庭年消费鲜鸡蛋 11. 14公斤/人，大大超过世界平均水平。鸡蛋不仅营养丰富，且含大量具抗菌、抗病毒、抗癌症、调节免疫等多种生理活性物质。如溶菌酶、抗生物素蛋白、卵铁传递蛋白、特异性免疫球蛋白(IgY)和卵磷脂等备受关注，对人类健康起着非常重要的作用。有些已产业化并在医学、营养保健和功能食品等方面具有广泛的应用前景。随着禽蛋产量大幅度增长，蛋品加工深度与技术含量不断提高。到目前为止，主要有三种蛋清深加工方法，即传统理化加工法、微生物发酵法以及蛋白酶体外酶解法。鸡蛋清经蛋白酶适宜酶解后，除可在一定程度上改善其功能特性和降低过敏原性蛋白的抗原性外，还可产生一些具有特殊生物学活性的小肽。国内外学者关于蛋清蛋白酶解产物抗肿瘤、 抗高血压、免疫调节等研究取得显著成果。而对蛋清酶解产物抗氧化性的研究相对较少，更缺乏系统性。
发明内容
本发明以蛋清粉为原料，采用现代生物技术，以鸡蛋清蛋白为原料，研究鸡蛋清酶解产物的抗氧化性，采用超滤、离子交换和凝胶过滤等分离手段分离制备出了具抗氧化活性的生物活性肽-蛋清抗氧化肽，并对其抗氧化活性进行综合评价。本发明的一方面在于，蛋清抗氧化肽的制备方法的技术方案包括如下步骤①蛋清酶解液制备将蛋清粉溶于磷酸盐缓冲液中配制成蛋清液，蛋清液热变性后冷却；再按 10000U/g蛋白的比例向上述蛋清液中加入碱性蛋白酶，并用磷酸盐缓冲液稀释上述蛋清液浓度至8 12mg/mL,置于45 55°C反应4 6h ;再于沸水浴中灭酶,离心取上清液，即为蛋清酶解液；其中，上述磷酸盐缓冲液为O. 05mol/L、pH8. O ；②超滤超滤分离步骤①获得的蛋清酶解液，收集分子量< 3k Da的组分，浓缩；③DEAE-52离子柱层析由步骤②获得的产物，经DEAE-52离子柱层析，依次以O. 00,0. 02,0. 05,0. 10、 O. 20mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，收集以O. 02mol/L NaCl溶液作为洗脱液的蛋白峰，浓缩；④Sephadex G-25凝胶柱层析步骤③所得的产物，经S印hadex G_25凝胶柱层析，洗脱液为蒸馏水，根据280nm 处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，其中平均分子量为273Da的蛋白峰为蛋清抗氧化肽。具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的蛋清液，是由蛋清粉溶于O. 05mol/L、 pH8. O磷酸盐缓冲液中配制成浓度为80 150mg/mL。具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的热变性的条件为，于80 90°C变性 25 35min。具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的沸水灭酶的时间为5 15min。具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的离心条件为3500 4500r/min离心 10 20min。具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的冷却温度为45 55°C。具体的，在上述的制备方法中，步骤②所述的超滤为在O. 3MPa条件下，用分子量为3kDa超滤膜超滤。具体的，在上述的制备方法中，步骤②所述的浓缩为真空浓缩至浓度为8 12mg/mL。具体的，在上述的制备方法中，步骤③所述的浓缩为真空浓缩至浓度为3 6mg/
mLo本发明的另外一方面在于，利用上述的制备方法制备得到的蛋清抗氧化肽。本发明突出效果为采用酶解、超滤、离子交换和凝胶过滤等生物技术手段，制备高活性的蛋清抗氧化肽，工艺技术路线合理。将蛋清粉水解为多肽物质，研究其抗氧化性， 并经过超滤、离子交换和凝胶过滤分离手段得到较纯的具抗氧化活性的多肽，同时降低蛋白的抗原性，改善其功能特性，而且更利于吸收。该产品还可抑制和清除自由基，调整和改善生理功能，可应用于研制预防和治疗慢性疾病药物。为提高蛋清蛋白附加值、鸡蛋深加工及应用开辟新途径，市场前景广阔。
图1DEAE-52离子交换层析分离HEW-2洗脱图谱；图2DEAE-52分离各组分的超氧阴离子清除能力；图3S印hadex G-25凝胶色谱分离HEW-2-2洗脱图谱；图4Sephadex G-25分离各组分的超氧阴离子清除能力；图5蛋清抗氧化肽分离纯化薄层层析图，其中，I-未纯化蛋清酶解液HEW ;2_经 3kDa超滤膜分离后抗氧化组分HEW-2 ;3_经DEAE-52离子交换层析后抗氧化组分HEW-2-2 ； 4-经S印hadex G-25凝胶过滤层析后抗氧化组分HEW-2-2-3。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施例中所涉及的各试剂，如无特殊说明，均属于常规试剂，可从商业途径获得。O. 05mol/L ρΗ8· O磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液)50. OmL
O.2mol/L KH2PO4 溶液加入 46. 80mL O. 2mol/L NaOH，定容至 200mL。
蛋清粉、碱性蛋白酶蛋清粉购自大连韩伟食品有限公司，碱性蛋白酶购自无锡酶制剂厂；实施例II.蛋清酶解液制备蛋清粉和碱性蛋白酶分别溶于磷酸盐缓冲液(O. 05mol/L, pH8. O)中备用，初始浓度均为100mg/mL。蛋清液85°C，变性30min，冷至50°C，分别测定蛋清液的蛋白含量及碱性蛋白酶的酶活性，然后按照10000U/g蛋白的比例加入酶液，用上述磷酸盐缓冲液 (0. 05mol/L, pH8. 0)控制蛋清液终浓度为10mg/mL，50°C反应5h，沸水灭酶10min，4000r/ min离心15min,取上清液，即为蛋清酶解液,用HEW (Hydrolysates from Egg White)表示。2.超滤用3kDa超滤膜分离蛋清酶解液，在0. 3MPa下将蛋清酶解液分离成> 3kDa的截留液HEW-I和< 3kDa的透过液HEW-2，测定两部分抗氧化性，浓缩备用。超滤组分抗氧化性测定。用3kDa超滤膜将HEW分成HEW-I和HEW-2两部分。在5mg/ mL相同浓度下，HEW、HEW-1和HEW-2的超氧阴离子清除率分别为12. 75%,8. 41%U5. 94%。 由此看出，HEW-2比HEW具更强的超氧阴离子清除能力。文献也表明，分子量< 3kDa多肽的抗氧化性更为理想。超滤分离出具较强抗氧化性组分HEW-2，经过真空浓缩至10mg/mL，再经DEAE-52 离子柱层析分离。3. DEAE-52离子交换层析超滤分离出强抗氧化活性的部分经DEAE-52离子交换层析(40X 200mm)，洗脱液依次为0. 00,0. 02,0. 05,0. 10,0. 20mol/L NaCl水溶液，进行梯度洗脱。上样浓度10mg/mL, 上样体积5mL，洗脱速度80mL/h，部分收集器每管收集4mL，检测收集液280nm处吸光度和抗氧化性，判断抗氧化肽分离效果，将各组分合并浓缩，备用。由图I可知，HEW-2经DEAE-52离子交换层析分离，不同盐浓度洗脱液梯度洗脱得到5个蛋白峰，分别为HEW-2-1 (蒸馏水洗脱峰)、HEW-2-2 (0. 02mol/mL NaCl洗脱峰)、HEW-2-3(0. 05mol/mLNaCl 洗脱峰)、HEff-2-4(0. 10mol/mL NaCl 洗脱峰)和 HEW-2-5 (0. 20mol/mLNaCl 洗脱峰)。各分离组分对超氧阴离子的清除率如图2所示，在0. 5mg/mL浓度时，HEW-2-1无清除活性，HEW-2-2清除率为2. 08%, HEff-2-3清除率为I. 19%, HEff-2-4清除率为0. 30%, HEW-2-5清除率为0. 60%。可见，组分HEW-2-2对超氧阴离子清除能力最强。重复上述步骤,制备大量HEW-2-2组分,真空浓缩至5mg/mL,再经Sephadex G-25 凝胶色谱分离。4. Sephadex G-25 凝胶色谱DEAE-52离子交换层析分离得具较强抗氧化性组分经Sephadex G_25凝胶色谱柱 (13 X 440mm)进一步分离，洗脱液为蒸馏水，组分HEW-2-2的上样浓度5mg/mL，上样体积为 ImL,洗脱速度40mL/h,部分收集器每管收集ImL,检测收集液在280nm处的吸光值和抗氧化性来判断抗氧化肽分离效果，将各组分合并浓缩，备用。由图3可知,HEW-2-2经Sephadex G_25凝胶层析分离获得3个组分,根据凝胶层析分离原理，先流出的蛋白峰比后流出的蛋白峰分子量大，因此三个蛋白峰平均分子量由大到小的顺序依次为HEW-2-2-l > HEff-2-2-2 > HEW-2-2-3。各组分对超氧阴离子的清除率如图4所示，在O. 5mg/mL蛋白浓度下，HEW-2-2-1的清除率为O. 59 %, HEff-2-2-2的清除率为I. 20%,HEff-2-2-3清除率最高，达到2. 41 %，是HEW-2-2-1的4. I倍。从峰面积上看，HEW-2-2-3的含量也最多。可见，经Sephadex G-25凝胶色谱分离能得到活性较强的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3。由此可见，分子量< 3kDa的蛋清酶解多肽，经逐步分离得到抗氧化性较强的多肽，其分子量相对较小。5.薄层层析鉴定鸡蛋清抗氧化肽纯度薄层层析时用硅胶板作支持物，正丁醇冰醋酸水(3 : I : I)作展开剂，其中加入O. 4%茚三酮。层析后在85°C显色15min。由薄层层析图5可看出，未经纯化的鸡蛋清酶解液是各种肽和氨基酸的混合物， 各组分别迁移率不同，故经染色剂染色后连成一片(图5中的I);经超滤分离后，从薄层层析结果(图5中的2)可以看出减少了很多条带，说明已经除去大量杂蛋白j5DEAE-52纤维素离子交换层析分离得到的强抗氧化组分HEW-2-2，薄层层析染色后呈现3个点(图5中的3),初步确定其由3个组分组成；最后经Sephadex G_25凝胶色谱分离出蛋清抗氧化肽 HEW-2-2-3，在薄层层析中呈现单一点(图5中的4)，说明蛋清抗氧化肽已基本上得到纯化， 且通过凝胶色谱估测其相对分子量约为273Da。由表I所示鸡蛋清酶解液经过逐步分离纯化，对超氧阴离子IC5tl由33.41mg/ mL降低到5. 63mg/mL，最终纯化倍数达到5. 63，分离得到薄层层析纯度的蛋清抗氧化肽 HEW-2-2-3，其对超氧阴离子IC5tl为5. 63mg/mL，蛋白回收率为13. 42%。表I鸡蛋清抗氧化肽的分离纯化
权利要求
1.一种蛋清抗氧化肽的制备方法，其特征在于其方法包括①蛋清酶解液制备将蛋清粉溶于磷酸盐缓冲液中配制成蛋清液，蛋清液热变性后冷却；再按ιοοοου/g蛋白的比例向上述蛋清液中加入碱性蛋白酶，并用磷酸盐缓冲液稀释上述蛋清液浓度至8 12mg/mL,置于45 55°C反应4 6h ;再于沸水浴中灭酶,离心取上清液，即为蛋清酶解液；其中，上述磷酸盐缓冲液为O. 05mol/L、pH8· O ；②超滤超滤分离步骤①获得的蛋清酶解液，收集分子量< 3k Da的组分，浓缩；③DEAE-52尚子柱层析由步骤②获得的产物，经DEAE-52离子柱层析，依次以O. 00,0. 02,0. 05,0. 10、O.20mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，收集以O. 02mol/L NaCl溶液作为洗脱液的蛋白峰，浓缩；④SephadexG-25凝胶柱层析步骤③所得的产物，经S印hadex G-25凝胶柱层析，洗脱液为蒸馏水，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，其中平均分子量为273Da的蛋白峰为蛋清抗氧化肽。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的蛋清液，由蛋清粉溶于O.05mol/L、pH8. O磷酸盐缓冲液中配制成浓度为80 150mg/mL。
3.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的热变性的条件为，于 80 90°C变性 25 35min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的沸水灭酶的时间为5 15min。
5.根据权利要求I或4所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的离心条件为3500 4500r/min 离心 10 20min。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的冷却温度为45 55°C。
7.根据权利要求I或6所述的制备方法，其特征在于步骤②所述的超滤为在O.3MPa 条件下，用分子量为3kDa超滤膜超滤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤②所述的浓缩为真空浓缩至浓度为8 12mg/mL。
9.根据权利要求I或8所述的制备方法，其特征在于步骤③所述的浓缩为真空浓缩至浓度为3 6mg/mL。
10.如权利要求I所述的制备方法制备出的蛋清抗氧化肽。
全文摘要
本发明公开一种蛋清抗氧化肽的制作方法。主要以鸡蛋蛋清粉为原料，经热变性、酶解、超滤、离子交换、凝胶过滤、真空浓缩干燥等工艺分离纯化得到高活性的蛋清抗氧化肽。本方法用碱性蛋白酶将鸡蛋清酶解，分离得到低分子量、具高抗氧化活性的蛋清酶解肽，除降低蛋白的抗原性，改善其功能特性，且更利于吸收外，该产品还可抑制和清除自由基，调整和改善生理功能，可应用于研制预防和治疗慢性疾病药物。为提高蛋清蛋白附加值、鸡蛋深加工及应用开辟新途径，市场开发前景广阔。
文档编号C07K1/34GK102586376SQ201210045000
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者吴巧丽, 姜淑娟, 孙洋, 牟光庆, 王瑞雪, 钱方 申请人:大连工业大学